CN113278662B - 一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法 - Google Patents

一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法，包括如下步骤：(1)黑玉米穗轴预处理：清洗、干燥后，粉碎，过筛；(2)菌源液制备：将桦褐孔菌菌株于PDA培养基上培养得到菌丝体；再将菌丝体转移至液体培养基，培养得到菌源液；(3)花青素提取：在蒸馏水中加入黑玉米穗轴粉碎物和酵母提取物形成培养液；接种菌源液，振荡培养7‑10天，收集培养液；将培养液通入反渗透装置，得到浓缩液；将浓缩液通入树脂柱，以酸性乙醇进行洗脱，得到洗脱液；将洗脱液通入真空减压蒸馏器，回收溶剂，再对蒸馏物进行干燥即得到花青素粉末。本发明首次采用桦褐孔菌提取黑玉米花青素，提取效率高，生物安全，为黑玉米花青素的利用打开了广阔空间。

Description

一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法。
背景技术
花青素又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物。研究表明，花青素是一种强有力的抗氧化剂、自由基清除剂，它能和蛋白质结合防止过氧化，从而具有预防心脑血管疾病，保护肝脏、预防癌症、增进视力、改善睡眠等保健作用。
黑玉米中的花青素含量高，并且黑玉米穗轴中的花青素含量远高于籽粒，是花青素的重要来源。
发明内容
本发明的目的是提供一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法，具有成本低、安全性高的优点。
根据本发明的用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法，包括如下步骤：
(1)黑玉米穗轴预处理
黑玉米穗轴清洗、干燥后，粉碎，过筛，将粉碎物用于后续培养；
(2)菌源液制备
将桦褐孔菌菌株于PDA培养基上28℃培养20-30天，得到菌丝体，于4℃保存；
将上述菌丝体转移至液体培养基，28℃振荡培养5-7天，得到菌源液；
本发明先在PDA培养基上对桦褐孔菌进行预培养，保证菌丝体的质量；然后再将菌丝体转移至液体培养基进行快速培养，菌株培养效率大大提高，并制成菌源液便于后续接种。
(3)花青素提取
在蒸馏水中加入黑玉米穗轴粉碎物和酵母提取物，高压灭菌后形成培养液；按培养液体积的6-10％接种菌源液，振荡培养7-10天，收集培养液；
将培养液通入反渗透装置，进行初步纯化浓缩，得到浓缩液；
将浓缩液通入树脂柱，以酸性乙醇进行洗脱，得到洗脱液；
将洗脱液通入真空减压蒸馏器，回收溶剂，再对蒸馏物进行干燥即得到花青素粉末。
优选情况下，步骤(1)中粉碎物的粒径大小为60目-100目之间。合适粒径的黑玉米穗轴粉碎物对后续的发酵培养具有重要影响，小于100目的粉碎物其组织成分容易在空气中发生氧化。
优选情况下，步骤(2)中液体培养基的重量组分为：蔗糖1％、麦芽糖1％、蛋白胨0.5％、酵母提取物0.2％、KH2PO4 0.1％、MgSO4 0.2％、CaCl2 0.1％、余量为水。该培养基有利于菌丝的生长，得到的菌球数量更多。
优选情况下，步骤(3)培养液中黑玉米穗轴粉碎物的质量配比为10-20％，酵母提取物的质量配比为0.5-1％。
优选情况下，步骤(3)反渗透装置采用复合膜，孔径0.5nm，操作条件为：进口压力4MPa，出口压力3.5MPa，平均通量9L/h·m2，以达到10：1-8：1的浓缩效果，提升下一步的效率。
优选情况下，步骤(3)中酸性乙醇的pH＝3-4，乙醇浓度为30-35％(溶剂为水)。本发明中采用酸洗乙醇来进行洗脱，洗脱效率高于中性乙醇。
优选情况下，步骤(3)中树脂柱采用DM301树脂。树脂柱预先用无水乙醇进行浸泡处理，去除杂质。树脂柱的径高比优选为1：8。
优选情况下，步骤(3)中最后的蒸馏物干燥工艺采用喷雾造粒，效率高并且可以直接制成合适粒径的球形粉末，便于在保健食品中的应用。
本发明首次采用桦褐孔菌提取黑玉米花青素，提取效率高，生物安全，为黑玉米花青素的利用打开了广阔空间。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步解释说明。本文中没有明确表明的百分含量均为质量百分比。
一、黑玉米穗轴预处理
黑玉米穗轴清洗、干燥(50-60℃)后，粉碎，过筛，将60目-100目大小的粉碎物用于后续培养。
二、菌源液制备
(从“东北食药真菌研究所”)市购桦褐孔菌(多孔菌科褐卧孔菌属桦褐孔菌Inonotusobliquus(Fr)Pilat)菌株，挑取菌种白色菌丝部分(含培养基，黄豆大小)于PDA培养基上28℃培养20-30天，至菌丝长满试管斜面，于4℃保存。
将上述试管斜面的菌丝转移至液体培养基(蔗糖1％、麦芽糖1％、蛋白胨0.5％、酵母提取物0.2％、KH2PO4 0.1％、MgSO4 0.2％、CaCl2 0.1％、余量为水)，28℃振荡培养5-7天，制成菌源液。
三、树脂吸附柱的优选
选择适宜的树脂以达到最大分离效果。
向黑玉米穗轴粉碎物制成的培养液中接入6％的菌源液，培养10天后，收集培养液，于4000r/min离心20min，得到粗提液。5000mL粗提液经反渗透浓缩后，得到约500mL浓缩液，备用。
采用分光光度法计算吸附率和解析率，从AB-8、DM301、NKA-9中选择适宜的树脂。
浓缩液用树脂纯化前，检测吸光度A0。
准确称取三种预处理好的树脂各10g于三角瓶中，各加入150mL浓缩液，每隔5min振摇一次，3h后分别取三种树脂吸附液1mL检测吸光度A1。然后将树脂过滤后用滤纸吸干表面溶液，加入150mL 40％的酸性乙醇洗脱，每隔5min振摇一次，3h后分别取三种树脂解析液1mL检测吸光度A2。
吸附率(％)＝(A0-A1)/A0×100％
解析率(％)＝A2/A1×100％
检测结果如表1所示。
表1：三种树脂的静态吸附性能
树脂类型 AB-8 DM301 NKA-9
吸附率(％) 91.22 97.38 83.18
解析率(％) 86.75 93.04 78.14
从表1中可以看出，DM301对花青素有良好的分离性能。
实施例1
向黑玉米穗轴粉碎物制成的培养液中接入6％的菌源液，培养8天后，收集培养液，于4000r/min离心20min，得到粗提液。5000mL粗提液经反渗透浓缩后，得到约500mL浓缩液，备用。
称取10g预处理好的DM301树脂装入1.5cm×20cm的柱子内，径高比1：8，从柱顶通入80mL浓缩液，流速控制在1mL/min，后用5BV 35％的酸性乙醇以1mL/min的流速进行洗脱。洗脱液于60℃旋转蒸发浓缩后，在真空干燥箱中干燥得到花青素固体粉末。
实施例2
向黑玉米穗轴粉碎物制成的培养液中接入10％的菌源液，培养10天后，收集培养液，于4000r/min离心20min，得到粗提液。将粗提液通入反渗透装置，调节进口压力3.5MPa，出口压力3.0MPa，平均通量9.5L/h·m2，进行初步纯化浓缩，得到浓缩液。
将1.5kg DM301干树脂按1：2的径高比平均装入四根1m×2.5m串联成的树脂柱内，加入无水乙醇至树脂层上方15cm处，浸泡24h，用蒸馏水洗涤至流出液无醇味，备用。
将浓缩液通入树脂柱，上样流速2BV/h，持续2.5h后，以4BV 30％的酸性乙醇进行洗脱，洗脱流速2BV/h，将洗脱液通入真空减压浓缩器(温度50℃，蒸汽压力0.07MPa)，回收溶剂，再进行喷雾干燥(126℃)得到花青素粉末。

Claims (6)

1.一种用桦褐孔菌提取黑玉米花青素的方法，包括如下步骤：
(1)黑玉米穗轴预处理
黑玉米穗轴清洗、干燥后，粉碎，过筛，将粉碎物用于后续培养；
(2)菌源液制备
将桦褐孔菌菌株于PDA培养基上28℃培养20-30天，得到菌丝体，于4℃保存；
将上述菌丝体转移至液体培养基，28℃振荡培养5-7天，得到菌源液；
(3)花青素提取
在蒸馏水中加入黑玉米穗轴粉碎物和酵母提取物，高压灭菌后形成培养液；按培养液体积的6-10％接种菌源液，振荡培养7-10天，收集培养液；
将培养液通入反渗透装置，进行初步纯化浓缩，得到浓缩液；
将浓缩液通入树脂柱，以酸性乙醇进行洗脱，得到洗脱液；
将洗脱液通入真空减压蒸馏器，回收溶剂，再对蒸馏物进行干燥即得到花青素粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中粉碎物的粒径大小为60目-100目之间。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)培养液中黑玉米穗轴粉碎物的质量配比为10-20％，酵母提取物的质量配比为0.5-1％。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)中酸性乙醇的pH＝3-4，乙醇浓度为30-45％。
5.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)中树脂柱采用DM301树脂。
6.根据权利要求5所述的方法，步骤(3)中树脂柱的径高比为1：8。
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