CN118028383A - 一种利用植物诱导子促进丝状真菌大麻二酚（cbd）合成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用植物诱导子促进丝状真菌大麻二酚(CBD)合成的方法，本发明中所述丝状真菌菌株为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)XG4‑2，具有CBD合成功能，其在保藏中心的保藏编号为CGMCC 40476。本发明提供了来源于汉麻植物愈伤组织细胞及其提取物作为诱导子显著提高丝状真菌中CBD含量的方法。通过将不同方式处理后的汉麻愈伤组织与内生真菌XG4‑2共同发酵培养后CBD产量显著增加，CBD产量可达22.61μg/L～129.8μg/L。该技术显著提升了内生真菌XG4‑2中CBD的合成效率，操作简单，培养周期短，易控制，可规模化发酵生产，具有极大的经济价值和应用前景。

Description

一种利用植物诱导子促进丝状真菌大麻二酚(CBD)合成的 方法

技术领域

本发明涉及生物工程和微生物领域中的一种利用植物诱导子促进丝状真菌大麻二酚(CBD)合成的方法。

背景技术

大麻素是汉麻中一种特有的次生代谢产物，大麻二酚(Cannabidiol，CBD)是植物大麻素的主要成员之一，具有很高的经济与药用价值。CBD在临床上已被证明具有治疗肿瘤、皮肤病、失眠、神经退行性疾病等，同时具有抗炎、抗氧化和抗病毒功能，应用前景广阔。目前大麻素的提取主要来自大麻植物，大麻素合成的组织特异性及受季节和品种限制，加之大麻植物中含有易致幻成分四氢大麻酚(THC)难以去除，影响其在医药、化妆品及功能食品等领域的应用。对于利用植物细胞及微生物细胞异源生产大麻素类化合物是一条具有潜力的途径，目前相关研究主要基于合成生物学及植物基因工程技术，如通过酿酒酵母能够合成大麻素类成分CBGA，但CBGA作为CBDA和THCA的共同前体，可能产生过量的THCA，可能会因毒性作用而引起宿主本身细胞的死亡；而植物细胞工程技术包括汉麻组织微繁殖、农杆菌遗传转化获得转基因植物及毛状根的诱导等，虽有一定进展，但产量十分有限，合成效率低及不稳定性，尚未能实现工业化生产。由于植物内生真菌长期寄生在植物体内，且与植物相互作用，会产生与植物相同或相似的代谢产物，具有合成植物本身的次生代谢产物。同时，植物细胞也具有合成其植株次生代谢产物的潜力。因此，本发明是通过利用汉麻细胞组织作为植物诱导子促进植物的内生真菌XG4-2合成CBD，最终达到提高CBD产量的目的。

发明内容

本发明提供了一种利用植物细胞作为诱导子促进内生真菌XG4-2合成CBD的方法。具体内容如下：1、选取生长状态良好的汉麻愈伤组织作为实验材料(该实验材料保存在东北林业大学生命科学学院细胞生物学科实验室，为经过多种培养基筛选及多次继代获得的愈伤组织材料)，将其接种于已筛选的培养基：含0.4mg/L TDZ+0.2mg/L NAA的MS固体培养基中继代培养7-10d后备用，培养条件为25±1℃，1000-1500Lx，光照16h，黑暗8h。

2、选取生长状态良好的汉麻愈伤组织鲜样，经过冻干处理获得冻干粉或者加入无菌水中超声后获得愈伤组织水提物备用。

3、选取汉麻内生真菌XG4-2为实验菌株(该菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京，保藏编号CGMCC 40476)，活化于PDA(马铃薯固体培养基)培养基上使其生长5-7d，待菌落长满平板，用打孔器(直径0.8cm)在平皿上取3个菌饼，放到含有150mL PDB培养基的三角瓶中培养，培养条件为摇床转速为160rpm/min，培养温度23-25℃。

4、将内生真菌XG4-2培养5-7d后，加入不同方式处理后的汉麻愈伤组织细胞，共培养2d后过滤，去滤液后沉淀于60℃下烘干后称重，测量CBD含量。愈伤组织处理如下：A1：2.0g汉麻愈伤组织鲜样；A2：5.0g汉麻愈伤组织冻干粉；A3：10mL汉麻愈伤组织水提物(2.0g汉麻愈伤组织鲜样放于10mL无菌水中，室温下超声1h)

5、取烘干后的粉末0.2g，加入5mL无水乙醇浸泡过夜，超声1h后，离心取上清蒸干，复溶于1mL甲醇中，0.45μm滤膜过滤，于高效液相色谱中检测产物。高效液相色谱(HPLC)检测条件：流动相为甲醇:水＝78:22，柱温25℃；灵敏度16AUFS；流速1.0mL/min；检测波长210nm，进样20μL。

本发明涉及的培养基及培养条件为：PDA(马铃薯固体培养基)、PDB(马铃薯液体培养基)及MS培养基。常规方法配制后，先调节pH值为7.0，经高压灭菌后使用；高压灭菌是指：在0.15MPa，121℃下灭菌20min。培养条件为23-25℃。

本发明包含以下有益效果：

通过将不同处理后的汉麻愈伤组织与内生真菌XG4-2共同发酵培养后CBD含量显著增加：加入了汉麻愈伤组织水提取物时XG4-2菌丝中的CBD产量达到最高，为129.8μg/L，是XG4-2纯菌对照的150.6倍；当添加了愈伤组织冻干粉时，CBD产量为68.9μg/L，是XG4-2纯菌对照的81.0倍；当加入了愈伤组织鲜样时，CBD产量为22.61μg/L，是纯菌对照的22.6倍。该技术显著提升了内生真菌XG4-2中CBD的合成效率，操作较为简单，培养周期短，易控制，可规模化发酵生产，具有极大的经济价值和应用前景。

本发明中涉及的真菌菌株保藏说明

菌种名称：镰刀菌

拉丁名：Fusarium sp.

菌株编号：XG4-2

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏日期：2023年1月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.40476

附图说明

图1：汉麻愈伤组织细胞

图2：CBD含量液相色谱检测图(A：CBD标准品，B：XG4-2纯菌发酵，C：XG4-2与愈伤组织鲜样共培养，D：XG4-2与愈伤组织冻干粉共培养，E：XG4-2与愈伤组织水提物共培养)

图3：不同处理下真菌XG4-2中CBD含量差异分析(CK为XG4-2纯菌发酵，T1：XG4-2与愈伤组织鲜样共培养，T2：XG4-2与愈伤组织冻干粉共培养，T3：XG4-2与愈伤组织水提物共培养)

具体实施方式

1、汉麻愈伤组织的诱导培养

(1)选取生长状态良好的汉麻愈伤组织作为实验材料(来源于本课题组保存)，将其接种于添加了0.4mg/L TDZ+0.2mg/L NAA的MS固体培养基中进行诱导培养7-10d后备用(T1材料来源)，培养条件如下：培养条件为25±1℃，1000-1500Lx，光照16h，黑暗8h。

(2)选取生长状态良好的汉麻愈伤组织鲜样，经过冻干处理，获得冻干粉(T2材料来源)或者新鲜愈伤组织细胞加入无菌水中超声后获得愈伤组织水提物(T3材料来源)。

2、内生真菌XG4-2的活化与发酵

(1)选取汉麻内生真菌XG4-2为实验菌株，活化于PDA培养基上使其生长5-7d，待菌落长满平板，用打孔器(直径0.8cm)在平皿上取3个菌饼，放到含有150mL PDB培养基的三角瓶中培养，培养条件如下：摇床转速为160rpm/min，培养温度23-25℃。

(2)将内生真菌XG4-2培养5-7d后，当菌丝生长量达到最大值后，加入不同方式处理后的汉麻愈伤组织，与内生真菌共培养2d后过滤，去滤液后沉淀于60℃下烘干后称重，使用液相色谱仪检测CBD含量。不同方式处理的愈伤组织具体为：A1：2.0g汉麻愈伤组织鲜样、A2：5.0g汉麻愈伤组织冻干粉、A3：10mL汉麻愈伤组织水提物(取2.0g汉麻愈伤组织鲜样放于10mL无菌水中，室温下超声1h)。

3、CBD含量的测定

(1)取烘干后的粉末0.2g，加入5mL无水乙醇浸泡过夜，超声1h后，离心取上清蒸干，复溶于1mL甲醇中，0.45μm滤膜过滤，于高效液相色谱中检测产物。高效液相色谱(HPLC)检测条件：流动相为甲醇:水＝78:22，柱温25℃；灵敏度16AUFS；流速1.0mL/min；检测波长210nm，进样20μL。

Claims (6)

1.一种利用植物诱导子促进丝状真菌大麻二酚(CBD)合成的方法，其特征在于：所述植物诱导子为汉麻植物细胞及其冻干粉和提取物；所述丝状真菌菌株为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)XG4-2，具有CBD合成功能，其在保藏中心的保藏编号为CGMCC 40476，利用不同方式处理的汉麻愈伤组织细胞可以显著促进丝状真菌XG4-2中CBD含量提高。

2.权利要求1中所述丝状真菌菌株来源于汉麻内生真菌菌株XG4-2，为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)，具有CBD合成功能。

3.权利要求1中所述植物诱导子为汉麻植物愈伤组织细胞，汉麻细胞冻干粉及汉麻愈伤组织细胞提取物。

4.权利1中所述，汉麻植物细胞培养条件为含0.4mg/L NAA和0.2mg/L TDZ的MS培养基中培养7～10d。

5.权利1中所述，将内生真菌XG4-2培养5-7d后，加入不同方式处理后的汉麻愈伤组织，共培养2d。

6.权利1中所述，不同方式处理的愈伤组织细胞包括汉麻愈伤组织鲜样或汉麻愈伤组织冻干粉或汉麻愈伤组织提取物。