CN109055239A - 冬虫夏草菌丝快速培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：Ⅰ.清洗；Ⅱ.分离提纯；Ⅲ.培养复壮。本发明通过选择适宜的培养基，添加了植物激素和中药提取物，有利于诱导冬虫夏草的芽孢和菌丝的生长，从而缩短人工培育冬虫夏草周期，具有重要的经济意义；通过设定特定的温控值和光照时间，提高了虫草素等活性物质的含量，同时由于离原草产地距离最近，培养环境与原草的生长坏境最保证了虫草的最大活性成分，分离培养得到的冬虫夏草菌丝体的各种功效更加接近野生虫草。
Description
技术领域
本发明涉及应用生物技术原理人工培育真菌的技术领域，具体涉及一种冬虫夏草菌丝快速培养方法。
背景技术
冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是我国一种传统的名贵中药材，是一种昆虫真菌的结合体。虫是虫草蝙蝠蛾的幼虫，菌是冬虫夏草真菌。冬虫夏草的形成是由夏天冬虫夏草真菌感染蝠蛾幼虫，菌丝吸取幼虫体内的营养并逐渐充满虫体，直至第二年春夏从虫体头部长出形成子实体。由于近年人工采挖活动的增多，野生冬虫夏草数量骤减，产地植被遭受到了巨大的破坏。冬虫夏草长3-5cm，粗约3-8mm，因为其形状像一棵野草，所以起名为“冬虫夏草”。冬虫夏草一般生长在海拔3500-5000m的气候寒冷、土壤湿润且富含有机质的分水岭两侧的草地或高山草甸顶部以及平缓的山坡上。其菌种是嗜冷真菌的一种，温度对其子座的形成非常重要。产地的地表平均温度为4.4-9℃。菌丝生长繁殖的最适温度为12-18℃，生长温度为5-32℃；形成菌核的温度为10-20℃；形成子座的温度为14-25℃；子座长出土面的温度为26-32℃；子囊孢子释放的温度在28-32℃之间。冬虫夏草菌种侵染活的蝙蝠蛾科幼虫后使得钻入土中的蝙蝠蛾科幼虫死亡，菌丝在活的和死的虫体内生长繁殖故为兼性腐生菌。幼虫染菌钻入土中需要的相对湿度50％-60％；菌丝体生长最适土壤的湿度为40％-60％，相对湿度为80％-95％；虫草菌菌丝体在虫体中生长需要的相对湿度为60％-70％。
现今人工冬虫夏草已经可以成功培育，但产量不高。其中一个制约因素是：在蝠蛾幼虫感染冬虫夏草真菌后，真菌在蝠蛾幼虫体内以芽生孢子(芽孢)形式存在，并以芽孢萌发产生新的芽孢的方式进行繁殖。所谓的芽孢，是指冬虫夏草在侵染寄主幼虫后，在幼虫体内形成大量类似孢子的长梭形细胞。自然情况下，芽孢萌发成菌丝的过程会历经很长时间，一般需要10天左右。而幼虫体内芽孢发育成菌丝是幼虫产生子实体原基(产生并分化为子实体的菌丝结构)的必经环节，因此，缩短这一环节的时间至关重要。另外，虽然十多年来国内许多单位已经对冬虫夏草菌的生长特征、发酵培养基优化和发酵工艺进行大量研究工作，但冬虫夏草菌丝体活性成分还较低，特别是冬虫夏草菌丝体中虫草素含量更低，因此有必要提高冬虫夏草菌的虫草素含量。现有提高虫草素的技术方案一般是对发酵培养基进行改良，或在发酵过程，把一些化学物质，如油酸或其前体物类似物或植物生长调节剂等加入到发酵培养基中，由于发酵培养基体积大，所需原材料或添加物的重量大，成本高。很少见到通过对冬虫夏草菌种子培养基的研究，来提高虫草素含量的研究。因此，冬虫夏草真菌的培养和发酵工艺技术研究的创新，对提高培养冬虫夏草菌菌丝体的活性成分含量，改善冬虫夏草菌的产品质量和药用效果有积极意义。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种冬虫夏草菌丝快速培养方法。
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗；
Ⅱ.分离提纯；
Ⅲ.培养复壮。
具体地，所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，先用消毒液进行消毒，再用灭菌水进行清洗，在无菌条件下，将所得僵虫体切块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入1-10mg植物激素，搅拌均匀后灭菌，再将虫体块接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300-1000lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，然后以紫外线照射0.1-0.2h，再置于黑暗培养9.8-13.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.1-0.6％的中药提取物，搅拌均匀后灭菌，取步骤Ⅱ培养所得菌丝接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，其中每天先以400-1600lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，再黑暗培养10-14h。
优选地，所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，先用消毒液进行消毒，再用灭菌水进行清洗，在无菌条件下，将所得僵虫体切块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入1-10mg植物激素，搅拌均匀后灭菌，再将虫体块接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300-1000lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，然后以紫外线照射0.1-0.2h，再置于黑暗培养9.8-13.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.1-0.6％的中药提取物，搅拌均匀后灭菌，取步骤Ⅱ培养所得菌丝接种在PDA培养基上，先置于温度为25-30℃、白炽灯照射培养的光照强度为1000-1600lx的条件下培养4-10d，接着置于温度为18-22℃、白炽灯照射培养的光照强度为300-600lx的条件下培养4-10d，其中每天照射培养时间为10-14h，黑暗培养时间为10-14h。
更优选地，所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，先用消毒液进行消毒，再用灭菌水进行清洗，在无菌条件下，将所得僵虫体切块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入1-10mg植物激素，搅拌均匀后灭菌，再将虫体块接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300-1000lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，然后以紫外线照射0.1-0.2h，再置于黑暗培养9.8-13.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.1-0.6％的中药提取物，搅拌均匀后灭菌，取步骤Ⅱ培养所得菌丝接种在PDA培养基上，先置于温度为18-22℃、白炽灯照射培养的光照强度为300-600lx的条件下培养4-10d，接着置于温度为25-30℃、白炽灯照射培养的光照强度为1000-1600lx的条件下培养4-10d，其中每天照射培养时间为10-14h，黑暗培养时间为10-14h。
所述消毒液为4-6wt％的次氯酸钠水溶液或70-80wt％的乙醇水溶液。
所述PDA培养基由以下质量份的原料组成：马铃薯190-200份、水1000-2000份、琼脂18-22份、蛋白粉2-5份、葡萄糖18-22份、磷酸二氢钾2-4份、硫酸镁1-2份。
所述PDA培养基的制备方法为：
Ⅰ.按质量份称量各原料组分；
Ⅱ.将马铃薯去皮，去芽眼，切块，接着加水，置于90-100℃下加热20-40min，过滤，加入琼脂，在90-100℃下加热2-5min，再加入蛋白粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，混匀，调节pH值到5.0-6.0后即得。
所述植物激素包括吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、脱落酸中的一种或多种。
优选地，所述植物激素由吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、脱落酸按(1-5)：(1-5)：(1-5)的质量比混合而成。
所述灭菌的处理条件为压力控制在0.1-0.15MPa，温度控制在121-125℃，灭菌时间20-50min。
所述紫外线照射所用紫外线灯的功率为20-35W，且紫外线灯设置在培养基上方20-45cm处。
所述中药提取物包括黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物中的一种或多种。
优选地，所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按(1-5)：(1-5)：(1-5)的质量比混合而成。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：本发明采用的植物激素有利于对冬虫夏草的芽孢进行诱导，促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝；通过设定特定的温控值和光照时间，有利于蝙蝠蛾被毛孢菌丝的生长，提高了虫草素等活性物质的含量，同时由于离原草产地距离最近，培养环境与原草的生长坏境最保证了虫草的最大活性成分，分离培养得到的冬虫夏草菌丝体的各种功效更加接近野生虫草；另外将本发明中药提取物用于冬虫夏草的培养过程中，可以显著提高冬虫夏草的质量，尤其可以虫草素等活性物质的含量，从而提高其药用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例中各原料及设备介绍：
新鲜那曲虫草，采摘自西藏那曲地区海拔5000米的羌塘草原。
吲哚乙酸，CAS号：87-51-4，产品编号：I101074，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
6-苄基腺嘌呤，CAS号：1214-39-7，产品编号：B802626，购自上海麦克林生化科技有限公司。
脱落酸，CAS号：4375-45-2，产品编号：A800093，购自上海麦克林生化科技有限公司。
马铃薯，拉丁学名：学名：Solanum tuberosum，茄科茄属一年生草本植物，品种为克星一号，产地内蒙古，购自内蒙古铃田生物技术有限公司。
琼脂，CAS号：9002-18-0，食品级，购自西安浩天生物工程有限公司。
蛋白粉，采用济南东轩生物工程有限公司提供的食品级大豆分离蛋白粉。
葡萄糖，CAS号：50-99-7，购自山东淄博玉丰源制糖有限公司。
PDA培养基的制备方法为：
Ⅰ.按质量份称取200份马铃薯、1500份水、20份琼脂、3份蛋白粉、20份葡萄糖、3份磷酸二氢钾、1份硫酸镁；
Ⅱ.将马铃薯去皮，去芽眼，切成2mm3的块，加入水，置于95℃下加热30min，用6层纱布过滤，向所得滤液中加入琼脂，置于95℃下加热3min，再加入蛋白粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，搅拌均匀，调节pH值到5.5后即得。
黄芪，拉丁学名：Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.，蝶形花科黄芪属植物干燥根，产地甘肃，购自陇南市武都区华盛中药材种植农民专业合作社。
桑叶，拉丁学名：Folium Mori，为桑科植物桑的干燥叶，产地河南，购自安国市御颜坊中药材有限公司。
枸杞，拉丁学名：Lycium barbarumL.，为茄科枸杞属的果实，品种宁夏枸杞，购自安国市御颜坊中药材有限公司。
黄芪提取物的制备方法为：将黄芪洗净后自然晾干，粉碎至100目，得到黄芪粉末，接着向黄芪粉末中加入60wt％丙酮水溶液，所述黄芪粉末与60wt％丙酮水溶液的质量体积比为1:8(g/mL)，在50℃、200r/min的条件下的振荡浸提2h，经200目滤布过滤，得到滤液A和黄芪滤渣；所得黄芪滤渣再加入60wt％乙醇水溶液，所述黄芪滤渣与60wt％乙醇水溶液的质量体积比为1:8(g/mL)，在50℃、200r/min的条件下的振荡浸提2h，经200目滤布过滤，得到滤液B，合并滤液A和滤液B，所得混合提取液在零下2℃下以15000r/m的转速冷冻离心28min，所得上清液置于55℃、绝对压强为0.05MPa的旋转蒸发仪中旋转浓缩，直到剩余体积为原来体积的4％为止，得到黄芪提取物。
桑叶提取物的制备方法为：将桑叶加入到70wt％乙醇水溶液中，所述桑叶与50wt％乙醇水溶液的质量体积比为1：8(g/mL)，置于85℃下提取2h，经150目滤布过滤，得到滤液C和桑叶滤渣；向所述桑叶滤渣中加入与第一次提取同等体积的70wt％乙醇水溶液，置于85℃下提取2h，经150目滤布过滤，得到滤液D，滤液C和滤液D合并后，置于70℃下干燥3.5h，得桑叶提取物。
枸杞提取物制备方法与黄芪提取物的制备方法相同。
紫外线灯，功率35W，购自无锡市长江医疗器械有限公司。
恒温摇床的型号为BSD-YF1600，购自北京新诺立华仪器有限公司。
实施例1
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1mg吲哚乙酸、1mg 6-苄基腺嘌呤、1mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入温度为28℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养8d，其中每天先在1200lx的白炽灯光照强度下照射培养12h，再黑暗培养12h。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例2
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1.5mg吲哚乙酸、1.5mg 6-苄基腺嘌呤，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入温度为28℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养8d，其中每天先在1200lx的白炽灯光照强度下照射培养12h，再黑暗培养12h。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例3
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1.5mg 6-苄基腺嘌呤、1.5mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入温度为28℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养8d，其中每天先在1200lx的白炽灯光照强度下照射培养12h，再黑暗培养12h。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例4
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1.5mg吲哚乙酸、1.5mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入温度为28℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养8d，其中每天先在1200lx的白炽灯光照强度下照射培养12h，再黑暗培养12h。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
对比例1
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入温度为28℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养8d，其中每天先在1200lx的白炽灯光照强度下照射培养12h，再黑暗培养12h。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例5
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1mg吲哚乙酸、1mg 6-苄基腺嘌呤、1mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入温度为28℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养8d，其中每天先在400lx的白炽灯光照强度下照射培养12h，再黑暗培养12h。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例6
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1mg吲哚乙酸、1mg 6-苄基腺嘌呤、1mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的加入中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入转速为150r/min的恒温摇床上进行培养，先在温度为20℃、白炽灯照射培养的光照强度为400lx的条件下培养12h，接着在黑暗中培养12h，持续时间4d；再置于温度为28℃、白炽灯照射培养的光照强度为1200lx的条件下培养12h，接着在黑暗中培养12h，持续时间4d。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例7
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1mg吲哚乙酸、1mg 6-苄基腺嘌呤、1mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.3％的中药提取物，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入转速为150r/min的恒温摇床上进行培养，先在温度为28℃、白炽灯照射培养的光照强度为1200lx的条件下培养12h，接着在黑暗中培养12h，持续时间4d；再置于温度为20℃、白炽灯照射培养的光照强度为400lx的条件下培养12h，接着在黑暗中培养12h，持续时间4d。
所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物按1:1:1的质量比混合而成。
实施例8
与实施例6基本相同，区别仅仅在于：所述中药提取物由黄芪提取物、桑叶提取物按1:1的质量比混合而成。
实施例9
与实施例6基本相同，区别仅仅在于：所述中药提取物由桑叶提取物、枸杞提取物按1:1的质量比混合而成。
实施例10
与实施例6基本相同，区别仅仅在于：所述中药提取物由黄芪提取物、枸杞提取物按1:1的质量比混合而成。
对比例2
一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，用4wt％的次氯酸钠水溶液进行浸泡消毒，浸泡时间60s，接着用灭菌水清洗3次，其中所述冬虫夏草与每次清洗所用灭菌水的质量体积比为1：3(g/mL)，接着在无菌条件下用灭菌后的手术刀将所得僵虫体切成2mm3的块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在容量为1000mL三角瓶中装入500g PDA培养基，接着向培养基中加入1mg吲哚乙酸、1mg 6-苄基腺嘌呤、1mg脱落酸，在90℃下用玻璃棒搅拌30min，接着在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，再将2块虫体块接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，放入温度为20℃、转速为150r/min的恒温摇床上培养2d，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300lx的白炽灯光照强度照射培养12h，接着紫外线照射0.1h，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为35W，且紫外线灯设置在培养基上方35cm处，再黑暗培养11.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个容量为1000mL三角瓶中装入500gPDA培养基，在压力0.12MPa、温度121℃的条件下灭菌30min，冷却至25℃，取步骤Ⅱ培养2d后的菌丝接种在容量为1000mL三角瓶中的PDA培养基上，然后放入转速为150r/min的恒温摇床上进行培养，先在温度为20℃、白炽灯照射培养的光照强度为400lx的条件下培养4d，接着在温度为28℃、白炽灯照射培养的光照强度为1200lx的条件下培养4d，且每天照射培养时间为12h，黑暗培养时间为12h。
测试例1
产孢量和菌丝平均生长速度测试：根据张宗耀的期刊文献《培养基及培养条件对冬虫夏草菌固体发酵产分生孢子的影响》中1.5节分生孢子的收集计数方法和于海洋的期刊文献《蛹虫草优良菌株的筛选》中1.2节试验方法，对实施例1-10以及对比例1中步骤(Ⅲ)蝙蝠蛾被毛孢菌丝培养8d的产孢量和菌丝平均生长速度进行测试。
表1：产孢量和平均生长速度测试结果表
由测试结果可知，实施例1中添加由吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、脱落酸的植物激素，其产孢量和平均生长速度均高于实施例2-4(由吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、脱落酸任意两种组合的植物激素)以及对比例1(未使用植物激素)；进一步地，实施例7中先采用紫外线照射和弱光照射等方法对冬虫夏草芽孢进行诱导，再利用弱光和强光照射刺激菌丝的生长，进一步提高了产孢量和平均生长速度。
测试例2
多糖和虫草素含量测定：对实施例1、5-10中冬虫夏草菌丝体中多糖和虫草素的含量进行测定。
冬虫夏草菌丝体的获取方法为：将培养基在相对离心力为12000g的条件下离心15min，重复离心操作洗涤菌丝体二次，在65℃下干燥至恒重。
多糖含量测试：称取5g冬虫夏草菌丝体，粉碎至60目，加100mL蒸馏水，100℃水浴浸提3h后，在相对离心力为10000g的条件下离心10min，收集上清液，加15mL无水乙醇，4℃下醇沉过夜，离心收集沉淀，蒸馏水复溶后用期刊文献《江西虫草多糖含量的快速检测方法研究》中苯酚硫酸法测定多糖含量。
虫草素的含量：称取5g冬虫夏草菌丝体，粉碎至60目，加200mL的50wt％乙醇，100℃下水浴浸提3h后，在相对离心力为10 000g下离心10min，收集上清液，定容后过0.22μm微孔滤膜，参照施新琴的期刊文献《高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究》中的高效液相色谱法对虫草素的含量进行测定，色谱条件:色谱柱采用C18色谱柱(型号为4.6mm×250mm，5μm，购自上海艾妍生物科技有限公司)，流动相中乙睛与去离子水的体积比为40：60，流速0.6mL/min，进样体积20μL，柱温40℃，紫外检测波长260nm。
表2：多糖和虫草素含量测试结果表
由测试结果可知，实施例6中添加由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物混合而成的中药提取物，其多糖和虫草素的含量均明显高于实施例8-10(由黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物任意两种组合的中药提取物)以及对比例2(未添加中药提取物)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内；本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗；
Ⅱ.分离提纯；
Ⅲ.培养复壮。
2.如权利要求1所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，先用消毒液进行消毒，再用灭菌水进行清洗，在无菌条件下，将所得僵虫体切块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入1-10mg植物激素，搅拌均匀后灭菌，再将虫体块接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300-1000lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，然后以紫外线照射0.1-0.2h，再置于黑暗培养9.8-13.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.1-0.6％的中药提取物，搅拌均匀后灭菌，取步骤Ⅱ培养所得菌丝接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，其中每天先以400-1600lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，再黑暗培养10-14h。
3.如权利要求1所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ.清洗：将新鲜那曲虫草去除外部菌套，刷去冬虫夏草表面杂质，先用消毒液进行消毒，再用灭菌水进行清洗，在无菌条件下，将所得僵虫体切块，得到虫体块；
Ⅱ.分离提纯：在三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入1-10mg植物激素，搅拌均匀后灭菌，再将虫体块接种在PDA培养基上，置于15-30℃的恒温摇床上进行培养，直至培养基的表面长出菌丝，其中每天先以300-1000lx的白炽灯光照强度照射培养10-14h，然后以紫外线照射0.1-0.2h，再置于黑暗培养9.8-13.9h；
Ⅲ.培养复壮：在另一个三角瓶中装入400-800g PDA培养基，接着加入PDA培养基质量0.1-0.6％的中药提取物，搅拌均匀后灭菌，取步骤Ⅱ培养所得菌丝接种在PDA培养基上，先置于温度为18-22℃、白炽灯照射培养的光照强度为300-600lx的条件下培养4-10d，接着置于温度为25-30℃、白炽灯照射培养的光照强度为1000-1600lx的条件下培养4-10d，其中每天照射培养时间为10-14h，黑暗培养时间为10-14h。
4.如权利要求2或3所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，步骤Ⅰ中所述消毒液为4-6wt％的次氯酸钠水溶液或70-80wt％的乙醇水溶液。
5.如权利要求2或3所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，所述PDA培养基由以下质量份的原料组成：马铃薯190-200份、水1000-2000份、琼脂18-22份、蛋白粉2-5份、葡萄糖18-22份、磷酸二氢钾2-4份、硫酸镁1-2份。
6.如权利要求2或3所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，步骤Ⅱ中所述植物激素包括吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、脱落酸中的一种或多种。
7.如权利要求2或3所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，所述灭菌的处理条件为压力控制在0.1-0.15MPa，温度控制在121-125℃，灭菌时间20-50min。
8.如权利要求2或3所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，在步骤Ⅱ中所述紫外线照射过程中，所用紫外线灯的功率为20-35W，且紫外线灯设置在培养基上方20-45cm处。
9.如权利要求2或3所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，步骤Ⅲ中所述中药提取物包括黄芪提取物、桑叶提取物、枸杞提取物中的一种或多种。
10.如权利要求5所述冬虫夏草菌丝快速培养方法，其特征在于，所述PDA培养基的制备方法为：
Ⅰ.按质量份称量各原料组分；
Ⅱ.将马铃薯去皮，去芽眼，切块，接着加水，置于90-100℃下加热20-40min，过滤，加入琼脂，在90-100℃下加热2-5min，再加入蛋白粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，混匀，调节pH值到5.0-6.0后即得。
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