CN106434366B - 高产洛伐他汀米曲霉Ao-57菌株和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产高产洛伐他汀（Lovastatin）的米曲霉（Aspergillus oryzae）Ao‑57菌株和用途。米曲霉Ao‑57菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015674，保藏日期为：2015年11月11日。本发明所筛选的米曲霉（Aspergillus oryzae）Ao‑57菌株，具有高产Lovastatin、生长快、产孢量大、培养简单等优良特性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产高产洛伐他汀(Lovastatin)的米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株和用途。
背景技术
丝状真菌具有十分丰富的次级代谢产物合成能力，在医药上常用的抗生素如青霉素、头孢霉素、灰黄霉素、降血脂药物洛伐他汀等都是由丝状真菌产生的代谢产物。曲霉属(Aspergillus)作为丝状真菌的一类在工业生产中发挥着重要作用。
米曲霉(Aspergillus oryzae)是曲霉属中一种在食品工业中可以安全使用的发酵菌种，在东方传统食品发酵工业的使用已经有上千年的历史，是中国传统食品豆酱和酱油生产的主要菌种。在日本除了用来生产酱油和豆酱之外，米曲霉还可以用来生产米酒。在这些食品的发酵过程中，米曲霉分泌大量的糖化酶和蛋白酶，这些酶可以将复杂的发酵底物降解为糖和氨基酸等小分子并被其他微生物吸收利用；这样增加了发酵产品的风味，提高了产品的营养价值。米曲霉已经被美国食品药物管理机构列入安全使用的菌种，这种安全性也被世界卫生组织认可。
1980年，Alberts等从土曲霉(Aspergillus terreus)中提取到命名为Lovastatin(洛伐他汀)的化合物。1982年，Paulus等研究了Lovastatin及其类似物在家兔体内的降胆固醇活性。1987年，美国Merck公司经FDA批准，率先推出人类历史上第一个羟甲基戊二酞辅酶A还原酶抑制剂Lovastatin，被认为是降血脂药物研究进展的一个里程碑。自此，微生物发酵生产Lovastatin的研究取得了长足的进步。
国内从20世纪90年代初期开始对Lovastatin类物质进行研究，但Lovastatin类药物是一类重要的聚酮类化合物，因具有复杂的结构而难以通过合成的方法来进行大规模生产，而美国和日本等国家己通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和发酵工艺。因此，选育出稳定高产Lovastatin的菌种显得非常的迫切，也是Lovastatin工业化生产的基本保障。
发明内容
针对生产上缺乏Lovastatin优良工业菌株的问题。本发明的目的是提供1株高产Lovastatin米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株和发酵生产Lovastatin的方法。
本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2015674，保藏日期为：2015年11月11日。
本发明从不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、空气、有机质等)中分离纯化获256株曲霉属(Aspergillus)纯菌株；经筛选获1株高产Lovastatin编号为Ao-57的曲霉菌株(附图1)，该菌株分离自自然发酵的黄豆；根据形态特征和ITS rDNA基因序列，鉴定Ao-57菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)(附图7)。
米曲霉Ao-57菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落生长较快，质地疏松，初期为白色绒毛状，后变为黄褐色，背面淡黄色。培养15d菌落直径达80mm(附图2)；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm～8μm的分支状；分生孢子头放射状，直径100μm～150μm；分生孢子梗长短不一；顶囊烧瓶形，直径50μm～60μm，表面近于光滑；小梗一般为单层，瓶梗15～25μm×5.0～6.5μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上(附图3，图4)；分生孢子球形或近球形，大小8.0～9.0μm×6.5～7.5μm，表面近于光滑(附图5)。
ITS rDNA基因序列分析结果表明，其长度为568bp(附图6)，与米曲霉(Aspergillus oryzae)相似度最高，为99％(附图7)。根据Ao-57菌株的形态特征和ITSrDNA基因序列，结合曲霉属(Aspergillus)分种检索表，将Ao-57菌株鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae)。
米曲霉Ao-57菌株具有高产Lovastatin、生长速度快、产孢量多、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.0～5.5，培养温度为28℃条件下，Ao-57菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，发酵100h～144h，Lovastatin产量可达320mg/L～350mg/L(附图8)；用制备型高效液相分离纯化发酵液中的Lovastatin，用核磁共振波谱技术对发酵液中Lovastatin提取物进行鉴定，结果表明提取物结构与Lovastatin准品一致。米曲霉在食品药品生产中已获得了长期的实践证明，曲霉Ao-57菌株可为Lovastatin的生产提供优良菌种。
本发明米曲霉Ao-57菌株可用于发酵生产Lovastatin。
米曲霉Ao-57菌株生产洛伐他汀的方法，该方法包括以下的步骤：
1)用接种针挑取少量菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2～4d；
2)取菌饼接种于一级种子培养液中，摇床培养2～4d，制得一级种子液；
3)在二级种子培养液中，按5～20％加入一级种子液，摇床培养1～3d成二级种子液；
4)发酵罐发酵培养液中按10～300％接入二级种子液，发酵时间为100h～144h。
作为优选，步骤4)发酵培养液初始pH为5.0～5.5，培养温度为25～30℃。
作为优选，PDA培养基由以下组分构成：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂粉2.0％、水1L、pH 5.0～5.5。
作为优选，种子培养液由以下组分构成：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L、pH 5.0～5.5。
作为优选，发酵培养液由以下组分构成：马铃薯20％、葡萄糖2％、玉米粉3％、牛肉膏1.0％、水1L、pH 5.0～5.5。
发酵培养结束后，取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达320mg/L～350mg/L(附图8)。
本发明所筛选的米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株，具有高产Lovastatin、生长快、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.0～5.5，培养温度为28℃条件下，Ao-57菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵100h～144h，Lovastatin产量可达320mg/L～350mg/L。
附图说明
图1 50株代表性曲霉菌株发酵液中Lovastatin和产量。
图2米曲霉Ao-57菌株PDA培养基上培养15d菌落正面和背面。
图3米曲霉Ao-57菌株PDA培养基上培养5d分生孢子头的显微特征(100X)。
图4米曲霉Ao-57菌株分生孢子头显微特征(呈烧瓶状，400X)。
图5米曲霉Ao-57菌株分生孢子显微特征(400X)。
图6米曲霉Ao-57菌株ITS rDNA基因序列(568bp)。
图7基于16株曲霉属ITS rDNA基因序列建立的Ao-57菌株系统发育树。
图8米曲霉Ao-57菌株在5L发酵罐中的生物量和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
图9米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin标准品(B)核磁共振峰谱图。
图10米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin提取物(A)核磁共振峰谱图。
保藏声明
米曲霉Ao-57菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2015674，保藏日期为：2015年11月11日。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1 米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株的分离、筛选和鉴定
1培养基
①PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂粉2.0％、水1L、pH 5.0～5.5。用于曲霉菌株的分离、纯化、活化和鉴定。
②种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L、pH 5.0～5.5。用于产Lovastatin曲霉各菌株的种子培养。
③发酵培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、玉米粉3％、牛肉膏1.0％、水1L、pH5.0～5.5。用于发酵产Lovastatin曲霉各菌株的筛选。
2实验方法
2.1曲霉菌株的分离纯化
从不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，28℃培养1d，待白色绒毛状菌丝长出后，用牙签取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将获得的曲霉纯菌株编号后保存于25％甘油中，置于-20℃冰箱保藏备用。
2.2高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法(HPLC)检测曲霉各菌株发酵液中Lovastatin产量筛选。曲霉各保存菌株28℃PDA平板活化培养3d后；用打孔器取2菌饼(直径8mm)转接种于种子培养液中，28℃、200r/min摇床培养2d作为种子液；按10％接入种子液至装有100mL发酵培养液的三角瓶中，28℃、200r/min摇床培养4d，发酵液用于Lovastatin的检测。
取上述发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastatin产量，筛选高产Lovastatin的曲霉菌株。
2.3 Ao-57菌株的形态观察和鉴定
用镊子挑取少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平板上，活化培养3d；取1菌饼(直径8mm)接种于新的PDA培养基平板上，28℃，培养3d，显微镜观察Ao-57菌株的生长、菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征，并拍照。提取Ao-57菌株的基因组DNA，扩增ITS rDNA基因，送上海生物工程公司测序。
3实验结果
3.1曲霉菌株的分离纯化和高产Lovastatin菌株的筛选
通过分离纯化从各地不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)中分离纯化共获256株曲霉纯菌株。
利用高效液相(HPLC)法对256株曲霉纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测，结果表明不同曲霉菌株Lovastatin产量存在显著差异(附图1)。经筛选获1株Lovastatin产量较高的曲霉菌株，编号为Ao-57菌株，Lovastatin产量为175.74mg/L，Ao-57菌株分离自自然发酵的黄豆。
3.2曲霉Ao-57菌株的形态特征和鉴定结果
曲霉Ao-57菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落生长较快，质地疏松，初期为白色绒毛状，后变为黄褐色，背面淡黄色。培养15d菌落直径达80mm(附图2)；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm～8μm的分支状；分生孢子头放射状，直径100μm～150μm；分生孢子梗长短不一；顶囊烧瓶形，直径50μm～60μm，表面近于光滑；小梗一般为单层，瓶梗15～25μm×5.0～6.5μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上(附图3，图4)；分生孢子球形或近球形，大小8.0～9.0μm×6.5～7.5μm，表面近于光滑(附图5)。
ITS rDNA基因序列分析结果表明，其长度为568bp(附图6)，与米曲霉(Aspergillus oryzae)相似度最高，为99％(附图7)。根据Ao-57菌株的形态特征和ITSrDNA基因序列，结合曲霉属(Aspergillus)分种检索表，将Ao-57菌株鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae)。
实施例2 米曲霉(Aspergillus oryzae)Ao-57菌株在5L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产生规律
1菌株：米曲霉Ao-57菌株。
2培养基
①PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂粉2.0％、水1L、pH 5.0～5.5。用于曲霉菌株的活化。
②一级种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L、pH 5.0～5.5。用于曲霉Ao-57菌株的一级种子培养。
③二级种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L、pH 5.0～5.5。用于曲霉Ao-57菌株二级种子培养。
④发酵培养液：乳糖6％、甘油2％、玉米粉3％、蛋白胨1.5％、酵母膏0.5％、MgSO4 ●7H2O0.1％、KH2PO4 0.1％、NaCl 0.2％、水1L、pH 5.0～5.5。用于曲霉Ao-57菌株发酵生产Lovastatin。
3实验方法
3.1米曲霉Ao-57菌株的培养
用接种针挑少量Ao-57菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取平皿中2菌饼(直径8mm)接种于PD培养液中，摇床培养3d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10％接入一级种子液，200r/min摇床培养2d成二级种子液；在5L发酵罐发酵培养液中按20％接入二级种子液进行发酵培养。
3.2米曲霉Ao-57菌株菌丝干重的测定
1.5mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干，称取空离心管质量为m；每管吸取1mL培养液，在4℃，10000r/min离心10min，弃上清；加无菌蒸馏水洗3次，10000r/min离心10min，弃上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，称取质量为M；菌丝干重质量为M-m。每隔4h取1mL Ao-57菌株发酵液测定菌丝干重。以发酵时间为横坐标，Ao-57菌株菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。
3.3米曲霉Ao-57菌株发酵过程中Lovastatin产量分析
每隔4h取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以发酵时间为横坐标，Ao-57菌株的Lovastatin产量为纵坐标，绘制Ao-57菌株Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
3.4米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin的分离纯化和鉴定
米曲霉Ao-57菌株5L发酵罐发酵108h～144h，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin成分，与滤液混合；用制备型高效液相分离纯化Lovastatin，蒸干后得晶体；将晶体样品分别溶于甲醇和氘代氯仿中，核磁共振波谱技术分析鉴定。
4实验结果
4.1米曲霉Ao-57菌株的生长曲线
每隔4h取样测定菌丝干重，Ao-57菌株生长曲线见图8。Ao-57菌株0～20h生长速度慢，为迟缓期；24h～68h快速生长，菌体量大增，为对数生长期；发酵至72h后，长势趋于平缓，菌体量达到最高，为稳定生长期，菌丝干重达305.19g/L；108h后出现泡沫，进入衰亡期。
4.2米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线
每隔4h取样用HPLC法测定Ao-5菌株发酵液Lovastatin产量，Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图8，发酵至108h后，发酵液中Lovastatin产量基本稳定，最大值为350.09mg/L。
4.3米曲霉Ao-57菌株发酵液中Lovastatin的提取物及其鉴定
用制备型高效液相分离纯化发酵液中的Lovastatin，经旋转蒸发仪蒸干后得到微黄色Lovastatin提取物晶体；用核磁共振波谱技术对Lovastatin标准品和发酵液中Lovastatin提取物分析比对，结果表明Lovastatin提取物结构(图10)与Lovastatin标准品(图9)一致，纯度较高。
Claims (8)
1.米曲霉（Aspergillus oryzae）Ao-57 菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015674，保藏日期为：2015 年11 月11 日。
2.根据权利要求1 所述的米曲霉Ao-57 菌株，其特征在于该菌株的形态特征如下：PDA培养基上的菌落生长较快，质地疏松，初期为白色绒毛状，后变为黄褐色，背面淡黄色；培养15 d 菌落直径达80 mm；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6 μm~8 μm 的分支状；分生孢子头放射状，直径100 μm ~150 μm；分生孢子梗长短不一；顶囊烧瓶形，直径50μm ~60 μm，表面近于光滑；小梗一般为单层，瓶梗15~25 μm ×5.0~6.5 μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上；分生孢子球形或近球形，大小8.0~9.0 μm×6.5~7.5 μm，表面近于光滑。
3.权利要求1 所述的米曲霉Ao-57 菌株用于生产洛伐他汀（Lovastatin）的应用。
4.权利要求1 所述的米曲霉Ao-57 菌株生产洛伐他汀的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）用接种针挑取少量菌丝，转接于PDA 培养基平皿中，活化培养2~4d；
2）取菌饼接种于一级种子培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子液；
3）在二级种子培养液中，按重量百分比计，将5~20%加入一级种子液，摇床培养1~3d 成二级种子液；
4）发酵罐发酵培养液中，按重量百分比计，将10~300%接入二级种子液，发酵时间为100h~144 h。
5.根据权利要求4所述的米曲霉Ao-57 菌株生产洛伐他汀的方法，其特征在于步骤4）发酵培养液初始pH 为5.0~5.5，培养温度为25~30℃。
6.根据权利要求4所述的米曲霉Ao-57 菌株生产洛伐他汀的方法，其特征在于PDA 培养基按重量百分比计由以下组分构成：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%、水1 L、pH 5.0~5.5。
7.根据权利要求4 所述的米曲霉Ao-57 菌株生产洛伐他汀的方法，其特征在于种子培养液按重量百分比计由以下组分构成：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1 L、pH 5.0~5.5。
8.根据权利要求4 所述的米曲霉Ao-57 菌株生产洛伐他汀的方法，其特征在于发酵培养液
按重量百分比计由以下组分构成：马铃薯20%、葡萄糖2%、玉米粉3%、牛肉膏1.0%、水1L、pH 5.0~5.5。
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