CN103875604B - 一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法。本发明提供了包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节pH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液及筛选方法能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
Description
本申请要求于2012年12月19日提交中国专利局、申请号为201210554851.1、发明名称为“一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法。
背景技术
冬虫夏草是中国的一种名贵中药材，与人参、鹿茸一起列为中国三大补药。早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
冬虫夏草是一种特殊的虫和真菌共生的生物体，是冬虫夏草真菌（中国被毛孢）的菌丝体通过各种方式感染蝙蝠蛾（鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫）的幼虫，以其体内的有机物质作为营养能量来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成子座伸出寄主外壳，从而形成的一种特殊的虫菌共生的生物体。
冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500～5200m局部高寒山区草甸地带，天然资源十分有限，近年来采挖过渡造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。
人工栽培冬虫夏草，通过冬虫夏草菌（中国被毛孢）侵染寄主昆虫（蝙蝠蛾幼虫），进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。其中，寄主昆虫为蝙蝠蛾，鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)近300种昆虫的统称，全球分布。包括几种最大的蛾类，翅展超过22.5公分(9吋)，飞行很快，但无一定方向。幼虫钻入茎内，或生活在地下吃草根。
目前进行人工培植冬虫夏草需要进行大规模的寄主昆虫饲养，在用卵前需要较为快速准确的了解不同批次卵的受精与发育情况，以便确定工艺处理所用的卵量，也对用卵前的工艺环节的质量监控增加一个评判确定指标和方法，为准备生产线各阶段的生产材料提供较准确的参考。但是目前尚无将蝙蝠蛾卵依据发育状况进行有效分类的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液及筛选方法能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种蝙蝠蛾卵筛选液，其包括蔗糖和缓冲液。
研究发现，盐水不能完全将蝙蝠蛾卵进行有效分层，并且持续加大盐水浓度，会对蝙蝠蛾卵造成一定程度的损伤，不仅孵化率会降低而且孵化后蝙蝠蛾存活率也会下降。本发明通过提供包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节pH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
作为优选，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液的pH值为6～7。
作为优选，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5～15.5%。
优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13～15%。
作为优选，缓冲液的盐浓度为0.04～0.16mol/L。
作为优选，缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。
优选地，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2～1.0mmol/L的牛磺酸。
优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4～0.8mmol/L的牛磺酸。
本发明还提供了一种蝙蝠蛾卵的筛选方法，取蝙蝠蛾卵浸没于蝙蝠蛾卵筛选液中，静置，根据蝙蝠蛾卵在蝙蝠蛾卵筛选液中的位置获得蝙蝠蛾卵的发育程度，浮于蝙蝠蛾卵筛选液表面的蝙蝠蛾卵为未发育卵，下沉的蝙蝠蛾卵为发育卵；其中，蝙蝠蛾卵筛选液包括蔗糖和缓冲液。
作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液的pH值为6～7。
作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液中蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5～15.5%。
优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13～15%。
作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液中缓冲液的盐浓度为0.04～0.16mol/L。
作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液中缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。
优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
作为优选，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2～1.0mmol/L的牛磺酸。
优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵的筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4～0.8mmol/L的牛磺酸。
优选地，本发明使用此筛选液的时间为在一定的工业条件下蝙蝠蛾虫卵孵化前的4-10天。
本发明提供了包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节pH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液及筛选方法能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
具体实施方式
本发明公开了一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种蝙蝠蛾卵筛选液，其包括蔗糖和缓冲液。
试验发现pH值虽然对蝙蝠蛾卵的筛选影响不显著，但是能够影响蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化速度及蝙蝠蛾幼虫的健康状况。pH值为5.5、7.5时，孵化率都较高，也加快了孵化速度，但后期成活率中虫子却相对较弱，可见过酸过碱在一定程度上薄弱了卵壳，刺激了胚胎，导致加速孵化，但是如果一定程度的损害卵壳、过度腐蚀刺激后，则对后期幼虫健康有不利的影响。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液的pH值为6～7，在此条件下的蝙蝠蛾卵孵化率较高，而且后期成活率也没有受到影响。
水不能把有胚胎与无胚胎的蝙蝠蛾卵分层，并且处理的卵孵化比较分散；仅用浓度较低的蔗糖分层效果不佳，需要增加蔗糖浓度，且浓度较低的蔗糖溶液处理卵比对照孵化率略低，也影响了幼虫后期成活率。浓度较高的氯化钠的处理分层效果尚可，但是严重影响孵化率以及后期成活率；而本发明提供的一种适当浓度的蔗糖磷酸盐缓冲液，将卵分层更精确，偏差较小，而且可能是磷酸盐缓冲液中的各种离子成分为蝙蝠蛾卵提供了营养护理，使处理后的蝙蝠蛾幼虫健康度提高。因此本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液不但可以较迅速较准确的将发育与未发育的卵分层，使的很快的了解卵的发育状况，预测孵化率，并且还可以促使卵孵化整齐，而且与对照相比，处理过的蝙蝠蛾健康度会提高，便于工业化筛选。在本发明的一些实施例中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5～15.5%。优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13～15%。
缓冲液的盐浓度对蝙蝠蛾卵及幼虫的成活率均有影响。随着缓冲液的盐浓度的升高，成活率下降。因此，在本发明的一些实施例中，缓冲液的盐浓度为0.04～0.16mol/L。缓冲液能够提供合适的缓冲能力，并使得溶液的pH值与卵内的pH相当，在本发明的一些实施例中，缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。优选地，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。更优选地为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小。
在本发明的另一些实施例中，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2～1.0mmol/L的牛磺酸。优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4～0.8mmol/L的牛磺酸。
本发明还提供了一种蝙蝠蛾卵的筛选方法，取蝙蝠蛾卵浸没于蝙蝠蛾卵筛选液中，静置，根据蝙蝠蛾卵在蝙蝠蛾卵筛选液中的位置获得蝙蝠蛾卵的发育程度，浮于蝙蝠蛾卵筛选液表面的蝙蝠蛾卵为未发育卵，下沉的蝙蝠蛾卵为发育卵；其中，蝙蝠蛾卵筛选液包括蔗糖和缓冲液。
试验发现pH值虽然对蝙蝠蛾卵的筛选影响不显著，但是能够影响蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化速度及蝙蝠蛾幼虫的健康状况。pH值为5.5、7.5时，孵化率都较高，也加快了孵化速度，但后期成活率中虫子却相对较弱，可见过酸过碱在一定程度上薄弱了卵壳，刺激了胚胎，导致加速孵化，但是如果一定程度的损害卵壳、过度腐蚀刺激，则对后期幼虫健康有不利的影响。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，筛选液的pH值为6～7，在此条件下的蝙蝠蛾卵孵化率较高，而且后期成活率也没有受到影响。
水不能把有胚胎与无胚胎的蝙蝠蛾卵分层，并且处理的卵孵化比较分散；仅用浓度较低的蔗糖分层效果不佳，需要增加蔗糖浓度，且浓度较低的蔗糖溶液处理卵比对照孵化率略低，也影响了幼虫后期成活率。浓度较高的氯化钠的处理分层效果尚可，但是严重影响孵化率以及后期成活率；而本发明提供的一种适当浓度的蔗糖磷酸盐缓冲液，将卵分层更精确，偏差较小，而且可能是磷酸盐缓冲液中的各种离子成分为蝙蝠蛾卵提供了营养护理，使处理后的蝙蝠蛾幼虫健康度提高。因此本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液不但可以较迅速较准确的将发育与未发育的卵分层，使的很快的了解卵的发育状况，预测孵化率，并且还可以促使卵孵化整齐，而且与对照相比，处理过的蝙蝠蛾健康度会提高，便于工业化筛选。在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5～15.5%。优选地，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，蔗糖占蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为13～15%。
缓冲液的盐浓度对蝙蝠蛾卵及幼虫的成活率均有影响。随着缓冲液的盐浓度的升高，成活率下降。因此，在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，缓冲液的盐浓度为0.04～0.16mol/L。
缓冲液能够提供合适的缓冲能力，并使得溶液的pH值与卵内的pH相当，在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选方法中，缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。优选地，中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。更优选地为磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选方法中，蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2～1.0mmol/L的牛磺酸。优选地，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.4～0.8mmol/L的牛磺酸。
本发明提供了包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液，通过蔗糖的对不同发育程度的蝙蝠蛾卵的分层作用，缓冲液在有效调节pH值的同时还能够利用盐浓度提高蝙蝠蛾的孵化率。本发明也提供了加入一定量的牛磺酸来优化包括蔗糖和缓冲液的蝙蝠蛾卵筛选液。利用本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液能够利用廉价易得的材料与简单方便方法对的蝙蝠蛾卵的发育程度进行快速优劣检测，并且在不破坏实验用卵的同时优化蝙蝠蛾卵，使筛选后的有用卵增加其孵化率和孵化后蝙蝠蛾的存活率。
本发明提供的一种蝙蝠蛾卵筛选液及蝙蝠蛾卵的筛选方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
蔗糖磷酸盐缓冲液检测卵效果：
取第一批次蝙蝠蛾卵，共取3份卵，每份100粒。
取2份虫卵A1-1、A1-2进行解剖查看发育状况，结果如下表1。
另1份100粒卵A2，调节筛选液中蔗糖含量为1%、10%、15%、20%，分别取液5mL，移入10mL离心管内。将蝙蝠蛾卵整体抽样由低到高先后浸入几个蔗糖浓度的测试液中。将卵粒投放入各离心管，反复颠倒6到8次，静止待沉。在每个处理漂浮液面的卵粒捞出放于标有对应记号的铺有滤纸的培养皿内，滤纸加湿，然后将沉底的卵投入下一个处理，再观察卵的漂浮情况。依次投入下一个处理。直到无卵下沉。最后将各处理漂浮卵于解剖镜下解剖，察看发育情况。将每次都将漂浮液面的卵捞出。直到所有卵都被捞出。最后附加进行解剖验证。结果如下表2。
表1蝙蝠蛾卵镜检结果
| 镜检编号卵 | 镜检卵数 | 总孵化率（已孵化+即将孵化的） |
| 镜检A1-1 | 100 | 46% |
| 镜检A1-2 | 100 | 44% |
表2不同蔗糖浓度对蝙蝠蛾卵发育程度的影响
| 卵种（测试液中蔗糖含量） | 漂浮卵粒 | 解剖验证结果 |
| A2卵(1%) | 0 | 无 |
| A2卵(10%) | 40 | 卵内皆为稀质浆液。 |
| A2卵(15%) | 17 | 1粒成型，其余卵内浆液浓度较大。 |
| A2卵(20%) | 43（剩余） | 发育完全，即将孵化 |
由表1结果得知，这两份卵的平均孵化率为45%。由表2结果得知，当蔗糖浓度为15%时，筛选液中的下沉卵为发育卵，且已经发育完全，即将孵化。所以，筛选液中蔗糖浓度可以得知蝙蝠蛾卵的孵化状况。
各溶液处理蝙蝠蛾卵结果效果：
取第二批次蝙蝠蛾卵，共取9份卵，每份100粒。
分别用过滤水、15%蔗糖磷酸盐缓冲液（PH=6.5）、15%蔗糖和10%氯化钠四种溶液进行处理，处理方法如本发明所述。
将处理了的卵孵化后投入饲养基质中饲养，30天后查看各处理存活率。
实验结果。各溶液处理蝙蝠蛾卵结果见表3。
表3各溶液处理蝙蝠蛾卵结果
此批卵经过镜检，孵化率平均为50%。
从实验结果看出，过滤水不能把有胚胎与无胚胎的卵分层，并且处理的卵孵化比较分散；仅用15%的蔗糖溶液处理卵比对照孵化率略低，也影响了幼虫后期成活率。10%氯化钠的处理严重影响孵化率以及后期成活率；而15%蔗糖磷酸盐缓冲液，将卵分层更精确，偏差较小，孵化率相比较高，另外可能是蔗糖与磷酸盐缓冲液中的各种离子成分为卵提供了营养护理，使处理后的虫子健康度提高。
因此，本发明提供的蝙蝠蛾卵筛选液不但可以较迅速较准确的将发育与未发育的卵分层，使得很快地了解卵的发育状况，预测孵化率，并且还可以促使卵孵化整齐，而且与对照相比，处理过的虫子健康度会提高。便于在工厂中进行工艺上的种卵的筛选工作。
各蔗糖溶液处理蝙蝠蛾卵结果：
取第三批次蝙蝠蛾卵，共取12份卵，每份100粒。
分别用过滤水、磷酸盐缓冲液（PH=6.4）、11.5%蔗糖磷酸盐缓冲液（PH=6.4）、11.5%蔗糖、13%蔗糖磷酸盐缓冲液（PH=6.4）、13%蔗糖、13.5%蔗糖磷酸盐缓冲液（PH=6.4）、13.5%蔗糖、14.5%蔗糖磷酸盐缓冲液（PH=6.4）、14.5%蔗糖、15.5%蔗糖磷酸盐缓冲液（PH=6.4）、15.5%蔗糖溶液进行处理，处理方法如本发明所述。筛选结果见表4。
表4蝙蝠蛾卵筛选液的筛选结果
镜检查看该批卵的孵化率为65%。
实验发现，浓度为12.5～15.5%的蔗糖磷酸缓冲液适合蝙蝠蛾卵的筛选，这个区间的蔗糖溶液处理下沉的卵最接近镜检所测得孵化率。
不同pH对卵的孵化与成活影响：
取第四批次蝙蝠蛾卵，共取8份卵，每份100粒。
分别取0.1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液与0.1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液配成PH为5、5.5、6、6.5、7、7.5和8的溶液，来处理卵3min，统计孵化率与后期成活率。
实验结果见表5。
表5不同pH值对蝙蝠蛾卵的孵化与成活影响
从实验结果中看出，pH为5.5和7.5时，孵化率都较高，也加快了孵化速度，但后期成活率中虫子却相对较弱，考虑可能是过酸过碱在一定程度上薄弱了卵壳，刺激了胚胎，导致加速孵化，但是如果过度腐蚀刺激，则对后期幼虫健康有一定的影响。一定程度的损害卵壳，刺激幼虫提前孵化，反而对幼虫后期有不利影响。pH6～7孵化率与对照略高，而且在后期成活率中也没有受到影响。所以，还是考虑在pH为6～7溶液处理的卵较为健康。
不同摩尔浓度的磷酸盐缓冲液对蝙蝠蛾卵的分层效果：
取第五批次蝙蝠蛾卵，共1份卵，共100粒。
配置不同摩尔浓度的磷酸氢二钠、磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠与磷酸二氢）和磷酸二氢钠，进行卵的分层，查看最佳的分层范围。
磷酸盐缓冲液的配置：分别取相同摩尔浓度的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）735ml与磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液265ml混合，使得混合溶液的pH为6.4。共配0.10mol/L至0.7mol/L的溶液共7份。
实验结果见表6。
表6不同摩尔浓度的磷酸盐缓冲液对蝙蝠蛾卵的分层效果
解剖镜检该批卵，孵化率为56%。
结合镜检孵化率56%，从结果中看出，磷酸盐缓冲液分层卵，在0.4mol～0.5mol之间有较好效果。在0.2mol以及之前都无分层作用。
不同摩尔浓度的磷酸缓冲液处理蝙蝠蛾卵的后期影响：
取第六批次蝙蝠蛾卵，共12份卵，每份100粒。
设置0.04mol到0.5mol/L之间的浓度梯度的磷酸盐缓冲液（PH=6.4）。
将每组卵分别于不同摩尔浓度的磷酸盐缓冲液中处理，将卵投放于饲养基质中饲养。30天后在基质中统计幼虫数量。
实验结果见表7。
表7不同摩尔浓度的磷酸盐缓冲液对蝙蝠蛾卵后期的影响
从试验结果可以看出，虽然磷酸盐缓冲液在0.4mol～0.5mol时候有较好的分层效果，但是处理后对幼虫的成活率会降低。通过对蝙蝠蛾卵在0.04mol～0.14mol/L的磷酸盐缓冲液中，卵的后期成活率都好，0.16mol/L开始下降，从0.2mol到0.5mol，幼虫成活率明显下降。所以结合表7和表8，考虑用小于0.16mol/L的磷酸盐缓冲液与合适的蔗糖浓度配伍为测试液。
不同摩尔浓度的磷酸缓冲液与蔗糖配伍处理蝙蝠蛾卵的后期影响：
取第七批次蝙蝠蛾卵，共9份卵，每份100粒。
设置0.04mol到0.16mol/L之间的浓度梯度的15%蔗糖磷酸盐缓冲（PH=6.4）。
将每组卵分别于不同摩尔浓度的磷酸盐缓冲液中处理后，将卵投放于饲养基质中饲养，30天后在基质中统计幼虫数量。
实验结果见表8。
表8不同摩尔浓度的磷酸缓冲液与蔗糖配伍对蝙蝠蛾卵的后期影响
从试验结果查看，与15%蔗糖配伍，磷酸缓冲盐溶液在0.06～0.14mol/L之间幼虫成活率都较好，采取0.1mol/L最佳。相比于单独使用15%蔗糖，15%蔗糖与磷酸盐缓冲液配伍的孵化率和30天后幼虫的成活率都相对较高。
不同缓冲液处理蝙蝠蛾卵的效果：
取第八批次蝙蝠蛾卵，共4份卵，每份100粒。
配置pH均为6的0.1mol/L的醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液。处理卵，查看对蝙蝠蛾卵孵化的影响。
实验结果见表9。
表9不同缓冲液对蝙蝠蛾卵的影响
利用pH均为6含蔗糖的0.1mol/L的醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液处理卵均为可行，其中磷酸盐缓冲液效果最佳。
实施例2
蔗糖磷酸盐缓冲液中加入牛磺酸检测卵的效果：
取同一次蝙蝠蛾卵，共4份卵，每份100粒。
设置0.2～1mmol/L的牛磺酸之间的浓度梯度的15%蔗糖0.1mol/L磷酸盐缓冲（PH=7）。
将每组卵分别于不同摩尔浓度的磷酸盐缓冲液中处理后，将卵投放于饲养基质中饲养，30天后在基质中统计幼虫数量。
实验结果见表10。
表10不同摩尔浓度的牛磺酸与蔗糖磷酸缓冲液配伍对蝙蝠蛾卵的后期影响
从试验结果查看，在蔗糖磷酸缓冲液中加入0.2～1.0mmol/L的牛磺酸，幼虫孵化率和成活率比未加牛磺酸更高。
实施例3蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液877ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液123ml混合，使得混合溶液的pH为6。
添加3125g蔗糖后添加水稀释25倍，获得盐浓度为0.04mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为12.5%）。
实施例4蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液735ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液265ml混合，使得混合溶液的pH为6.4。
添加1875g蔗糖后添加水稀释12.5倍，获得盐浓度为0.08mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为15%）。
实施例5蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液510ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液490ml混合，使得混合溶液的pH为6.8。
添加1550g蔗糖后添加水稀释10倍，获得盐浓度为0.10mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为15.5%）。
实施例6蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液390ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液610ml混合，使得混合溶液的pH为7。
添加0.31g牛磺酸和1875g蔗糖后添加水稀释12.5倍，获得牛磺酸浓度为0.2mmol/L、盐浓度为0.08mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为15%）。
实施例7蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液390ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液610ml混合，使得混合溶液的pH为7。
添加0.62g牛磺酸和1750g蔗糖后添加水稀释12.5倍，获得牛磺酸浓度为0.4mmol/L、盐浓度为0.08mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为14%）。
实施例8蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液877ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液123ml混合，使得混合溶液的pH为6。
添加2.50g牛磺酸和3250g蔗糖后添加水稀释25倍，获得牛磺酸浓度为0.8mmol/L、盐浓度为0.04mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为13%）。
实施例9蝙蝠蛾卵筛选液的制备
配置1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液：溶解120g于足量水中，使终体积为1L；
1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液：溶解142g于足量水中，使终体积为1L；
分别取1mol/L的无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）贮液390ml与1mol/L的磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液610ml混合，使得混合溶液的pH为7。
添加3.12g牛磺酸和3375g蔗糖后添加水稀释25倍，获得牛磺酸浓度为1.0mmol/L、盐浓度为0.04mol/L的蔗糖磷酸缓冲液（蔗糖质量浓度为13.5%）。
实施例10蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例3制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表10。
表10蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 96 | 0 |
| 试验组二 | 20 | 88 |
试验组一种共96粒卵，在溶液中96粒皆上浮。试验组二中共108粒，在溶液中20粒上浮，88粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮20粒中有0粒有胚胎，下沉的88粒中有10粒无胚胎，其余78粒均为有胚胎卵。
由试验结果可知，上浮卵为未受精发育，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
实施例11蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例4制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表11。
表11蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 100 | 0 |
| 试验组二 | 43 | 57 |
试验组一种共100粒卵，在溶液中100粒皆上浮。试验组二中共100粒，在溶液中43粒上浮，57粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮43粒中有4粒有胚胎，下沉的57粒中均为有胚胎卵。
由试验结果可知，上浮卵为未受精发育，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
实施例12蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例5制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表12。
表12蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 100 | 0 |
| 试验组二 | 66 | 34 |
试验组一种共100粒卵，在溶液中100粒皆上浮。试验组二中共100粒，在溶液中66粒上浮，34粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮的66粒卵有9粒为有胚胎，下沉的34粒中均为有胚胎卵。
由试验结果可知，上浮卵基本为未受精发育卵，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
实施例13蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例6制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表13。
表13蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 100 | 0 |
| 试验组二 | 36 | 64 |
试验组一种共100粒卵，在溶液中100粒皆上浮。试验组二中共100粒，在溶液中36粒上浮，64粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮36粒卵中有5粒有胚胎，下沉的64粒中，均为有胚胎卵。
由试验结果可知，上浮卵基本为未受精发育，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
实施例14蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例7制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表14。
表14蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 100 | 0 |
| 试验组二 | 42 | 58 |
试验组一种共100粒卵，在溶液中100粒皆上浮。试验组二中共100粒，在溶液中42粒上浮，58粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮42粒卵中有0粒有胚胎，下沉的58粒均为有胚胎卵。
由试验结果可知，上浮卵基本为未受精发育，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
实施例15蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例8制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表15。
表15蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 100 | 0 |
| 试验组二 | 38 | 62 |
试验组一种共100粒卵，在溶液中100粒皆上浮。试验组二中共100粒，在溶液中38粒上浮，62粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮38粒卵中有0粒有胚胎，下沉的62粒中有58粒为有胚胎卵
由试验结果可知，上浮卵基本为未受精发育，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
实施例16蝙蝠蛾卵的筛选
准备蝙蝠蛾卵，分为试验组一和试验组二。试验组一中的蝙蝠蛾卵为未受精卵，试验组二中的蝙蝠蛾卵为发育到接近孵化的受精与未受精的混合卵；
往烧杯中倒入本发明实施例9制备的蝙蝠蛾卵筛选液，倒入两个10ml测试管中；
从两部分卵中随即挑取一部分卵粒，分别散入两个测试管中，将两组测试管反复倒置几次，待卵粒落定，取出浮于水面的卵粒放入玻璃培养皿中，标号。将测试管内剩余物倒入滤布上，过滤掉液体，将卵放置与另一皿中。
实验结果见表16。
表16蝙蝠蛾卵发育程度筛选结果
| 处理 | 上浮卵 | 下沉卵 |
| 试验组一 | 100 | 0 |
| 试验组二 | 36 | 64 |
试验组一种共100粒卵，在溶液中100粒皆上浮。试验组二中共100粒，在溶液中36粒上浮，64粒下沉。
解剖检测：经过当场解剖检测，试验组一中均为未发育卵，试验组二中上浮36粒卵0粒有胚胎，下沉的64粒中有63粒均为有胚胎卵。
由试验结果可知，上浮卵基本为未受精发育，下沉卵中为发育有胚胎的。本发明可以较为大体快速的了解到此批卵的发育与质量问题，并快速的将有胚胎与无胚胎的卵大部分的分层区分出来。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，其包括蔗糖和缓冲液，所述蔗糖占所述蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5～15.5％，所述缓冲液的盐浓度为0.04～0.16mol/L。
2.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述筛选液pH值为6～7。
3.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述缓冲液为弱酸性缓冲液或中性缓冲液。
4.根据权利要求3所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，所述中性缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾卵筛选液，其特征在于，还包含0.2～1.0mmol/L的牛磺酸。
6.一种蝙蝠蛾卵的筛选方法，其特征在于，取蝙蝠蛾卵浸没于蝙蝠蛾卵筛选液中，静置，根据所述蝙蝠蛾卵在所述蝙蝠蛾卵筛选液中的位置获得所述蝙蝠蛾卵的发育程度，浮于所述蝙蝠蛾卵筛选液表面的蝙蝠蛾卵为未发育卵，下沉的蝙蝠蛾卵为发育卵；
所述蝙蝠蛾卵筛选液包括蔗糖和缓冲液，所述蔗糖占所述蝙蝠蛾卵筛选液的质量百分数为12.5～15.5％，所述缓冲液的盐浓度为0.04～0.16mol/L。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选液pH值为6～7。
8.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述蝙蝠蛾卵筛选液还包含0.2～1.0mmol/L的牛磺酸。
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