CN106148214B - 一种圈卷产色链霉菌及制备尼可霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)菌株BJX005，于2015年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10523。本发明的菌株生产尼可霉素的能力高，可以达到41000μg/ml发酵液，而且本发明菌株连续传代5次后其生产尼可霉素的能力还保持在原有水平，表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备尼可霉素的方法，能够提高生产尼可霉素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此本发明的圈卷产色链霉菌及制备尼可霉素的方法适合于在尼可霉素生产中应用。

Description

一种圈卷产色链霉菌及制备尼可霉素的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种圈卷产色链霉菌菌株及制备尼可霉素的方法。

背景技术

尼可霉素类(Nikkomycins)抗生素是1976年德国的研究者发现的，是多年来国内外一直坚持研究开发的全新型抗真菌药物，尼可霉素是核苷肽类抗生素，尼可霉素与几丁质合成酶的天然合成底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine，N-GlcAc)结构相类似，所以尼可霉素作为几丁质合成酶的强烈竞争性抑制剂来抑制真菌细胞壁主要成分几丁质的生物合成，因此其对真菌生长具有抑制作用。

在农业上，尼可霉素用于植物昆虫及某些真菌病害的防治具有极大的前景，多尼可霉素Z对几丁质含量较高的两相病原真菌如粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)具有非常显著的疗效，具有广阔的市场前景。

因此有必要提供一种具有较高尼可霉素生产效率的专用菌株及尼可霉素的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一株圈卷产色链霉菌以提高尼可霉素的效率。

本发明另一目的是提供应用本发明所述菌株生产尼可霉素的方法。

本发明所提供的圈卷产色链霉菌菌株(Streptomyces ansochromogenes)，编号为BJX005，于2015年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)保藏编号为CGMCCNO.10523。

本发明中的圈卷产色链霉菌CGMCC NO.10523在发酵培养基中可以产尼可霉素X组分和Z组分，其中主要为Z组分，从而有效抑制真菌、昆虫、螨虫的生长，该菌株的孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。甘油硝酸盐琼脂：无气丝。基丝薄，浅黄色。无可溶色素。

圈卷产色链霉菌CGMCC NO.10523在不同培养基上的生长形态如下：

葡糖天冬素琼脂：为气丝絮状，肉桂褐色。基丝浅黄色至浅洋红色。

甘油天冬素琼脂(ISP)、无机盐淀粉琼脂(ISP)：气丝为灰色。基丝反面黄色或绿黄色：加0.05N HCl，由黄色变为橙色。可溶色素黄色或微黄色，加0.05N HCl，由黄色变为橙色。

淀粉琼脂：基丝浅黄色。苹果酸钙琼脂：基丝浅黄色至褐黄色。可溶色素褐黄色。

酵母精麦芽精琼脂(ISP)、燕麦粉琼脂(ISP)：气丝灰色系列。基丝反面黄色或绿黄色。可溶色素微黄色。黄色素遇酸变为橙色。

马铃薯块：气丝粉状，灰白色。基丝褐色至微褐沥青色。明胶液化有限，暗褐色素。牛奶不凝固，胨化弱。淀粉水解有限。

本发明提供一种制备尼可霉素的方法，包括以下步骤：

1)发酵培养：将所述菌株的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；

2)从发酵液中提取尼可霉素。

其中，步骤1)所述的发酵培养为在温度25-30℃条件下培养65-75小时。

所述发酵培养基成分为：

玉米淀粉32-38g/L，豆饼粉22-28g/L，酵母粉4-6g/L，氯化钠4-6g/L，硫酸铵0.4-0.6g/L，甘露醇4-6g/L，碳酸钙3-4g/L。所述发酵培养基灭菌前以100g/L强氧化钠溶液调节pH至7.2。

所述发酵培养基的成分优选为：玉米淀粉35g/L，豆饼粉25g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵0.5g/L，甘露醇5g/L，碳酸钙3.5g/L。灭菌前以100g/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。

在发酵过程中菌株的接种量优选为5-15％(V/V)，所述种子液为培养至对数生长期的种子液。

所述发酵可以在震荡的条件下进行，所述震荡的转速为200-230rpm，旋转半径为50mm，所述震荡的转速优选为220rpm。

为了发酵液因过多蒸发而浓缩，造成虚假的发酵单位，保持所述发酵的环境相对湿度为50-60％。

所述发酵的温度优选为28℃，培养时间优选为70小时。

本发明还提供了所述圈卷产色链霉菌BJX005(CGMCC NO.10523)或所述发酵方法在生产尼可霉素中的应用。

本发明的菌株生产尼可霉素的能力高，可以达到41000μg/ml发酵液，而且本发明菌株连续传代5次后其生产尼可霉素的能力还保持在原有水平，表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备尼可霉素的方法，能够提高生产尼可霉素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此本发明的圈卷产色链霉菌及制备尼可霉素的方法适合于在尼可霉素生产中应用。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例1菌株的获得

本实验中用到的高通量初筛方法如下：

发酵阶段：采用96孔深孔板，每孔中装培养基0.3ml。每孔接入菌种，28℃静置培养8天。斜面培养基组成：由终浓度为5g/L的葡萄糖，终浓度为5g/L的玉米粉，终浓度为4g/L酵母浸粉，终浓度为20g/L的琼脂粉，余量为水。pH值自然，121℃，灭菌20min。

提取阶段：过滤，得到滤液后进行生物效价检测。

测定阶段：用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1、从土壤中分离菌株

取黑龙江省海林市烟草农作物附近的土壤，将土壤制成悬浮液，将土壤悬浮液接种于分离培养基中进行培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株；分离培养基由玉米淀粉10g/L(60目)，豆饼粉20g/L(80目)，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵1g/L，加入自来水，混匀后加热煮沸，然后加入碳酸钙2g/L。pH值自然，装液量为50mL/250mL三角瓶，棉塞塞口，另加两层纱布后塑料包扎，121℃，灭菌30min；

初筛：获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经过滤得到滤液后，对烟草赤星病菌的抑菌效果进行测定，将能产生尼可霉素的菌株分别进行如下系列诱变。

2、诱变

(1)紫外线诱变

取菌悬液10ml，加入到无菌培养皿中，以30W的紫外照射装置于30cm处照射。设定照射时间分别为50s、80s。配置分离培养基进行培养，挑取单菌落后，28℃培养7d进行效价测定，获得的高产菌株进行下一步诱变。

(2)紫外线诱变(第2轮)

对第一轮紫外线复合链霉素诱变获得的高产菌株用同样的方法再次进行紫外线诱变。获得的高产菌株继续进行化学诱变。

(3)6-氯嘌呤诱变

将菌株斜面接种于无有机氮源的饥饿培养基中，培养过夜，将菌株接种于含有不同浓度的6-氯嘌呤平皿中，6-氯嘌呤的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml的平皿中。28℃培养7d。挑取单菌落培养，进行效价测定，获得的高产菌株继续诱变。

(4)EMS(甲基磺酸乙酯)复合链霉素诱变

甲基磺酸乙酯(EMS)诱变用0.2mol/L，pH6.8的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，加入浓度为0.5mg/ml的EMS于28℃震荡30min后，用生理盐水洗涤孢子3次，涂板挑取单菌落28℃培养7d，挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试，筛选获得尼可霉素高产菌株。

经过上述系列方法，最终获得尼可霉素高产菌株BJX005。

二、菌株的鉴定

尼可霉素菌菌株BJX005是好氧放线菌，孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。

通过PCR扩增该菌的16SrDNA，PCR所用的引物序列为：

正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(如SEQ ID No.2所示的序列)

反向引物：5′-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA-3′(如SEQ ID No.3所示的序列)；

将PCR产物进行凝胶电泳，发现与目的条带大小相同，为1520bp，序列如SEQ IDNo.1所示。

以上生理生化特征表明本发明得到的突变菌株属于圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)，将其命名为BJX005，于2015年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)分类命名为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)保藏编号为CGMCC NO.10523。

实施例2发酵圈卷产色链霉菌BJX005生产尼可霉素

发酵培养基I组成：发酵培养基最优组合如下：玉米淀粉32g/L，豆饼粉22g/L，酵母粉4g/L，氯化钠4g/L，硫酸铵0.4g/L，甘露醇4g/L，碳酸钙3g/L，pH 7.2，121℃下灭菌30min。所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。

发酵培养基Ⅱ组成：发酵培养基最优组合如下：玉米淀粉38g/L，豆饼粉28g/L，酵母粉6g/L，氯化钠6g/L，硫酸铵0.6g/L，甘露醇6g/L，碳酸钙4g/L，pH7.2，121℃下灭菌30min。所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。

发酵培养基Ⅲ组成：玉米淀粉35g/L，豆饼粉25g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵0.5g/L，甘露醇5g/L，碳酸钙3.5g/L，pH 7.2，121℃下灭菌30min。所述终浓度均为在所述发酵培养基中的浓度。

一)利用发酵培养基Ⅰ发酵圈卷产色链霉菌BJX005制备尼可霉素。

1、斜面培养：

将唐德链霉菌BJX005接种到斜面培养基上，在28℃、环境相对湿度为50-60％条件下培养7-8天。

2、种子培养

挖取步骤一中得到的斜面菌苔1cm²，将其接入装有30ml灭过菌的种子培养基的种子瓶，在如下条件下培养30小时：温度为28℃、环境相对湿度为50-60％、转速为180-200rpm、旋转半径为50mm，得到种子培养液。

3、发酵培养

发酵培养方法：取上述种子培养液按10％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基Ⅰ的三角瓶中，在如下条件下发酵培养75小时：温度为30℃、湿度为60％、转速为230rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

4.尼可霉素效价检测

实验设4次重复，结果取平均数。利用生物活性效价检测方法，计算出效价为38800μg/mL。

二)利用发酵培养基Ⅱ发酵圈卷产色链霉菌BJX005(CGMCC NO.10523)制备尼可霉素。

1、斜面培养：

同步骤一中所述一致。

2、种子培养:

同步骤一中所述一致。

3、发酵培养:

发酵培养方法：取上述种子培养液按7％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基Ⅱ的瓶中，在如下条件下发酵培养68小时：温度为26℃、环境相对湿度为50％、转速为200rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

4、尼可霉素效价检测

实验设4次重复，结果取平均数。利用生物活性效价检测方法，计算出效价为39600μg/mL。

三)利用发酵培养基Ⅲ发酵圈卷产色链霉菌BJX005制备尼可霉素。

1、斜面培养：

同步骤一中所述一致。

2、种子培养：

同步骤一中所述一致。

3、发酵培养:

发酵培养方法：取上述种子培养液按10％(V/V)的接种量接种于装有30ml灭过菌的发酵培养基Ⅲ的瓶中，在如下条件下发酵培养70小时：温度为28℃、环境相对湿度为55％、转速为220rpm、旋转半径为50mm，得到发酵液。

4、尼可霉素效价检测

实验设4次重复，结果取平均数。利用生物活性效价检测方法，计算出效价为41000μg/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)菌株BJX005，于2015年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10523。

2.一种采用权利要求1所述菌株制备尼可霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)发酵培养：将所述菌株的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；

2)从发酵液中提取尼可霉素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的发酵培养为在温度25-30℃条件下培养65-75小时。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：

玉米淀粉32-38g/L，豆饼粉22-28g/L，酵母粉4-6g/L，氯化钠4-6g/L，硫酸铵0.4-0.6g/L，甘露醇4-6g/L，碳酸钙3-4g/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：

玉米淀粉35g/L，豆饼粉25g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵0.5g/L，甘露醇5g/L，碳酸钙3.5g/L。

6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述发酵在震荡的条件下进行，所述震荡的转速为200-230rpm，旋转半径为50mm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述震荡的转速为220rpm。

8.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵的环境相对湿度为50-60％。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，温度为28℃，培养时间为70小时。

10.权利要求1所述圈卷产色链霉菌菌株BJX005或权利要求2-9任一项中所述的方法在生产尼可霉素中的应用。