CN111218407B - 一株高产竹红菌素的竹黄菌及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株高产竹红菌素的竹黄菌及其培养方法和应用。所述高产竹红菌素的竹黄菌，其分类命名为竹黄菌株(Shiraiabambusicola)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.18808。本发明竹黄菌不仅可以发酵得到高产量的竹红菌素，竹红菌素总量可达4762.9mg/100g，而且所得竹红菌素同时包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株高产竹红菌素的竹黄菌及其培养方法和应用。
背景技术
竹黄(Shiraiabambusicola Henn)又名竹花、竹茧、竹赤斑菌等，属于子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目、肉座菌科、竹黄属真菌。作为我国一种传统的寄生性药用真菌，竹黄多生于衰败或即将衰败的竹林中，它的主要寄主为箭竹属(Fargesia sp.)和短穗竹属(Brachystachyumsp.)竹子植物。民间多用竹黄浸酒，用于治疗风湿性关节炎、坐骨神经痛、腰肌劳损、跌打损伤、虚寒胃痛、小儿惊风和急性肝炎等。现代医学研究表明，竹黄的药用价值主要体现在抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤以及抗病毒等方面。
在竹黄的众多活性成份中，竹红菌素的应用前景最引人瞩目。研究工作者对竹黄子座中的各种化合物进行了系统的分析与鉴定，先后从中分离鉴定出了竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素、硬脂酸、硬脂酸乙酯、麦角甾醇等活性物质，其中竹红菌素是目前研究比较热门的新一代光敏剂，其中对竹红菌甲素和竹红菌乙素的研究最为深入。
竹红菌素在光照下对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，对肿瘤细胞和艾滋病毒也有杀灭或制作用，深入的研究表明竹红菌的药理作用和其所具有的光敏活性有密切关系。不仅对外阴白斑病变有效，对皮肤肥厚性瘢痕及淀粉样变苔藓病变也有明显作用，临床应用疗效显著，对于微血管病变引起的红斑痣、黄斑变性等也有疗效。竹红菌素有很好的抗病毒活性作用，对包膜病毒也有较好的杀伤作用，对生物体的光敏作用可引起细胞功能的改变、酶失活以及细胞死亡等。
竹黄是寄生于竹子上的大型真菌，因此竹红菌素的来源受自然资源的限制，现有的产量很低无法满足需求。因此有必要对竹黄菌发酵和竹红菌素提取进行深入研究，在发酵水平和提取水平上有所提高，对工业化生产竹红菌素具有指导意义。
虽然人们已经筛选出了一些产花酮类色素的菌株并对其发酵工艺进行了优化，但产量还是普遍较低：中国发明专利CN101875905B公开了一株毛竹种子内生真菌菌株，该菌株26℃液态发酵144小时的产量约为0.17％。中国专利申请CN101168728A公开了一株产苝醌化合物的竹黄菌株，该菌株液态发酵72小时后竹红菌素的产量约为0.07％，固态发酵产量约为0.8％。
Wen DU,BaoguiWANG筛选得到一株高产竹红菌素的竹黄菌突变菌株，该菌株在最佳发酵条件下竹红菌素产量为498.89mg/L。
梁晓辉，蔡宇杰，廖祥儒，等.8S rDNA序列分析及产竹红菌素条件初步优化[J].工业微生物，2009，39:13-17.
李达旭，赵建，何颖，等.一种竹寄生真菌的分离鉴定及其有效成分发酵的初步研究[J].四川大学学报(自然科学版)，2003，40(1):139-143.
蔡宇杰，丁彦蕊，张大兵，等.竹黄菌固态发酵竹红菌素条件的研究[J].生物技术，2004，14(4):46-47.
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Wen,DU,Baogui,et al.High Efficiency Hypocrellin Production by a NovelMutant Isolated from Shiraiabambusicola[J].Asian Agricultural Research,2019.
发明内容
针对以上所述问题，本发明目的之一，提供一株高产竹红菌素的新菌株，其分类命名为竹黄菌株(Shiraiabambusicola)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.18808，保藏日期为2019年11月18日。
本发明目的之二，提供上述菌株的培养方法，利用该培养方法，竹黄菌不仅具有较好的生物量，而且可发酵得到产量可观的竹红菌素。
本发明目的之三，提供上述菌株在发酵生产竹红菌素中的应用。在该应用中，不仅可以得到高产量的竹红菌素，竹红菌素总量可达4762.9mg/100g，而且所得竹红菌素同时包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
提供一株高产竹红菌素的竹黄菌，其分类命名为竹黄菌株(Shiraiabambusicola)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.18808。
优选地，所述竹黄菌其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
优选地，该菌株主要代谢产物包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
优选地，该菌株可利用的碳源为葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、大米、麸皮、马铃薯、木薯、玉米、甘油、甜菜、纤维素、甘油中的一种或几种；
其可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉中的一种或几种。
优选地，该菌株可利用的无机盐包括NaCl，FeSO4，K2HPO4，MgSO4。
本发明还提供以上所述竹黄菌的培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)种子培养：用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中25℃～30℃培养24～48h；
(2)发酵培养，将步骤(1)培养得到的种子液接入到液体发酵培养基或固体发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为26℃～30℃，发酵4～20天。
优选地，步骤(1)所述液体种子培养基包括如下质量百分比的组分：马铃薯浸粉100-200g/L、氯化钠2-10g/L。
优选地，步骤(2)中所述液体发酵培养基包括如下质量百分比的组分：碳源2％～8％，氮源1.5％～5％，无机盐0.05～0.1％，pH值为5.5～7.5；其中，所述碳源选择葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、马铃薯浸粉中的至少一种；所述氮源选自蛋白胨或无机硝酸盐；无机盐选自NaCl，FeSO4，K2HPO4，MgSO4中至少一种；
所述固体发酵培养基包括如下质量百分比的组分：碳源30％～70％，氮源15％～55％，无机盐0.01％～0.5％，pH值为5.5～7.5；其中，所述碳源选择大米、麸皮、马铃薯、木薯、玉米、甜菜的至少一种；优选地，所述碳源为大米和麸皮；所述氮源选自蛋白胨或无机硝酸盐；无机盐选自NaCl，FeSO4，K2HPO4，MgSO4中至少一种。
本发明还提供以上所述竹黄菌在发酵生产竹红菌素中的应用。
根据以上所述应用，所述竹红菌素包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
根据以上所述的应用，包括以下步骤：
(1)种子培养：用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中25℃～30℃培养24～48h；
(2)发酵培养，将步骤(1)培养得到的种子液接入固体发酵培养基中，加入木本植物浸提液A:1％～15％或木本植物浸提液B:1％～15％，26℃～30℃发酵培养15～20天；
所述固体发酵培养基包括如下质量百分比的组分：大米30％～70％，麸皮15％～55％，无机盐0.01％～0.5％，pH值为5.5～7.5；其中，无机盐选自NaCl，FeSO4，K2HPO4，MgSO4中至少一种；
最后，该菌株可利用木本植物浸提液A、B；优选地，所述木本植物浸提液A为淡竹竹叶的浸提液；所述木本植物浸提液B为淡竹竹茎的浸提液。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果：
(1)本发明提高的竹黄菌具有高效产竹红菌素的能力，能够同时代谢生成竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
(2)通过本发明所述培养方法，本发明竹黄菌株可发酵生产得到高产量竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
(3)本发明竹黄菌株在发酵生产竹红菌素的应用中，通过向发酵培养基中添加木本植物浸提液A或B，能够进一步大幅提升竹红菌素总量，竹红菌素总量可达4762.9mg/100g。
本发明所述竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌株(Shiraiabambusicola)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18808，保藏日期为2019年11月18日。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
本发明通过采集云南竹林着生于短蕙竹上的竹黄子实体，要求个体肥大，表面呈浅粉红色，没有龟裂、无胶质分泌的幼嫩子实体作为分离材料。将大小合适的新鲜竹黄子实体首先用自来水清洗干净，然后用预先配置好的浓度的0.15％次氯酸钠溶液浸泡一分钟，再用无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干表面水分后，然后用无菌的解剖刀将其内部组织切割成0.3cm×0.3cm的颗粒植于分离PDA平板表面，在无菌条件下将其轻轻压入PDA平板培养。经培养后真菌以植入点为中心向四周扩散生长而分离。分离用培养基为马铃薯、葡萄糖、NaCl、琼脂、水，pH值自然。26℃恒温，培养3～5天。初筛后发现，产竹红菌素的能力相差很大。选择菌落色泽较深的菌落进行复筛培养。最终筛选得到本发明所述竹黄菌。
本发明涉及到的菌种有如下特征
竹黄菌株(Shiraiabambusicola)的形态描述
平板培养形态Shiraiabambusicola在PDA培养基上生长良好，培养4d，菌落呈圆形，年轮状向外生长，干燥疏松，边缘较平整，直径平均5.0cm，气生菌丝白色，绒毛状，中间的气生菌丝较边缘发达菌落基部培养基呈红色，外缘白色菌落边缘较平整背面培养基中间部分呈红色，系菌体分泌的色素。色素在培养基上呈暗红色，可形成环状同心圆，中间颜色较深，边缘颜色较浅。色素圈的直径约占菌落直径的30～95％。显微镜下可见菌丝有隔，间距不等，呈管状，直径2.5～4.5μm，有分支。抱子约左右1.5μm左右。
竹黄菌株(Shiraiabambusicola)的分子生物学特征如SEQ ID NO：1序列所示。
本发明竹黄菌株(Shiraiabambusicola)的培养条件
该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料碳源可以是大米、葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、马铃薯、麸皮、玉米、甘油、甜菜、纤维素材料。培养用。氮源可以是无机按盐、无机硝酸盐或蛋白陈、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉等有机氮源。该菌种的生长温度范围为10℃～32℃，最佳生长温度为25℃～30℃。pH范围为4～10，最佳pH范围为5.5～7.5。在菌种培养过程中还可添加NaNO3，NaCl，FeSO4·7H2O，K2HPO4，MgSO4.7H2O等无机盐类，以及木本植物浸提液促进菌种生长，提高产竹红菌素能力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
以下实施例所述竹黄菌株为本发明筛选得到的菌株，保藏编号为CGMCCNo.18808。
本发明实施例所用淡竹叶或茎浸提液的制备方法为:将淡竹叶或茎粉碎、过40目筛，按1:10质液比加入水溶液，在60摄氏度下浸提3小时后冷却，备用。
实施例1
(1)种子培养
将竹黄菌株(Shiraiabambusicola)进行种子培养：马铃薯浸粉200g/L、氯化钠10g/L，发酵温度26℃，转速200转/min，培养2天。
(2)发酵培养
采用固态发酵，所用固体发酵培养基组成为：大米45％，麸皮15％，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌30～45min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度26℃，15天发酵结束后，发酵培养基中竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素含量分别为543.mg/100g，710.2mg/100g，54.2mg/100g，9.2mg/100g。
实施例2
(1)种子培养：
将竹黄菌株(Shiraiabambusicola)进行种子培养：马铃薯浸粉200g/L、氯化钠10g/L，发酵温度26℃，转速200转/min，培养2天。
(2)发酵培养
采用固态发酵，所用固体发酵培养基组成为：大米45％、麸皮15％、NaCl 0.5g/L、K2HPO41％、MgSO4.7H2O 0.3％，加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌30～45min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度26℃，15天发酵结束后，发酵培养基中竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素含量分别为366mg/100g，554mg/100g，103mg/100g，7.7mg/100g。
实施例3
(1)种子培养
将竹黄菌株(Shiraiabambusicola)进行种子培养：马铃薯浸粉200g/L、氯化钠10g/L，发酵温度26℃，转速200转/min，培养2天。
(2)发酵培养
采用固态发酵，所用固体发酵培养基组成为：大米45％，麸皮15％，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，3％淡竹茎浸提液，加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌30～45min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度26℃，15天发酵结束后,发酵培养基中竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素含量分别为1351.2mg/100g，2006.7mg/100g，9.2mg/100g，5.7mg/100g。
实施例4
(1)种子培养
将竹黄菌株(Shiraiabambusicola)进行种子培养：马铃薯浸粉200g/L、氯化钠10g/L，发酵温度26℃，转速200转/min，培养2天。
(2)发酵培养
采用固态发酵，所用固体发酵培养基组成为：大米45％，麸皮15％，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，3％淡竹叶浸提液，加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌30～45min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度26℃，15天发酵结束后，发酵培养基中竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素含量分别为1166.7mg/100g，2000mg/100g，18mg/100g，14mg/100g。
实施例5
(1)种子培养
将竹黄菌株(Shiraiabambusicola)进行种子培养：马铃薯浸粉200g/L、氯化钠10g/L，发酵温度26℃，转速200转/min，培养2天。
(2)发酵培养
采用液态发酵，所用液态发酵培养基组分为葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硝酸钠0.5g/L，3％淡竹茎浸提液，接种量10％，发酵温度26℃，500ml三角瓶装液量1/5，0.1MPa灭菌20min，4天发酵结束后，发酵液体培养基中竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素含量分别为3.9mg/100mL，7.6mg/100mL，2.1mg/100mL，1.2mg/100mL。
实施例6
(1)种子培养
将竹黄菌株(Shiraiabambusicola)进行液态培养：马铃薯浸粉200g/L、氯化钠10g/L，发酵温度26℃，转速200转/min，培养2天。
(2)发酵培养
采用液态发酵，所用液态发酵培养基组分为马铃薯浸粉200g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠10g/L，3％淡竹茎浸提液，接种量10％，发酵温度26℃，500ml三角瓶装液量1/5，0.1MPa灭菌20min，4天发酵结束后，发酵培养基中竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素含量分别为5.6mg/100mL，14.3mg/100mL，2.9mg/100mL，1.1mg/100mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东国力生物科技有限公司 山东国力生物技术研究院
<120> 一株高产竹红菌素的竹黄菌及其培养方法和应用
<141> 2020-01-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta cctagtagta cggggttata gcaatatagc 60
ccccgtctgc acccatgttt atgcgtacta catgtttcct cggctggttc tccagccgat 120
aggatctctt aaactcattg taattgcaat cagcgtctga aaaaatcaat atttacaact 180
ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta 240
gtgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccccttggt 300
attccatggg gcatgcctgt tcgagcgtca tttgtaccct caagctatgc ttggtgttgg 360
gtgtttgtcc tatccattgc gactggactc gccttaaaga tattggcagc cggcattttg 420
gccttggagc gcagcacaat ttgcgagtcc aagccggaat actgacgtcc agataagctt 480
tttaccacgt ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa 540
gcggagga 548
Claims (5)
1.一株高产竹红菌素的竹黄菌，其分类命名为竹黄菌株(Shiraia bambusicola)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.18808；其主要代谢产物包括竹红菌甲素、竹红菌乙素、竹红菌丙素、竹红菌丁素。
2.权利要求1所述竹黄菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子培养：用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中25℃～30℃培养24～48h；所述液体种子培养基包括如下组分：马铃薯浸粉100-200g/L、氯化钠2-10g/L；
(2)发酵培养，将步骤(1)培养得到的种子液接入到固体发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为26℃～30℃，发酵4～20天；所述固体发酵培养基包括如下质量百分比的组分：碳源30％～70％，氮源15％～55％，无机盐0.01％～0.5％，pH值为5.5～7.5；其中，所述碳源选择大米、麸皮、马铃薯、木薯、玉米、甜菜的至少一种；所述氮源选自蛋白胨或无机硝酸盐；无机盐选自NaCl，FeSO4，K2HPO4，MgSO4中至少一种。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，固体发酵培养基碳源为大米和麸皮。
4.权利要求1所述竹黄菌在发酵生产竹红菌素中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子培养：用生理盐水将竹黄菌的孢子洗下，接入液体种子培养基中25℃～30℃培养24～48h；
(2)发酵培养，将步骤(1)培养得到的种子液接入固体发酵培养基中，加入木本植物浸提液1％～15％，26℃～30℃发酵培养15～20天；
所述固体发酵培养基包括如下质量百分比的组分：大米30％～70％，麸皮15％～55％，无机盐0.01％～0.5％，pH值为5.5～7.5；其中，无机盐选自NaCl，FeSO4，K2HPO4，MgSO4中至少一种；所述木本植物浸提液为木本植物浸提液A、B；所述木本植物浸提液A为淡竹竹叶的浸提液，所述木本植物浸提液B为淡竹竹茎的浸提液。
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