CN104277985A - 红曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株及其用于Monacolin K制备中应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术微生物领域，涉及一株液体发酵生产MonacolinK紫色红曲霉M-24菌株、用途和制备方法。红曲霉（ Monascuspurpureus ）M-24菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2014414，保藏日期为2014年9月14日。紫色红曲霉M-24菌株具有高产MonacolinK、生长速度快、产孢量多等优良性状。通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，MonacolinK产量可达170mg/L～210mg/L。

Description

红曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株及其用于Monacolin K制备中应用

技术领域

本发明属于生物技术微生物领域，涉及一株液体发酵生产Monacolin K紫色红曲霉M-24菌株、用途和制备方法。 

背景技术

红曲霉（Monascus）是我国重要的食用、药用真菌，是传统中药红曲的基原菌，也是制作传统饮品红曲酒的主要菌种，在我国已有上千年的应用历史。红曲霉作为一种腐生真菌，最适生长温度为25℃~30℃，最适pH为3.5~5.0，能够以糖类、有机酸、醇类为碳源，以硝态氮、氨态氮和有机氮为氮源。其传统用途主要是作为食品发酵剂、防腐剂、着色剂、增香剂以及用作中药配伍。红曲霉在生长代谢过程中能分泌产生多种生理活性物质，莫纳可林K（Monacolin K）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、红曲色素、麦角固醇、蛋白酶等，均引起了国内外研究学者的广泛关注。 

1979年，日本远藤章从红色红曲霉（Monascus ruber）发酵液中分离得到一种可抑制体内胆固醇合成的活性物质，命名为Monacolin K。时隔1年，美国Albert等亦从土曲霉（Aspergillus terrers）中发现了相似的物质，并命名为Mevinolin，现称Lovastatin（洛伐他汀）。此后发现Monacolin K存在于包括侧耳属（Pleurotus）、茎点菌属（Phoma）、青霉属（Penicillium）在内的多种真菌中。这一连串的发现引起了世界的轰动，掀起了红曲霉降酯类产物的研究热潮。Monacolin K的药理作用是通过特异性抑制胆固醇合成系统中的限速酶HMG-CoA（3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A）还原酶活性；因Monacolin K的结构与HMG-CoA结构相似，所以Monacolin K对HMG-CoA还原酶具有竞争性抑制作用，从而减少机体内胆固醇的含量。这类物质在血液中浓度只要达到0.001 μg/mL~0.005 μg/mL就可以使胆固醇的合成受阻。 

近年来，心血管疾病的发病率和死亡率在全球均已跃居首位；主要是因为血液中积聚了过多的胆固醇；红曲霉的代谢产物Monacolin K是各国公认的降低胆固醇的理想药剂，具有高效、低毒、安全的特点。但Monacolin K的产量却一直难以大幅度提高，红曲霉菌种缓慢的生长速度和较少的产孢量，给红曲霉的工业化生产Monacolin K造成了极大的障碍。因此，选育出稳定高产Monacolin K的菌种显得非常的迫切，也是Monacolin K工业化生产的基本保障。 

发明内容

 针对市场上Monacolin K需求日益增长，而传统使用红曲霉菌株进行发酵生产Monacolin K产量较低、生长缓慢、产孢量少等的问题。本发明的目的是提供一株高产Monacolin K紫色红曲霉M-24菌株。紫色红曲霉M-24菌株具有高产Monacolin K、生长速度快、产孢量多等优良性状。本发明的另外一个目的是提供采用上述的紫色红曲霉菌株发酵和制备Monacolin K的方法。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

紫色红曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2014414，保藏日期为2014年9月14日。 

该菌株在PDA培养基上25℃培养7 d后，菌落直径达到24 mm，平坦，气生菌丝稀疏短小，丝绒状，大部分呈橘红色，边缘呈白色；菌落初期为白色绒毛状，4 d后中心菌丝开始变红色，培养25 d后色泽变为橘红色，菌落直径达到65 mm ；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径3~7 μm的分支状，有深浅不一的红褐色色素颗粒；分生孢子球形或倒梨形，单生或成链，直径6~8 μm；闭囊壳呈球形，囊内孢子可见，子囊孢子椭球形，直径6~7 μm，透明淡红色或无色。 

本发明从自然发酵红曲米中筛选到一株红曲霉M-24菌株，该菌株具有高产Monacolin K的特点，可用于Monacolin K工业化生产菌株。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

一种Monacolin K的制备方法，该方法采用所述的红曲霉M-24菌株发酵制得。

作为优选，所述的发酵有机碳源采用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一种或多种，氮源采用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨中的一种或多种。 

作为最优选，所述的有机碳源为麦芽糖，氮源为酵母粉。 

作为优选，所述的发酵的温度范围为28℃~36℃，pH范围为4.0~5.0。 

作为优选，所述的发酵的方法如下： 

1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养7~15 d；

2）将平皿中菌饼接种于液体PD培养基中，摇床培养4 d ~6 d，制得一级种子；

3）在混合培养液中，加入一级种子，200 r/min摇床培养成二级种子；

4）在发酵罐中接种二级种子，发酵时间为130 h ~160 h。

作为优选，所述的发酵培养完后的提取方法如下： 

1）发酵培养完后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中成分，与滤液混匀，调混合液pH2.5~3.5，过滤三次，取滤液，加热抽滤获澄清混合液；

2）分液漏斗取上层乙酸乙酯，30~50℃旋蒸至干；

3）加入苯萃提，过滤弃沉淀并以重量比40~60:1的比例加入重量百分比浓度为2~10%的Na2CO3两次，再以重量比40~60:1的比例加入0.1~0.3 M NaCl一次，摇床震荡1~3 h；

4）分液漏斗取水层，调pH2.5~3.5；以重量比40~60:1的乙酸乙酯萃取两次去有机层混合蒸干得Monacolin K 晶体。

紫色红曲霉M-24菌株具有高产Monacolin K、生长速度快、产孢量多等优良性状。通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，Monacolin K产量可达170 mg/L ~210 mg/L。红曲霉在食品药品生产中获得了长期的实践证明，红曲霉多数种都是较安全的，被FDA认为是GRAS（generally recognized as safe）级别的食品添加剂，在市售的药品中，Monacolin K于20世纪90年代直接开发为治疗高血压的药物，其生产和应用均不存在安全隐患，能直接应用于食品药品。 

附图说明

图1 紫色红曲霉M-24菌株在PDA上培养7 d（左）、25面d（右）菌落正面。 

图2 紫色红曲霉M-24菌株的菌丝及分生孢子显微特征（400X）。 

图3 紫色红曲霉M-24菌株的闭囊壳显微特征（400X）。 

图4 基于ITS序列建立的红曲霉属系统发育树 。 

图5 Monacolin K粗提物有机溶液（左）与蒸干后得到的晶体（右）。 

图6 Monacolin K粗提物HPLC色谱图，注：出峰时间6.989 min处为Monacolin K，峰面积为8459.34 mAU*s。 

图7 Monacolin K提取物核磁共振氢谱图。 

生物保藏声明 

紫色红曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2014414，保藏日期为2014年9月14日。 

具体实施方式

下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。 

实施例1紫色红曲霉M-24菌株的分离、纯化和筛选

1.1 培养基

（1）PDA培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5%，水，pH自然。

（2）一级种子培养基PD：马铃薯20%，葡萄糖2%，水，pH6.0。 

（3）二级种子培养基：葡萄糖6%，蛋白胨2 %，KH₂PO4 0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，NaNO₃ 0.2%，水，pH 6。 

（4）发酵培养基：甘油9%、大米水解液2%、大豆蛋白胨3%，酵母膏0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，NaNO₃ 0.2%，KH₂PO4 0.1%，ZnSO₄ 0.2%，水，pH4.0。 

分离、纯化和筛选

紫色红曲霉M-24菌株分离自自然发酵的红曲米。将红曲米0.5 g用研钵研磨成粉状，取少量均匀的洒入PDA培养基表面，30℃培养48 h，待白色绒毛状菌丝长出后，挑取少许菌丝转接于另一PDA培养平板上继续培养，培养1 W后重复上述分离纯化操作，经三次纯化后即可得到得性状均一的红曲霉菌株。将筛选获得的红曲霉菌株保存于25%甘油并置于4 ℃冰箱中，编号备用。菌种使用之前需先活化，250 mL三角瓶装入50 mL PD培养液，接入大小一致的菌饼，32℃摇床（200 r/min）培养5 d。

鉴定

该菌株在PDA培养基上25℃培养7 d后，菌落直径达到24 mm，平坦，气生菌丝稀疏短小，丝绒状，大部分呈橘红色，边缘呈白色；菌落初期为白色绒毛状，4 d后中心菌丝开始变红色，培养25 d后色泽变为橘红色，菌落直径达到65 mm （附图1）。显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径3~7 μm的分支状，有深浅不一的红褐色色素颗粒；分生孢子球形或倒梨形，单生或成链，直径6~8 μm；闭囊壳呈球形，囊内孢子可见，子囊孢子椭球形，直径6~7 μm，透明淡红色或无色（附图2、图3）。生理生化实验表明，该菌株的适宜生长温度范围为28℃~36℃，最适pH范围为4.0~5.0。能够很好的利用各种有机碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、番薯粉等，其中最适生长碳源为麦芽糖；在氮源利用方面，可利用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵等无机氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多种有机氮源，以酵母粉为氮源的培养基中生长最好。ITS序列分析结果表明，与紫色红曲霉的相似度高达99%（附图4），根据M-24菌株形态特征、显微特征、ITS序列，结合李钟庆和郭芳红曲霉分种检索表，将M-24菌株鉴定为紫色红曲霉（Monascus purpureus）。

实施例2 发酵法生产和制备Monacolin K的工艺流程

紫色红曲霉（Monascus purpureus）M-24菌株筛选自自然发酵的红曲米，可用于发酵生产Monacolin K。取紫色红曲霉M-24菌株保存菌种，在无菌条件下，用接种针挑少量菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养7~15 d；将平皿中菌饼接种于液体PD培养基中，摇床培养4 d ~6 d，制得一级种子；在混合培养液中，加入一级种子，200 r/min摇床培养成二级种子；在发酵罐中接种二级种子，发酵时间为130 h ~160 h；发酵培养完后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中成分，与滤液混匀。发酵罐接种量为6%~10%（V/V），发酵罐转速为200 r/min ~250 r/min，温度为26℃，通气量80~120 L/h，罐压0.1~0.5 MPa。经高效液相法（HPLC）检测Monacolin K产量达170 mg/L~210 mg/L （附图6）。

调上述混合液pH 3.0，过滤三次，取滤液，加热抽滤获澄清混合液；分液漏斗取上层乙酸乙酯，45℃旋蒸至干。加入苯萃提，过滤弃沉淀并以50:1的比例加入5 %的Na₂CO₃两次，再以50:1的比例加入0.2M NaCl一次，摇床震荡2 h。分液漏斗取水层，调pH3.0。以50:1的乙酸乙酯萃取两次去有机层混合蒸干得晶体（附图5），经过核磁共振氢谱实验表明提取物纯度较高（附图7），可用于红曲保健品与药品的制备。 

Claims (10)

1.红曲霉（Monascus purpureus）M-24菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014414，保藏日期为2014年9月14日。

2.根据权利要求1所述的红曲霉M-24菌株，其特征在于该菌株在PDA培养基上25℃培养7 d后，菌落直径达到24 mm，平坦，气生菌丝稀疏短小，丝绒状，大部分呈橘红色，边缘呈白色；菌落初期为白色绒毛状，4 d后中心菌丝开始变红色，培养25 d后色泽变为橘红色，菌落直径达到65 mm ；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径3~7 μm的分支状，有深浅不一的红褐色色素颗粒；分生孢子球形或倒梨形，单生或成链，直径6~8 μm；闭囊壳呈球形，囊内孢子可见，子囊孢子椭球形，直径6~7 μm，透明淡红色或无色。

3.权利要求1所述的红曲霉M-24菌株用于Monacolin K制备中应用。

4.一种Monacolin K的制备方法，其特征在于该方法采用权利要求1所述的红曲霉M-24菌株发酵制得。

5.根据权利要求4所述的一种Monacolin K的制备方法，其特征在于发酵有机碳源采用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一种或多种，氮源采用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的一种Monacolin K的制备方法，其特征在于有机碳源为麦芽糖，氮源为酵母粉。

7.根据权利要求4或5或6所述的一种Monacolin K的制备方法，其特征在于发酵的温度范围为20℃~36℃，pH范围为4.0~5.0。

8.根据权利要求4或5或6所述的一种Monacolin K的制备方法，其特征在于发酵的方法如下：

1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养7~15 d；

2）将平皿中菌饼接种于液体PD培养基中，摇床培养4 d ~6 d，制得一级种子；

3）在混合培养液中，加入一级种子，200 r/min摇床培养成二级种子；

4）在发酵罐中接种二级种子，发酵时间为130 h ~160 h。

9.根据权利要求4或5或6所述的一种Monacolin K的制备方法，其特征在于发酵培养完后的提取方法如下：

1）发酵培养完后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中成分，与滤液混匀，调混合液pH2.5~3.5，过滤三次，取滤液，加热抽滤获澄清混合液；

2）分液漏斗取上层乙酸乙酯，30~50℃旋蒸至干；

3）加入苯萃提，过滤弃沉淀并以重量比40~60:1的比例加入重量百分比浓度为2~10%的Na₂CO₃两次，再以重量比40~60:1的比例加入0.1~0.3 M NaCl一次，摇床震荡1~3 h；

4）分液漏斗取水层，调pH2.5~3.5；以重量比40~60:1的乙酸乙酯萃取两次去有机层混合蒸干得Monacolin K 晶体。

10.根据权利要求8所述的一种Monacolin K的制备方法，其特征在于发酵培养完后的提取方法如下：

1）发酵培养完后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中成分，与滤液混匀，调混合液pH2.5~3.5，过滤三次，取滤液，加热抽滤获澄清混合液；

2）分液漏斗取上层乙酸乙酯，30~50℃旋蒸至干；

3）加入苯萃提，过滤弃沉淀并以重量比40~60:1的比例加入重量百分比浓度为2~10%的Na₂CO₃两次，再以重量比40~60:1的比例加入0.1~0.3 M NaCl一次，摇床震荡1~3 h；

4）分液漏斗取水层，调pH2.5~3.5；以重量比40~60:1的乙酸乙酯萃取两次去有机层混合蒸干得Monacolin K 晶体。