CN108330072A - 桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物及其制备方法及应用 - Google Patents
桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物及其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物及其制备方法及应用，本发明包括菌种活化、液体菌种培养、液体深层发酵及桦褐孔菌发酵产物分离制备等主要步骤；本发明提供一种选自白俄罗斯国家科学院微生物研究所的桦褐孔菌真菌为出发菌株，菌种编号为：kxHHKJ‑025‑2的优化液体深层发酵生产桦褐孔菌发酵培养组合物的方法，获得的发酵培养组合物为重量百分比不低于50%的桦褐孔菌多糖和不低于0.03%的三萜类化合物，该组合物降血糖活性更强，产品更利于工业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，更具体地说，本发明涉及一种桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物及其制备方法及应用。
背景技术
桦褐孔菌（Inonotus obliquus）的分类：又名桦树茸，属于真菌门、担子菌亚门、层菌钢、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。中文名为白桦茸，桦树茸，药用部分是菌核。
桦褐孔菌的生长环境及形态：桦褐孔菌是俄罗斯的一种民间药用真菌。桦褐孔菌及其耐寒，生活在木材中的菌丝体能耐零下40℃的低温，桦褐孔菌菌核呈瘤状、无柄，一般直径25-40cm,外表黑褐色或黑色，深裂，表面不规则，像砖块，菌肉红褐色，木栓质，生于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。是十分珍稀而又名贵的食药用真菌。
桦褐孔菌的分布：桦褐孔菌属于寒带物种，主要分布在北半球北纬45-50°的地区，如北美州北部、波兰、芬兰、俄罗斯的西伯利亚、我国的黑龙江和吉林省长白山等地区，目前山西的吕梁山脉也发现桦褐孔菌。
桦褐孔菌的化学成分：目前从桦褐孔菌中分离鉴定出的化学成分主要包括萜类、多糖类、甾醇类、氨基酸、生物碱、肽类等。
目前，有关桦褐孔菌（Inonotus obliquus）化学成份的系统性研究还不够深入，综合国内外的文献报道，桦褐孔菌的化学成分主要有三萜类化合物、甾醇类、多糖类、木质素类、黑色素类、多酚类、生物碱类、肽类、单宁化合物、叶酸衍生物以及芳香的香草酸等。
国外对桦褐孔菌的研究情况：国外对桦褐孔菌的开发始于六七十年代，俄罗斯、波兰等国的学者发现桦褐孔菌在白血病的诊断、治疗牛皮癣、治疗小牛消化不良等方面有良好的效果，并对溶核蛋白产生影响，1955年莫斯科医学院宣布桦褐孔菌为抗癌物质，政府批准桦褐孔菌可用于医药品开发，美国十分关注桦褐孔菌的免疫增强效果，并将其制成健康辅助食品。日本的研究人员高度评价这种民间的药物，把桦褐孔菌菌核作为肝癌、爱滋病和0-157大肠杆菌中毒的治疗剂，并申请多项有关桦褐孔菌的专利，认为桦褐孔菌是一种“万能药”（panacea）。俄罗斯的堪索莫乐斯基（komsomlski）制药公司生产的桦褐孔菌精粉对糖尿病的治愈率达93%。1960年美国国立癌症研究所收到一篇来自澳大利亚的报告，利用桦褐孔菌煎剂已经成功地治愈癌病。直到1970年，世人才逐渐了解桦褐孔菌提取物及制品对各种癌症、心脏病、糖尿病、艾滋病等均有很好的疗效。是一种民间长期使用且已证明具有特定医药保健功效的珍稀药用真菌。
桦褐孔菌的药理作用：从文献报告中，桦褐孔菌药理作用也很突出，有抗肿瘤，抗炎，降血糖，提高免疫力，抗血栓的形成，抗高血压等。近年来，药用真菌——桦褐孔菌的研究日益引起越来越多的关注，已成为医药界寻求和发掘新药的重要领域。
桦褐孔菌的资源：野生的品种只有在活的树上生长10-15年才具有很好的药用价值，而且生长桦褐孔菌的比例在万分之一，因此桦褐孔菌的资源十分稀缺，这使桦褐孔菌的研究利用受到了限制。
我国的研究情况：对桦褐孔菌子实体的化学成分和药理作用的研究国外已有很多报道，特别是对降血糖和抗肿瘤方面的研究。但在我国对桦褐孔菌的研究还在起步阶段，其原料的主要来源是靠采集野生资源，而野生资源及其有限。
野生的桦褐孔菌成年菌会吸干桦树的精华，导致树木干枯，故而其自然资源十分稀缺，其价格在国际市场上远胜珍贵药用真菌桑黄。而且目前尚没有有效的方法人工培育菌核和子实体，因此采用液体深层发酵培养菌丝体获得活性成分是一个可行的代替方法。采用液体深层发酵的方法，和传统的真菌培育方法相比，具有生产周期短、成本低、产量质量稳定、产品可以控制等优越性。如能开发新的桦褐孔菌产品及其制备方法，将可提高桦褐孔菌的应用范围及应用价值。
发明内容
本发明克服现有技术的不足，提供一种桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物及其制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：以从白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进的桦褐孔菌真菌为出发菌株。
菌种来源：桦褐孔菌：2016年9月从白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进，并经中国科学院微生物研究所鉴定确认为桦褐孔菌（Inonotus obliquus），公司菌种编号为：kxHHKJ-025-2。
具体包括以下步骤。
a）斜面传代培养：斜面培养基为每份麦芽汁固体培养基包括：麦芽汁1000ml，琼脂18-22g，PH 5.5-6.0，所述的麦芽汁的波美度为3.5°B；培养温度22℃-28℃，培养时间240-310小时。
b）一级发酵：将斜面菌种接种到一级发酵培养基中发酵，发酵温度22℃-28℃，摇床转速为100-150rpm/min，发酵时间190-288小时。
c）二级发酵：将一级发酵菌种接种到二级发酵培养基中发酵，接种量为8%-12%，置于22℃-28℃，摇床转速为100-150rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养110-210小时。
d）产物分离提取：将二级液体深层发酵产物进行过滤分离，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵滤液；将菌丝体用纯化水彻底冲洗，65-70℃干燥，40目粉碎，按照纯化水与菌丝体粉末重量比15-30:1进行超声提取，提取温度55-60℃，提取时间60min，合并提取液，65-70℃减压浓缩至原体积的1/3-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵滤液减压浓缩至原体积的1/3-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇搅拌，使乙醇终浓度达到75%-80%，4℃沉淀12-20小时，收集沉淀得到桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物。
所述的一级发酵培养基和二级发酵培养基为：每100ml无菌水中有葡萄糖0.8-2.5g，玉米粉0.8-2.5g，黄豆粉0.3-2.0g，蛋白胨0.3-2.0g，KH2PO4 0.05-0.2g，MgSO4 0.03-0.12g，VB1 0.5mg-1.5 mg，VB6 0.1mg-0.3 mg。
优选的所述超声提取的超声波频率为40KHZ。
优选的所述的一级和二级发酵培养，选择100-12000L的发酵罐进行发酵培养。
桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物采用上述制备方法制备得到。
桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物包括重量百分比不低于50%的桦褐孔菌多糖和不低于0.03%的三萜类化合物。
桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物在制备降血糖的保健品或药品中的应用。
用硫酸蒽铜法测定桦褐孔菌提取组合物的多糖含量不低于50%，用《中国药典》2015版方法测定桦褐孔菌提取组合物中三萜类含量不低于0.03%。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：本发明在传代培养中使用的麦芽汁固体培养基对菌种编号为：kxHHKJ-025-2的桦褐孔菌的培养，在琼脂麦芽汁上生长的菌落稍微呈放射状，具有绒毛样，致密，蓬松的淡黄色的菌丝体，随着生长时间后期的生锈棕色色素沉着，老龄化变成赭色。菌落是缓慢生长，平均速率为2-2.3mm /天。菌丝是隔膜，薄壁，分枝，直径2-4μm。菌丝生长旺盛、致密，蓬松，用接种铲容易铲起切碎接入液体培养基中，有利于液体摇瓶的放大培养。相对于其他斜面固体培养基培养该菌种，可以简化打孔取样的操作程序，减少了污染的机会。
在一级和二级发酵培养中，不同的发酵培养基成分和不同的培养基配比、培养温度及PH等对活性成分、含量均有显著影响，本发明在一级、二级发酵培养中使用的培养基促进了桦褐孔菌胞内外营养物质的积累，增加了菌丝数量和桦褐孔菌胞内外多糖的积累。同时，本发明针对菌种编号为：kxHHKJ-025-2的桦褐孔菌对其培养的时间和温度进行限定对于桦褐孔菌的对数生长期具有显著延长作用，为之后的稳定期做好充分的基础，有利于菌丝的积累和胞内外多糖的产生。
本发明桦褐孔菌液体深层发酵方法，发酵生产周期短，适用于编号为kxHHKJ-025-2的桦褐孔菌的规模化发酵及发酵产物的工业化生产；是获取活性成分的有效途径，克服了野生资源的局限性。
本发明通过液体深层发酵所得的发酵产物，含有重量不低于50%的桦褐孔菌多糖、和不低于0.03%的三萜类化合物、以及肽类等多种活性成分，这些活性成分具有明显降血糖的作用，本发明对引进国外菌种资源、开发利用药用真菌资源开辟了一条新途径。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1
菌种来源：桦褐孔菌2016年9月从白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进，并经中国科学院微生物研究所鉴定确认为桦褐孔菌（Inonotus obliquus），公司菌种编号为：kxHHKJ-025-2。
1）麦芽汁固体培养基制备：该培养基配方为麦芽汁1000ml，波美度为3.5°B； 琼脂18g，PH 5.5-6.0，装入22×220mm的斜面试管中，每支试管装量15 ml；121℃灭菌30min，冷却后备用。
2）无菌条件下取桦褐孔菌斜面菌种黄豆粒大的一小块，接入新鲜的麦芽汁固体培养基试管内，培养温度25℃，培养时间280小时。
3）一级发酵：发酵培养基121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，在无菌条件下，将一代斜面菌种（公司菌种编号：KXHHKJ025-2）一支用接种铲分几次接入含有250ml液体培养基的750ml的摇瓶中进行一级液体发酵培养，置于25℃，摇床转速为115rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养260小时后进行二级发酵；该液体培养基配方为（g/100ml）：葡萄糖1.0 g，玉米粉1.0g，黄豆粉0.5g，蛋白胨0.5g，KH2PO4 0.15g，MgSO4 0.075g，VB1 1mg，VB6 0.1mg，消沫油0.3 g，加纯化水定容至100ml。
4）二级发酵：发酵培养基121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，取一级种子发酵液接入含有250ml液体培养基的750ml的摇瓶中，接种量为10%，置于25℃，摇床转速为130rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养168小时；得到液体深层发酵产物，该液体培养基与一级发酵培养基相同。
5）将二级液体深层发酵产物进行分离，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵滤液，将菌丝体用纯化水冲洗3次，置鼓风干燥箱中65-70℃干燥，称重，40目粉碎，按照纯化水与菌丝体粉末25:1置于超声仪内，55-60℃，40KHZ超声提取60min，重复提取2次，合并提取液，65℃减压浓缩至原体积的1/3，得胞内多糖浓缩液；将发酵滤液65℃减压浓缩到至原体积的1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇搅拌，使乙醇终浓度达到80%，4℃沉淀20小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，53℃恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌提取组合物Ⅰ，用硫酸蒽铜法测定桦褐孔菌提取组合物Ⅰ的多糖含量达55%，用《中国药典》2015版方法测定提取组合物Ⅰ中三萜类含量为0.03%。
6）桦褐孔菌提取组合物Ⅰ加入制备颗粒剂的常规辅料，混合，制粒、干燥，分装。
实施例2
菌种来源：桦褐孔菌：2016年9月从白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进，并经中国科学院微生物研究所鉴定确认为桦褐孔菌（Inonotus obliquus），公司菌种编号为：kxHHKJ-025-2。
1）麦芽汁固体培养基制备：该培养基配方为麦芽汁1000ml，波美度为3.5°B；琼脂22g，PH 5.5-6.0，装入22×220mm的斜面试管中，每支试管装量15 ml；121℃灭菌30min，冷却后备用。
2）无菌条件下取桦褐孔菌斜面菌种黄豆粒大的一小块，接入新鲜的麦芽汁固体培养基试管内，培养温度28℃，培养时间240小时。
3）一级发酵：发酵培养基121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，在无菌条件下，将一代斜面菌种（公司菌种编号：KXHHKJ025-2）一支用接种铲分几次接入含有250ml液体培养基的750ml的摇瓶中进行一级液体发酵培养，置于25℃，摇床转速为115rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养240小时后进行二级发酵；该液体培养基配方为（g/100ml）：葡萄糖1.5 g，玉米粉0.8g，黄豆粉0.4g，蛋白胨0.4g，KH2PO4 0.1g，MgSO4 0.05g，VB1 0.5mg，VB6 0.3mg，消沫油0.3g，加纯化水定容至100ml。
4）二级发酵：发酵培养基121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，取一级种子发酵液接入含有250ml液体培养基的750ml的摇瓶中，接种量为8%，置于25℃，摇床转速为130rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养150小时；得到液体深层发酵产物。该液体培养基与一级发酵培养基相同。
5）将二级液体深层发酵产物进行分离，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵滤液，将菌丝体用纯化水冲洗3次，置鼓风干燥箱中65-70℃干燥，称重，40目粉碎，按照纯化水与菌丝体粉末20:1置于超声仪内，55-60℃，40KHZ超声提取60min，重复提取2次，合并提取液，65℃减压浓缩至原体积的1/3，得胞内多糖浓缩液；将发酵滤液65℃减压浓缩至原体积的1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇搅拌，使乙醇终浓度达到80%，4℃沉淀20小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，53℃恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌提取组合物Ⅰ，用硫酸蒽铜法测定桦褐孔菌提取组合物Ⅰ中的多糖含量达54%，用《中国药典》2015版方法测定提取组合物Ⅰ中三萜类化合物含量为0.09%。
6）桦褐孔菌提取组合物Ⅰ加入制备胶囊剂的常规辅料，混合，制粒、干燥，装胶囊、分装。
实施例 3
菌种来源：桦褐孔菌2016年9月从白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进，并经中国科学院微生物研究所鉴定确认为桦褐孔菌（Inonotus obliquus），公司菌种编号为：kxHHKJ-025-2。
1）麦芽汁固体培养基制备：该培养基配方为麦芽汁1000ml，波美度为3.5°B；琼脂20g，PH 5.5-6.0，装入22×220mm的斜面试管中，每支试管装量15 ml；121℃灭菌30min，冷却后备用。
2）斜面传代：无菌条件下取桦褐孔菌斜面菌种黄豆粒大的一小块，接入新鲜的麦芽汁固体培养基试管内，培养温度24℃，培养时间310小时。
3）一级发酵：发酵培养基121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，在无菌条件下，将一代斜面菌种（公司菌种编号：KXHHKJ025-2）一支用接种铲分几次接入含有250ml液体培养基的750ml的摇瓶中进行一级液体发酵培养，置于25℃，摇床转速为150rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养275小时后进行二级发酵；该液体培养基配方为（g/100ml）：葡萄糖1.5g，玉米粉0.9g，黄豆粉0.3g，蛋白胨0.5g，KH2PO4 0.12g，MgSO4 0.06g，VB1 1.5mg，VB6 0.2mg，消沫油0.32g，加纯化水定容至100ml。
4）二级发酵：发酵培养基121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，取一级种子发酵液接入含有250ml液体培养基的750ml的摇瓶中，接种量为10%，置于25℃，摇床转速为130rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养200小时；得到液体深层发酵产物，该液体培养基与一级发酵培养基相同。
5）将二级液体深层发酵产物进行分离，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵滤液，将菌丝体用纯化水冲洗3次，置鼓风干燥箱中65℃干燥，称重，40目粉碎，按照纯化水与菌丝体粉末20:1置于超声仪内，55℃，40KHZ超声提取60min，重复提取2次，合并提取液，65℃减压浓缩至原体积的1/5，得胞内多糖浓缩液；将发酵滤液65℃减压浓缩到至原体积的1/7，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇搅拌，使乙醇终浓度达到77%，4℃沉淀15小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，53℃恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌提取组合物Ⅰ，用硫酸蒽铜法测定组合物Ⅰ中的多糖含量为50%，用《中国药典》2015版方法测定组合物Ⅰ中三萜类化合物含量为0.08%。
6）桦褐孔菌提取组合物Ⅰ加入制备片剂的常规辅料，混合，制粒、干燥，压片、包衣、分装。
为了进一步验证工艺的可行性，对获得的发酵产物经过25倍水提醇沉后53℃恒温干燥，用硫酸蒽铜法测定获得的桦褐孔菌提取组合物Ⅰ的粗多糖含量不低于50%。
发酵过程还可以采用100升、1500升与12000升发酵罐放大发酵，具体方法为：将液体培养基配方为（g/100ml）：葡萄糖1.0g，玉米粉1.0 g，黄豆粉0.5g，蛋白胨0.5g，KH2PO40.15g，MgSO4 0.075g，VB1 1mg，VB6 0.3mg，消沫油：0.3g，加纯化水定容至所需体积，PH值自然，经121℃灭菌30分，自然冷却到25℃，将摇床上培养好的二级摇瓶种子接种到100升的一级种子罐中，温度25℃、无菌空气通气量1:0.4-0.6（V/V）、罐压：0.04-0.05mpa的条件下培养260小时；达到以下的转罐标准，发酵液米黄色至啤酒色，清亮透明，菌丝颗粒均匀，浓度85-90%，显微镜镜检菌丝生长旺盛，无杂菌，即可接入1500升的二级发酵罐中，接种量10%，25℃、无菌空气通气量1:0.6-0.8（V/V）、罐压：0.04-0.05mpa的条件下培养190小时；达到上述转罐标准后再按照10%的接种量接入12000升的三级发酵罐中，25℃、无菌空气通气量1:0.6-0.8（V/V）、罐压：0.04-0.05mpa的条件下培养168小时；即得到桦褐孔菌液体深层发酵产物。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。
Claims (6)
1.桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物的制备方法，其特征在于：以从白俄罗斯国家科学院微生物研究所引进的桦褐孔菌真菌为出发菌株，菌种编号为：kxHHKJ-025-2；包括以下步骤：
a）斜面传代培养：斜面培养基为每份麦芽汁固体培养基包括：麦芽汁1000ml，琼脂18-22g，PH 5.5-6.0，所述的麦芽汁的波美度为3.5°B；培养温度22℃-28℃，培养时间240-310小时；
b）一级发酵：将斜面菌种接种到一级发酵培养基中发酵，发酵温度22℃-28℃，摇床转速为100-150rpm/min，发酵时间190-288小时；
c）二级发酵：将一级发酵菌种接种到二级发酵培养基中发酵，接种量为8%-12%，置于22℃-28℃，摇床转速为100-150rpm/min的旋转式摇床上，恒温培养110-210小时；
d）产物分离提取：将二级液体深层发酵产物进行过滤分离，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵滤液；将菌丝体用纯化水彻底冲洗，65-70℃干燥，40目粉碎，按照纯化水与菌丝体粉末重量比15-30:1进行超声提取，提取温度55-60℃，提取时间60min，合并提取液，65-70℃减压浓缩至原体积的1/3-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵滤液减压浓缩至原体积的1/3-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇搅拌，使乙醇终浓度达到75%-80%，4℃沉淀12-20小时，收集沉淀得到桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物；
所述的一级发酵培养基和二级发酵培养基为：每100ml无菌水中有葡萄糖0.8-2.5g，玉米粉0.8-2.5g，黄豆粉0.3-2.0g，蛋白胨0.3-2.0g，KH2PO4 0.05-0.2g，MgSO4 0.03-0.12g，VB1 0.5mg-1.5 mg，VB6 0.1mg-0.3 mg。
2.根据权利要求1所述的桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物的制备方法，其特征在于，所述的超声提取的超声波频率为40KHZ。
3.根据权利要求1所述的桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物的制备方法，其特征在于，所述的一级和二级发酵培养，选择100-12000L的发酵罐进行发酵培养。
4.桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物，其特征在于，采用权利要求1-3任一项制备方法制备得到。
5.根据权利要求4所述的桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物，其特征在于，所述组合物包括重量百分比不低于50%的桦褐孔菌多糖和不低于0.03%的三萜类化合物。
6.桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物的应用，其特征在于，根据权利要求4或5所述的桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物在制备降血糖的保健品或药品中的应用。
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