CN101928688A

CN101928688A - 阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂

Info

Publication number: CN101928688A
Application number: CN 201010204224
Authority: CN
Inventors: 李顺鹏; 蒋建东; 李�荣; 朱建春; 王融; 宋瑶
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Jiangsu Nanjing Agricultural University Technology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2030-06-21
Also published as: CN101928688B

Abstract

本发明提供了一种高效降解农药阿维菌素的菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为AW64，鉴定为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)，能以阿维菌素为唯一碳源和能源进行生长，48h对50mg/kg阿维菌素的降解率大于90％，降解菌剂产品直接施用可使土壤和南丰蜜桔中农药阿维菌素残留完全去除，能够有效地消除土壤污染，解决了农业生产中阿维菌素残留超标问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。

Description

阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂

一、技术领域

本发明提供一株阿维菌素农药残留降解菌株及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于环境污染的治理和现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。

二、背景技术

阿维菌素(Avermectins简称AVM)是从阿维链霉菌的发酵产物中分离出的一种新型、高效生物农药，已在很多国家登记使用，是目前中国应用最广泛的理想抗寄生虫药，广泛适用于蔬菜、果树、棉花和花卉等作物，阿维菌素的产量和用量近年来增长迅速。

模拟农药飘移和流失来评价阿维菌素对土壤环境的作用证实其半衰期为20-47天，而灭菌土壤中不会发生阿维菌素的代谢。对阿维菌素与土壤结合能力的研究表明，阿维菌素与土壤颗粒紧密结合，使之成为环境中的不流动农药，在土壤中易形成结合态残留。阿维菌素的长期大量使用带来了环境污染及农产品中农药残留等问题，研究阿维菌素的微生物降解对于保护环境及保障农产品安全具有重要意义。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，能够加快土壤和植株中阿维菌素农药的降解，一定时间以后使用过降解菌剂的处理中残留量降低99％以上，且费用较低。使用该降解菌剂既可以消除环境中特别是土壤中阿维菌素农药的污染，又可在农作物的正常生长过程中正常使用阿维菌素农药进行病虫害的防治，从而保证农产品中阿维菌素农药残留含量符合绿色食品要求。

技术方案下面为本发明的主要内容：

一株阿维菌素农药残留降解菌，该菌株革兰氏染色为阴性，2010年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。菌种保藏号为CGMCC NO.3640，经鉴定为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)，主要生物学特性，LB培养基上培养24h后可以形成直径为0.5-1.5mm菌落，菌落圆形、白色带略微黄色、表面光滑、有光泽、边缘整齐，甲基红和VP反应为阴性，接触酶测定阳性，氧化酶测定阴性，吲哚试验为阴性，该菌株能以阿维菌素为唯一碳源和能源进行生长，在实验室条件下对阿维菌素的降解率达85％以上。

用上述的阿维菌素农药残留降解菌生产的降解菌剂，是通过以下方法生产而成：

1.将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2.将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g L^-1，酵母膏1g L^-1，(NH₄)₂SO₄ 1.0g L^-1，NaCl 0.5g L^-1，其余为水，pH 7.2-7.5；

3.将种子液按5％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

4.在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。

有益效果本发明提供一种消除阿维菌素农药残留的降解菌剂，菌株能以阿维菌素为唯一碳源和能源进行生长。

使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理环境中阿维菌素造成的污染和在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。菌株AW64能够加快土壤和植株中阿维菌素农药的降解，一定时间以后使用过降解菌剂的处理中残留量降低99％以上。使用该降解菌剂既可以消除环境中特别是土壤中阿维菌素农药的污染，又可在农作物的正常生长过程中正常使用阿维菌素农药进行病虫害的防治，从而保证农产品中阿维菌素农药残留含量符合绿色食品要求。并且该菌为革兰氏阴性菌，在田间的存活时间适当，不会影响以后农药使用效果。

降解菌剂产品直接施用可使土壤中农药阿维菌素残留量降低99％以上，能够有效地消除土壤污染，缓解植株受药害症状，解决了农业生产中农药阿维菌素残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品。该降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。本发明成功的解决了环境中特别是土壤中农药阿维菌素农药的残留超标问题，既充分发挥化学农药阿维菌素在植物病虫害防治中的高效快速的作用，生产出无毒无公害的绿色农产品，又可以修复环境中阿维菌素农药的污染。

四、附图说明

图1接种量对菌株AW64降解阿维菌素的影响

图2初始pH对菌株AW64降解阿维菌素的影响

图3温度对菌株AW64降解阿维菌素的影响

图4农药浓度对菌株AW64降解阿维菌素的影响

图5外加营养原素菌株AW64降解阿维菌素的影响

图6土壤中菌株AW64对阿维菌素的降解的影响

五、具体实施方式

1菌株的分离和鉴定

取污染土壤5g，加入到100ml的无机盐培养基(NH₄NO₃ 1.0，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄1.5，NaCl 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，pH 7.0)中，添加阿维菌素至50mg/kg作为唯一碳源，于30℃，150rpm摇床培养获得富集液，连续稀释涂布添加阿维菌素的LB平板，挑取单菌落在无机盐加阿维菌素液体培养基中培养，分别提取检测，通过紫外扫描，高效液相色谱验证其降解能力。最终经初筛、复筛，得到一株阿维菌素高效降解菌株AW64，48h对50mg/kg阿维菌素的降解率大于90％。该菌经多次转接后，进一步纯化并鉴定为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)。其主要生物学特性为：LB培养基上培养24h后可以形成直径为0.5-1.5mm菌落，菌落圆形、白色带略微黄色、表面光滑、有光泽、边缘整齐，甲基红和VP反应为阴性，接触酶测定阳性，氧化酶测定阴性，吲哚试验为阴性，该菌株能以阿维菌素为唯一碳源和能源进行生长，在实验室条件下对阿维菌素的降解率达90％以上。

2实验室生物降解实验

2.1接种量对AW64菌株降解阿维菌素的影响

AW64培养至对数期，以2％、5％、10％、15％的接种量接入阿维菌素为50mg/L的无机盐盐培养基(NH₄NO₃ 1.0，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄ 1.5，NaCl 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，pH 7.0)中，30℃、150rpm摇床振荡培养，培养48h取样检测。如图1：结果显示，2％、5％、10％、15％接种量的降解率分别为70％，81％，92％，88％，接种量越大，AW64降解阿维菌素的速率得到加快，但超过10％以后效率增加不明显。

2.2初始pH对菌株AW64降解阿维菌素的影响

AW64在LB培养基中培养至对数期后以10％的接种量接入初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10阿维菌素为50mg/L的基础盐培养基中，30℃，150rpm摇床振荡培养，48小时后取样检测。如图2：菌株在pH为6.0-9.0之间降解性能良好，pH低于6.0或者高于9.0降解性能显著受到抑制。

2.3温度对菌株AW64降解阿维菌素的影响

AW64在LB培养基中培养至对数期，以10％的接种量接入阿维菌素为50mg/L的基础盐培养基中，分别于10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃，150rpm摇床振荡培养，48小时后取样检测。如图3所示：菌株在20-40℃之间降解性能良好，温度低于20℃或者高于40℃降解性能显著受到抑制，最适降解温度为35℃。

2.5农药浓度对菌株AW64降解阿维菌素的影响

AW64在LB培养基中培养至对数期，以10％的接种量接入阿维菌素浓度分别为5、10、 50、100、200、400、800mg/L的基础盐培养基中，30℃、150rpm摇床振荡培养，48小时后取样检测。如图4所示：400mg/kg的阿维菌素对降解有一定的抑制作用，菌株能够很好的降解低浓度的阿维菌素(5mg/kg)。

2.6外加营养元素对菌株AW64降解阿维菌素的影响

AW64在LB培养基中培养至对数期，无菌水洗涤两次后加入等体积的无菌水制成菌悬液，以10％的接种量接入阿维菌素浓度为50mg/L且分别添加0.2％的葡萄糖、酵母膏和蛋白胨，30℃、150rpm摇床振荡培养，48小时后取样检测。如图5所示，外加营养元素对降解没有影响。

3菌株AW64在土壤中对阿维菌素的降解试验

称取10mg阿维菌素农药，溶于100ml的丙酮中，将农药拌入过筛风干菜园土中，使其浓度为50mg/kg。将处理好的土样置于花盆中，喷施水使其含水量达到饱和含水量的40％，放置36h待用，准备一定量的AW64菌液，离心后等体积无菌水清洗悬浮。在处理中添加菌液，所加菌液为先前制备的无菌水清洗悬浮的菌液，添加约7.0×10⁶CFU/g(以干土计)的降解菌株，对照中添相同体积的无菌水，分别于2、4、6、8、10、12、14天后取土样检测农药浓度。结果如图6：表明菌株AW64能够加快土壤中阿维菌素的降解，经过两周的降解，土壤中的阿维菌素被降至检测不出。

4用上述的阿维菌素农药残留降解菌生产降解菌剂：

1.将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

4.在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，每桶20公斤。

5AW64菌株对南丰蜜桔中阿维菌素残留修复

试验于2007年3月到11月在江西南丰县市山镇密桔园进行。试验区总面积2000m²，处理和对照各重复3次，每个重复小区面积约为333m²。阿维菌素施药剂量均为当地农户正常使用剂量，为河北保定农药厂生产的20g/L阿维菌素乳油稀释2000倍喷施，分别喷施3次。处理小区在第2次和第3次喷药后3天分别喷施菌剂AW64，菌剂由南京农业大学微生物中试工厂生产，菌数1.3×10¹⁰CFU/ml，菌剂稀释100倍喷施，每亩用量为5L。最后1次施菌剂后第7天分别在对照和处理小区用五点取样法采蜜桔鲜样500g检测阿维菌素含量。结果如表1，对照中阿维菌素平均残留为0.247mg/kg，而处理中无任何残留。

表1阿维菌素降解菌株AW64在南丰蜜桔上的应用

Claims

1.一种阿维菌素残留降解菌，其特征在于，该微生物是革兰氏染色阴性的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)的菌株AW64，其保藏号为CGMCC 3640。

2.一种用权利要求1所述的阿维菌素农药残留降解菌株生产的降解菌剂，是通过以下方法生产而成：

1)将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g L^-1，酵母膏1g L^-1，(NH₄)₂SO₄ 1.0g L^-1，NaCl 0.5g L^-1，其余为水，pH 7.2-7.5；

3)将种子液按5％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。