CN102703328A - 一种高产竹红菌素的竹黄菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产竹红菌素的竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌
(ShiraiabambusicolaWW67)
，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称
CCTCC
，保藏编号为
CCTCC No.M2012127
，保藏日期为
4
月
22
日。该菌株的核苷酸序列为
SEQ ID NO
：
1
。该菌株的主要代谢产物为竹红菌甲素、竹红菌乙素、痂囊腔菌素
A
、
痂囊腔菌素
B
、
痂囊腔菌素
C
、
痂囊腔菌素
D
。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产竹红菌素的竹黄菌株，属于生物工程技术领域。
背景技术
竹黄（Shiraia bambusicola）又名竹花、竹赤团子、竹三七、竹茧等，系一种特异寄生于某些竹子嫩枝上的真菌，药用为其子座，是一种民间药材，具有止咳祛痛、舒筋活络、祛风利湿、补中益气、活血补血、散瘀通经等功效，可用于治疗虚寒胃痛、风湿性关节炎、气管炎、百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤及贫血头痛等病症。竹红菌素是竹黄最主要生物活性成分，竹红菌素的生理功能主要有：抗菌消炎，抗病毒和抗肿瘤。竹红菌素在光照下可以抑制多咱革兰氏阳性菌（如枯草杆菌Bacillus subtilis、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、北京棒状杆菌Corynebacterium pekinensis、黄色八叠球菌Staphyococcus flava、白色葡萄球菌Staphylococcus albus）的生长。竹红菌素能明显杀灭HIV病毒，且具有良好的抗单纯性疱疹Ⅰ型病毒和Sindbis病毒活性。竹红菌素及其衍生物对于Hela细胞、EMT-6、内植S-180、肝肿瘤细胞和人体恶性上皮癌细胞等多种肿瘤细胞均有显著的杀灭作用。
目前可以通过液态发酵或者固态发酵来获得竹红菌素，但报道较少，且产量不高。虽然人们已经筛选出了一些产苝醌类色素的菌株并对其发酵工艺进行了优化，但产量还是普遍较低，中国发明专利200510010612.X分离了一株真菌Ascomycetes Hypomyces，其固态发酵10天的产量仅为0.2%左右。中国发明专利200910237409.4分离得到的一株毛竹种子内生真菌菌株26℃液态发酵144小时的产量约为0.17%。中国发明专利200710132510.4竹红菌素72小时的液态发酵产量约为0.07%，固态发酵产量约为0.8%。
黄坤和李聪等人研究了竹黄人工培养，但其固态发酵7天后的产量仅为0.05％左右（黄坤, 李聪, 陈远腾,朱洪友, 陈永宽. 微生物发酵产生苝醌类化合物和甘露醇的工艺研究. 云南化工, 2003, 30: 31-34.）。陈佳佳等人进行了无性型竹黄菌株产竹红菌素的研究，其每升产量为色价52的粗品8g，折合成纯品浓度小于0.01％，而且发酵时间长达96h（陈佳佳, 李兆兰, 焦庆才. 竹黄无性型菌株产竹红菌素的研究. 中草药, 2006, 37: 48-50.）。林海萍等人对竹黄菌生物学性状和人工培养技术进行了探索性研究，结果发现可能由于培养基中缺少某些竹子特有的成分，竹黄菌在人工培养条件下无法合成竹红菌素（林海萍, 陈声明. 一种值得开发利用的药用真菌—竹黄. 浙江林业科技, 2002, 22: 77-80.）。
综上所述，现有的菌种产量还较低，不利于工业化生产。
针对当前的问题，本发明从浙江安吉竹林中筛出一株高产竹红菌素的竹黄菌株并对其进行了分类鉴定和产物分析，结果表明固态最高产量可达3%，液态发酵72小时产量可达0.35%，具有显著的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株产竹红菌素的竹黄菌株，可通过固态或液态发酵生产竹红菌素，同时还能产生痂囊腔菌素。它们的结构参见如下论文：
［1］Lousberg，R. J.，C. A. Salemink，U. Weiss，and Batterha.Tj (1969) Pigments of Elsinoe species. Part II. Structure of elsinochromes A，B， and C. Journal of the Chemical Society C-Organic. 1219-1227.
［2］Lousberg， R. J.，C. A. Salemink，and U. Weiss (1970) Pigments of Elsinoe species. Part V. The structure of elsinochrome D. Journal of the Chemical Society C-Organic. 2159-2162.
［3］Diwu，Z. J.，and J. W. Lown (1990) Hypocrellins and their use in photosensitization. Photochem. Photobiol. 52: 609-616.
本发明的技术方案：一株高产竹红菌素的竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2012127，保藏日期为4月22日。
进一步地，该菌株的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
更进一步地，该菌株的主要代谢产物为竹红菌甲素、竹红菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。
进一步地，该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、纤维素、大米中的一者或几者的组合。
更进一步地，该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉中的一者或几者的组合。
采集浙江安吉竹林着生于短蕙竹上的竹黄子实体。要求个体肥大，表面呈浅粉红色，没有龟裂、无胶质分泌的幼嫩子实体作为分离材料。将大小合适的竹黄子实体首先用无菌水洗涤干净，然后用预先配置好的75％浓度的酒精溶液浸泡1－2分钟，待酒精挥发干后，将竹黄子实体进行表面灭菌，然后用无菌的解剖刀将其内部组织切割成绿豆大小的颗粒植于分离琼脂平板表面，在无菌条件下将其轻轻压入琼脂中培养。经培养后真菌以植入点为中心向四周扩散生长而分离。分离用培养基为：马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂20g、水1000mL、青霉素20mg，竹叶汁20g，pH值自然。26℃恒温，培养4-5天。初筛后发现，产竹红菌素的能力相差很大。选择菌落色泽较深的菌落进行复筛培养。最终得到产竹红菌素能力最强的竹黄新菌株(Shiraia bambusicola WW67)。
本发明涉及到的菌种有如下特征
1. 竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)的培养条件
该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纤维素或大米等材料。培养用氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐或蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉等有机氮源。该菌种的生长温度范围为10℃-33℃，最佳生长温度为26℃-28℃。pH范围为4-9，最佳pH范围为5.5-7.3。在菌种培养过程中还可添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钙、氯化钠等无机盐类。
竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)的形态描述
平板培养形态: Shiraia bambusicola WW67在PDA培养基上生长良好，培养3d，菌落呈圆形，干燥，疏松，边缘较平整，直径平均为4.2cm；气生菌丝白色，绒毛状，中间的气生菌丝较边缘发达；菌落基部培养基呈红色，外缘白色；菌落边缘较平整；背面培养基中间部分呈红色，系菌体分泌的色素。色素在培养基上呈暗红色，可形成环状同心圆，中间颜色较深，边缘颜色较浅。色素圈的直径约占菌落直径的40%～95%。显微镜下可见菌丝有隔，间距不等，呈管状，直径2.8～5.5μm，有分支。孢子约1.1μm左右。
竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)的分子生物学特征见序列表。
竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)的产物说明
Shiraia bambusicola WW67主要代谢产物为竹红菌甲素、竹红菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。
可采用常规的固态和液态发酵方法，利用上述菌种产生竹红菌甲素、竹红菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。培养基可用含有不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。
培养基中也添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物。一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。
该菌株固态发酵过程中，1天后开始产苝醌类化合物，10天后产量达最高峰。液态发酵过程中，24小时后开始产苝醌类化合物，72小时产量达最高。
竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2012127，保藏日期为4月22日。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
发酵菌株为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，采用液态发酵，培养基组为葡萄糖2％、酵母膏0.5％、MgSO
4
·7H2O 0.05％、K
2
HPO
4
0．05％、pH为6.0，接种量10％，发酵温度28℃，250ml三角瓶装液量20%。3天发酵结束后，发酵液中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：0.22%，0.032%，0.02%，0.014%，0.12%，0.021%。
实施例2
发酵菌株为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，采用液态发酵，培养基组为果糖2％、蛋白胨0.5％、MgSO
4
·7H2O 0.05％、KH
2
PO
4
0.05％、pH为7.0，接种量10％，发酵温度30℃，250ml三角瓶装液量20%。3天发酵结束后，发酵液中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：0.38%，0.02%，0.015%，0.01%，0.11%，0.03%。
实施例3
发酵菌株为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，采用液态发酵，培养基组为蔗糖3％、牛肉膏0.5％、MgSO
4
·7H2O 0.03％、KH
2
PO
4
0.04％、pH为5.0，接种量10％，发酵温度26℃，250ml三角瓶装液量20%。3天发酵结束后，发酵液中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：0.22%，0.01%，0.014%，0.02%，0.10%，0.023%。
实施例4
发酵菌株为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，采用液态发酵，培养基组为乳糖4％、NH
4
NO
3
0.6％、MgSO
4
·7H2O 0.03％、KH
2
PO
4
0.04％、pH为9.0，接种量10％，发酵温度33℃，250ml三角瓶装液量20%。2天发酵结束后，发酵液中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：0.09%，0.01%，0.01%，0.02%，0.05%，0.013%。
实施例5
发酵菌株为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，采用液态发酵，培养基组为半乳糖1％、尿素 0.6％、MgSO
4
·7H2O 0.03％、KH
2
PO
4
0.02％、pH为4.0，接种量10％，发酵温度10℃，250ml三角瓶装液量20%。2天发酵结束后，发酵液中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：0.04%，0.005%，0.002%，0.01%，0.02%，0.003%。
实施例6
发酵菌株为(Shiraia bambusicola WW67)，采用固态发酵，培养基组成（重量%）：30目的玉米粉68.7，麸皮8，米糠20，葡萄糖1，KH
2
PO
4
0.25，MgSO
4
7H
2
O 0.05；加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌45-60min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度28℃，pH6，10天发酵结束后，发酵培养基中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：2.2%，0.5%，0.3%，0.11%，1.1%，0.02%。
实施例7
发酵菌株为(Shiraia bambusicola WW67)，采用固态发酵，培养基组成（重量%）：60目的大米粉68.7，麸皮8，米糠20，果糖1，KH
2
PO
4
0.25，MgSO
4
7H
2
O 0.05；加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌45-60min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度30℃，pH6，10天发酵结束后，发酵培养基中竹红菌甲素，竹红菌乙素，痂囊腔菌素A，痂囊腔菌素B，痂囊腔菌素C，痂囊腔菌素D的含量分别为：2.5%，0.1%，0.2%，0.21%，1.1%，0.12%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110>苏州维因生物科技有限公司
<120>一种高产竹红菌素的竹黄菌株
<160>2
<210>1
<211>1567
<212>DNA
<213>竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)
<400>1
tcattcaaat gtattcatat gcttgtttca aagattaagc catgcatgtc taagtataag 60
gaatggctcc ttgaatcagt tatcgtttat ttgatagtac gtgaaactgc cttactactt 120
ggataaccgt ggtaattcta gagctaatac atgcttacaa cccagacttc ggaaggggtc 180
tatttattag ataaaaaacc aacgcccttc ggggcttctt ggtgattcat gataacttta 240
cggatcgcat ggccttgcgc cggcgacggt ttctgcccta tcaactttcg caattatacg 300
atggtaaggt attggtttac catggtttca acgggtaacg ggaaattagg gttcgattcc 360
ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac 420
ccaatcccaa tacggggagg tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt 480
gtaattggaa tgagtacaat ttaaacctct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg 540
tgccagcagc cgcggtaatt ccacctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa 600
agctcgtagt tgaaccttgg gtctggctgg caggtccgcc tcaccgcgtg tacttgtccg 660
gccgggcctt ccttctggag aacctaatgc ccttcactgg gcgtgttggg gaccaggact 720
tttactttga gtgttcaaag caggcctttg aaccattgga ctcgaatacg ttagcatgga 780
ataatagaat aggacgtgcg gtcctatttt gttggtttct aggaccgccg taatgattaa 840
tagggacagt cgggggcatc agtattcaat gaaattcttg tgtcagaggt gatttattga 900
agactaacta ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcagtg aacgaaagtt 960
aggggatcga agacgatcag ataccgtcgt agtcttaacc gtaaactatg ccgactaggg 1020
atcgggcgat gttatttttc tgactcgctc ggcaccttac gagaaatcaa agtttttggg 1080
ttctgggggg agtatggtcg attgacggaa caaggctgaa acttaaagaa gggcaccacc 1140
aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggga aactcaccag gtccagatga 1200
aataaggatt gacagattga gagctctttc ttgatttttc aggtggtggt gcatggccgt 1260
tcttagttgg tggagtgatt tgtctgctta attgcgataa cgaacgagac cttaacctgc 1320
taaatagcca ggctagcttt ggctggtcgc cggcttctta gagggactat cggctcaagc 1380
cgatggaagt ttgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 1440
gcgctacact gacagagcca acgagttctt caccttggcc ggaaggtctg ggtaatcttg 1500
ttaaactctg tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaatgcc 1560
tagtaag 1567
Claims (5)
1. 一种高产竹红菌素的竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌(Shiraia bambusicola WW67)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012127。
2. 根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
3. 根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于：其主要代谢产物为竹红菌甲素、竹红菌乙素、痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D。
4. 根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于：其可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、纤维素、大米中的一者或几者的组合。
5. 根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于：其可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉中的一者或几者的组合。
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