CN110172409A - 一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域,公开了一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株MH‑02,其分类命名为Shiraia bambusicola,保藏编号为GDMCC No.60438。使用该菌株转化甘油为高附加值的竹红菌甲素,转化率高,为甘油的综合利用提供了一条环保和高效的途径。

Description

一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,特别涉及一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株及其应用。
背景技术
竹黄,又名竹花、竹赤团子、竹三七等,具有止咳祛痰、散瘀通经、活血止痛、恢复组织机能、增强体质、补中益气和镇静的作用,是我国一种稀有的真菌中药材。竹黄是竹黄菌(Shiraia bambusicola)的子座。竹黄菌隶属于肉座菌科的竹黄属,特异性地寄生在短穗竹属种类的嫩枝上,其子座常见于衰败的竹林中。
竹黄子座中核心药用成分是一系列具有光敏活性的苝醌色素,主要包括竹红菌甲素(Hypocrellin A)、竹红菌乙素(Hypocrellin B)、竹红菌丙素(Hypocrellin C)、竹红菌丁素(Hypocrellin D)四种。其中,竹红菌甲素含量最高。竹红菌甲素和乙素在一定的条件下可以互相转化,与丙素互为同分异构体。竹红菌甲素具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗炎、利尿保肝、抗癌等活性。研究表明,竹红菌甲素可用来杀伤人源的Hela细胞、黑色素瘤B-16细胞及Hce-8693盲肠癌细胞以及抑制HIV病毒。临床上,以竹红菌甲素为主要原料的药膏,已经用于治疗妇科外阴白色病变和瘢痕疙瘩等疾病。竹红菌甲素还可以作为食品的防腐剂以及保护剂。天然竹红菌甲素主要提取自竹黄菌和竹红菌(Hypocrella bambusae)的子座,但是其产量稀少且不稳定,季节性强,无法满足医药、食品等市场对色素日益增长的需求。竹红菌色素的生产方法还有人工化学合成法。化学从头合成一般要经历20几步反应,合成和分离的成本过高。发酵法具有绿色、产物分离简单和不受季节影响等的优点,是生产竹红菌色素最有前景的方法之一。
菌种和发酵工艺控制是发酵生产竹红菌色素的核心技术。目前发酵法使用的菌种为分离自竹黄菌子座的菌丝体。发酵竹黄菌株产竹红菌色素的代表性技术有如表1所示:
表1发酵竹黄菌株产竹红菌色素的代表方法
[1]章明晔.光质对竹黄菌生长及竹红菌素生产的调控研究[D].苏州大学,2016.
[2]胡明明.苝醌类色素液态发酵及其分离纯化的研究
[3]梁晓辉.竹黄菌发酵产竹红菌素的研究[D].江南大学,2009.
根据现有报道分析可知,竹黄菌丝体的生理性状、分泌色素的能力受到子座的产地、分离的子座部位和子座成熟度的影响。竹黄菌株之间的菌丝体形态、生长速度、产色素的性能具有明显的差异。同时竹黄菌丝体多次转代易出现生长和色素分泌退化的现象。因此,提供生长迅速、高产色素和性能稳定的菌丝体并实现其在液体发酵中的应用,对生产竹红菌甲素具有重要的意义。
生物燃料是全球绿色燃料使用的趋势。随着生物柴油的产量逐年增加,每年将产生大量的甘油副产物,这些甘油存在二次污染和综合利用的难题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株。
本发明的另一目的在于提供上述高产竹红菌甲素的竹黄菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株MH-02,为竹黄无性型菌株,其分类命名为Shiraia bambusicola.保藏编号为GDMCC No.60438,于2018年8月22日保藏于位于中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼的广东省微生物菌种保藏中心。
所述的竹黄菌株的主要代谢产物为竹红菌甲素。
上述的高产竹红菌甲素的竹黄菌株在生产竹红菌甲素中的应用。
一种制备竹红菌甲素的方法,包括如下步骤:
(1)取所述的高产竹红菌甲素的竹黄菌株,培养活化,制备种子液;
(2)将所述的种子液接入发酵培养基进行发酵,获得菌丝体;对菌丝体处理;
(3)从处理后的菌丝体中分离出竹红菌甲素。
步骤(1)中所述的培养活化过程的温度优选为15℃~30℃。
步骤(2)中所述的制备种子液,是将培养活化后的菌株接入种子培养基中,振荡培养制得种子液。
所述的种子培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
所述的振荡培养的条件优选为于130-170rpm的条件震荡培养45-50h。
步骤(2)中所述的发酵优选为液体深层发酵;更优选为液体深层通风发酵。液体深层培养条件下所述的竹黄菌株的主要色素产物为竹红菌甲素。
步骤(2)中所述的发酵的条件优选为130-170rpm的条件震荡培养65-75h。
步骤(2)中所述的发酵的温度优选为26℃~30℃。
步骤(2)中所述的发酵培养基的pH优选为4.0~9.0。
步骤(2)中所述的发酵培养基中的碳源为葡萄糖、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、蔗糖或同类碳源中的至少一种,优选甘油。
步骤(2)中所述的发酵培养基中的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢铵或同类氮源中的至少一种。
步骤(2)中所述的处理的具体步骤如下将菌丝体和抽提液混合,超声处理获得发酵产物。
所述的抽提液优选为二氯甲烷。
所述的超声处理的条件优选为于280-320W处理28-32min。
步骤(3)中所述的竹红菌甲素的分离方法优选为HPLC。
所述的HPLC的色谱柱优选为IntersilODS3C18柱。
所述的HPLC的柱温优选为25-35℃。
所述的HPLC的检测波长467nm。
所述的HPLC的进样量为10μL。
所述的HPLC的流动相为纯甲醇;流速为1mL/min。
所述的HPLC的时间为25min。
本发明相对于现有技术具有但是并不限于如下的优点和技术效果:
天然的竹黄子实体中粗色素的含量为10-15mg/g菌丝体,甲素占总色素含量为65%-80%。使用本发明提供的竹黄菌株生产竹红菌甲素的产率最高可达到20mg/g菌丝体,竹红菌甲素在总色素中的含量为95%以上,明显优于现有技术的竹黄菌株,能够显著降低后续分离纯化的成本。本发明提供的竹黄菌株能够专一性偏好甘油作为高产甲素碳源,而现有的竹黄菌株难以利用甘油作为碳源,或者利用甘油时的转化率较低;本发明利用甘油作为唯一碳源时,竹红菌甲素产率为19.5±2.8mg/g菌丝体,生物转化率为6.0±0.85mg/g碳源,分别是可溶性淀粉、木糖醇、半乳糖、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖的31.4、4.1、3.6、3.1、3.0、2.3、2.2、1.8、1.8倍。使用该菌株转化甘油为高附加值的竹红菌甲素,转化率高,为甘油的综合利用提供了一条环保和高效的途径。
附图说明
图1:菌株在PDA平板上生长120h时的菌落形态图;
图2:菌株5.8SrDNA和内转录间隔区(ITS)的PCR扩增产物的电泳图,其中,M为DNAMarker;
图3:竹红菌甲素标准品的HPLC图;
图4:实施例2发酵结束后菌丝体色素提取物的HPLC图;
图5:实施例3发酵结束后菌丝体色素提取物的HPLC图;
图6:实施例4发酵结束后菌丝体色素提取物的HPLC图;
图7:实施例5发酵结束后菌丝体色素提取物的HPLC图;
图8:实施例6发酵结束后菌丝体色素提取物的HPLC图。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明,下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明。
实施例1
从产自中国浙江的竹黄子实体上分离得到的野生型菌株。
将所述的竹黄菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养。
菌丝形态:菌丝培养初期,菌落为白色,较稀疏,质地疏松,呈绒状;培养6天后,色素开始分泌到胞外,平板背面开始呈现黄褐色;随着培养时间的延长,与培养基相接触菌丝体分泌色素呈现出同心褐色圆圈分布。其菌丝形态特征为:气生菌丝直径23-50μm,具有锁状联合,无分生孢子产生。其中,菌株在PDA平板上生长120h时的外观菌落形态如图1所示。
菌株生理生化特征:可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、甘露醇、半乳糖、可溶性淀粉、纤维素等碳源。菌丝生长状况分别为:旺盛、较稀疏、旺盛、较稀疏、较稀疏、较稀疏、旺盛、较稀疏。对光照敏感,生长受抑制。可生长的pH范围4-9。
对该菌株的基因组DNA进行提取,以提取的DNA为模板,使用ITS5和ITS4引物对5.8S rDNA和内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增和测序,其扩增产物的电泳结果如图2所示;其5.8S rDNA和内转录间隔区的序列如下所示:
TGATTCCTCCCGGGTTTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAAACGTGGTAAAAAGCTTATCTGGACGCCAGTATTCCGGCTTGGACTCGCAAATTGTGCTGCGCTCCAAGGCCAAAATGCCGGCTGCCAATATCTTTAAGGCGAGTCCAGTCGCAGAGGATAGGACAAACACCCAACACCAAGCAGAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAAATATTTTTTTTTTCAGACGCTGATTGCAATTACAATGAGTTTAAGAGATCCTATCGACTGGAAACCCAGCCGAGGAAACATGTAGTACGCAAAAAACATGGGTGCAGACGGGGGCTATATTGCTATAACCCCGTACTACTAGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATT。
其引物的序列如下所示:
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
上述的序列与Shiraia sp.BFM-L31菌株的ITS序列(检索号AB369481)相似度极高,差异仅为0.2%,与文献中已报道高产色素的Shiraia sp.SUPER-H168菌株的ITS序列(检索号EU267793.1)差异为2%。
将该菌株命名为Shiraia bambusicola MH-02,于2018年8月22日在广东省微生物菌种保藏中心进行保藏,其保藏编号为GDMCC No.60438。
实施例2
取PDA平板上培养5天的菌株,打孔接入含有50ml PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)的三角瓶中,置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h,制备种子液。
取2ml种子液接入含有50mL发酵培养基(含有麦芽糖0.9g,牛肉膏0.05g,MgCl20.001g)的三角瓶中,置于摇床中,在温度28℃,转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。
摇瓶培养结束,将菌丝体用超纯水离心洗涤后,真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30mL的比例加入二氯甲烷,30℃下超声提取30min,超声功率为300W。提取物利用HPLC进行分离和鉴定。色谱条件:色谱柱:IntersilODS3C18柱,柱温:30℃,检测波长:467nm,进样量:10μL,流动相为纯甲醇,流速1mL/min,时间为25min,结果如图4所示。
以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考,竹红菌甲素产率为7.49mg/g菌丝体,纯度为92.2%,转化率为2.32mg/g碳源。
实施例3
取PDA平板上培养3天的菌株,打孔接入含有50ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDB培养基的三角瓶中,置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h,制备种子液。
取2ml种子液接入含有50mL发酵培养基(含有葡萄糖1.0克,蛋白胨0.5克,MgCl20.001g)的三角瓶中,置于摇床中,在温度28℃,转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。
摇瓶培养结束,将菌丝体用超纯水离心洗涤后,真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30mL的比例加入二氯甲烷,30℃下超声提取30min,超声功率为300W。提取物利用HPLC进行分离和鉴定。色谱条件:色谱柱:IntersilODS3C18柱,柱温:30℃,检测波长:467nm,进样量:10μL,流动相为纯甲醇,流速1mL/min,时间为25min,结果如图5所示。
以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考,竹红菌甲素产率为14.39mg/g菌丝体,纯度为88.3%,甲素转化率为4.71mg/g碳源。
实施例4
取PDA平板上培养5天的菌株,打孔接入含有50ml PDB培养基的三角瓶中,置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h,制备种子液。
取2ml种子液接入含有50mL发酵培养基(含有蔗糖0.8g,玉米粉0.3g)的三角瓶中,置于摇床中,在温度28℃,转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。
摇瓶培养结束,将菌丝体用超纯水离心洗涤后,真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30mL的比例加入二氯甲烷,30℃下超声提取30min,超声功率为300W。提取物利用HPLC进行分离和鉴定。色谱条件:色谱柱:IntersilODS3C18柱,柱温:30℃,检测波长:467nm,进样量:10μL,流动相为纯甲醇,流速1mL/min,时间为25min,结果如图6所示。
以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考,竹红菌甲素产率为5.57mg/g菌丝体,纯度为86.9%,转化率为1.27mg/g碳源。
实施例5
取PDA平板上培养3天的菌株,打孔接入含有50ml PDB培养基的三角瓶中,置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h,制备种子液。
取2ml种子液接入含有50mL发酵培养基(含有甘油0.8g,酵母粉0.3g,MgCl20.001g)的三角瓶中,置于摇床中,在温度28℃,转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。
摇瓶培养结束,将菌丝体用超纯水离心洗涤后,真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30mL的比例加入二氯甲烷,30℃下超声提取30min,超声功率为300W。提取物利用HPLC进行分离和鉴定。色谱条件:色谱柱:IntersilODS3C18柱,柱温:30℃,检测波长:467nm,进样量:10μL,流动相为纯甲醇,流速1mL/min,时间为25min,结果如图7所示。
以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考,竹红菌甲素产率为19.52mg/g菌丝体,纯度为90.2%,转化率为6.63mg/g碳源。
实施例6
取PDA平板上培养5天的菌株,打孔接入含有50ml PDB培养基的三角瓶中,置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h,制备种子液。
取2ml种子液接入含有50mL发酵培养基(含有麦芽糖1.2g,磷酸二氢铵0.3g,MgCl20.001g)的三角瓶中,置于摇床中,在温度28℃,转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。
摇瓶培养结束,将菌丝体用超纯水离心洗涤后,真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30mL的比例加入二氯甲烷,30℃下超声提取30min,超声功率为300W。提取物利用HPLC进行分离和鉴定。色谱条件:色谱柱:IntersilODS3C18柱,柱温:30℃,检测波长:467nm,进样量:10μL,流动相为纯甲醇,流速1mL/min,时间为25min,结果如图8所示。
以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考,竹红菌甲素产率为10.38mg/g菌丝体,纯度为85.8%,转化率为3.36mg/g碳源。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株MH-02,其分类命名为Shiraia bambusicola,保藏编号为GDMCC No.60438,于2018年8月22日保藏于位于中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.根据权利要求1所述的竹黄菌株,其特征在于,所述竹黄菌株主要代谢产物为竹红菌甲素。
3.根据权利要求2所述的竹黄菌株,其特征在于,所述竹红菌甲素占竹红菌总色素质量的95%以上。
4.根据权利要求1-3任其一所述的竹黄菌株在生产竹红菌甲素中的应用。
5.一种生产竹红菌甲素的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
步骤(1)取权利要求1-3任其一所述的竹黄菌株,培养活化,制备种子液;
步骤(2)将所述的种子液接入发酵培养基进行发酵,获得菌丝体;对菌丝体处理;
步骤(3)从处理后的菌丝体中分离出竹红菌甲素。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的培养活化过程的温度为15℃~30℃。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的发酵培养基中的碳源为葡萄糖、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、蔗糖或同类碳源中的至少一种,优选甘油;所述的发酵培养基中的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢铵或同类氮源中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述发酵为液体深层发酵,优选为液体深层通风发酵;所述发酵条件优选为130-170rpm的条件震荡培养65-75h;所述发酵的温度优选为26℃~30℃;所述发酵培养基的pH优选为4.0~9.0。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,对菌丝体处理的操作方式为:将菌丝体和抽提液混合,超声处理获得发酵产物;所述抽提液优选为二氯甲烷;所述超声处理的条件优选280-320W处理28-32min。
10.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,使用HPLC从处理后的菌丝体中分离出竹红菌甲素;所述的HPLC的色谱柱优选为IntersilODS3 C18柱;所述的HPLC的柱温优选为25-35℃;所述的HPLC的检测波长467 nm;所述的HPLC的进样量为10μL;所述的HPLC的流动相为纯甲醇,流速为1mL/min;所述的HPLC的时间为25 min。
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