CN102586151B - 一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法 - Google Patents

一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一株高产多糖的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株及利用该菌发酵生产多糖的方法，该菌株于2012年2月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5766。胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株在蔗糖含量为10g/L的培养基中，多糖的产量最高可达6g/L，转化率最高可达60%。

Description

一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株胶质芽孢杆菌，又名硅酸盐细菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01的菌种及利用该菌发酵生产多糖的方法。
背景技术
胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，是一种能够强烈分解硅酸盐矿物和磷灰石的细菌，又被称为硅酸盐细菌或钾细菌。其在分类学上属于细菌域、厚壁菌门、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属。硅酸盐细菌在工业、农业、化工等众多领域都有广泛的应用 。
多糖是一类广泛存在于自然界的生物体产生的独特的生物大分子。它具有各种各样特殊的且在大多数情况下相当复杂的化学结构，不同的生理功能和广泛的（潜在的）应用价值。近些年来微生物多糖作为一种新型发酵产品，具有独特的物化性质，已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、悬浮剂和润滑剂等应用于石油、化工、食品、制药、环保和化妆品等多个领域。胶质芽孢杆菌在生长过程中能产生丰富的荚膜多糖， 此多糖是一种酸性多糖分为中性部分和酸性部分，中性部分多糖的单糖组分主要为葡萄糖，半乳糖，甘露糖，酸性部分为葡萄糖醛酸。有报道该多糖已被用于陶瓷工业中的添加剂，改善陶瓦、瓷器、餐具和砖的弯曲强度、机械强度并降低能耗；该多糖还具有良好的絮凝效果已被用于絮凝剂，且絮凝对象较广，用于处理活性污泥，处理污水，净化水质。由于多糖同透明质酸、黄原胶、热凝胶、结冷胶、威兰胶一样在一定的浓度范围内表现出很好的流变学特性，非牛顿流体具有假塑流变性其保湿性和成膜性在化妆品方面也具有广泛的应用前景。
目前已报道的多糖产生菌生产多糖时，培养基成分营养丰富，通常会造成产物得率不高，副产物多，产品后续分离纯化过程复杂等问题，并且多糖生产大多停留在实验室水平。因此筛选得到一株营养要求低、多糖产量高又适合工业化规模生产多糖的菌株具有十分重要的意义。
本发明的目的在于提供并鉴定一株高产多糖的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01，以及利用该菌株发酵产生多糖的方法。该菌株发酵生产多糖的营养要求较低，并且在实验室条件下该菌株产多糖得率可高达60%，实践证明该菌株还比较适合中试发酵生产，分离提纯过程简单，更符合工业化生产低投入高产出的要求。
发明内容
本发明的发明人从土壤样品中分离筛选获得一株胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01，该菌于2012年2月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5766。
对于胶质芽孢杆菌的菌种鉴定，其步骤如下：
（1）形态特征的观察：将菌株SM-01接种于无氮固体平板培养基上，30℃下培养48h后观察菌落形态；挑取单菌落，进行革兰氏染色，用光学显微镜观察菌体形态、大小。
（2）分子生物学鉴定：提取菌株SM-01的基因组DNA、16S rDNA的PCR扩增、PCR产物的回收纯化与测序（序列测定工作由上海生工生物工程有限公司完成）。将测得的序列在NCBI中利用Blast软件进行比对，选取同源性较高的序列用DNAMAN软件编辑后，利用软件CLUSTAL X ver. 1.81和MEGA ver. 3.1，基于菌株的16S rDNA序列以neighbor-joining法构建系统发育树。
应用上述微生物发酵生产的方法，其步骤如下：
（1）采用保藏号为CGMCC No.5766的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01为生产菌株，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到无氮固体培养基上；
（2）制备SM-01菌株的细胞液体培养物：挑取步骤（1）中固体培养基上的SM-01菌株一环，接种于已灭菌的装有40-80 mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，培养温度为28-32℃，置摇床上以150-200 r/min的转速培养20-32 h至对数生长期，即得到SM-01菌株的细胞液体培养物；
（3）发酵培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量为500 mL锥形瓶中装40-80 mL发酵培养基，培养温度为28-32℃，在150-200 r/min的转速下培养60-84 h，得多糖发酵液。
（4）多糖的分离提取：取步骤（3）所得发酵液按体积稀释2-4倍，将稀释后的发酵液于冷冻离心机8000-12000rpm，4℃离心20-40min去除菌体，取上清液于旋转蒸发仪浓缩至原体积，加2-4倍体积95%乙醇并不断搅拌，4℃静置12-24h，4000-6000rpm，4℃,离心10-20min得到沉淀，将沉淀用适量乙醇抽提3次，用等体积去离子水复溶沉淀，多糖溶液置4℃透析过夜，加入2-4倍体积95%乙醇不断搅拌，4℃放置24h，4000-6000rpm，4℃离心10-20min得沉淀，将沉淀于真空干燥机烘干或复溶后冷冻干燥得多糖。
（5）多糖含量测定：精确称取1g多糖发酵液，加3倍质量95%乙醇不断搅拌至沉淀完全，4℃静置12-24h，4000-6000rpm，4℃离心10-20min得到沉淀，将所得沉淀于烘箱中80℃烘干至恒重，称重，每个样品重复三次。
其中步骤（1）中所述的固体培养基的成分及配比为：蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1 g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 1-5g/L；琼脂粉10-20 g/L；pH 7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；步骤（2）所述种子培养基的成分及配比为：蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min；步骤（3）所述发酵培养基的成分及配比同步骤（2）。
   本发明所述的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株所产多糖量高，并且能达到低投入高产出的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
附图说明
图1为胶质芽孢杆菌在固体平板上的形态。
图2为胶质芽孢杆菌在液体培养基中的形态。
图3 为通过Neighbor-Joining法所构建的基于胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01的16S rDNA基因序列的系统发育树。
图4为本发明的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01在发酵培养基中生产多糖的过程曲线。
具体实施方式
实施例1  胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01的分离鉴定以及菌株的保藏
(1)   胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01的分离、筛选
本发明中称取1.0-2.0 g土样于250 mL 三角瓶中，用10-50 mL生理盐水悬浮，然后置于水浴锅中，80℃处理10 min，冷却后进行梯度稀释，取0.2 mL稀释液涂布于无氮固体平板上进行初筛。30℃条件下培养48 h后，选取菌落圈较大的单菌落进行发酵验证。挑取单菌落接种到新鲜的液体种子培养基，30℃、150-200 r/min培养24 h，再以5%（v/v）的接种量接入装液量为50 mL/500 mL的发酵培养基，相同培养条件下培养60h，精确称取1g发酵液，95%乙醇沉淀法提纯，将沉淀于80℃烘箱中烘干至恒重，称量后计算多糖产量，筛选高产菌株。 
（2）胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01的鉴定
生理生化鉴定：参照伯杰细菌鉴定手册第8版。
该菌株在无氮固体平板上培养48h后形成无色、透明、边缘整齐的菌落，像半颗玻璃珠落在培养基上。菌落直径约0.5-1 cm，表面光滑、湿润而富有光泽，挑起时粘稠而难与培养基分离。在光学显微镜下观察菌体为革兰氏阳性菌，短杆状，末端呈圆形，菌体进入对数期后周围开始形成一层椭圆形荚膜，定中后期易形成芽孢，该菌在普通的LB及肉汤培养基上均无法生长。
分子生物学鉴定：在GenBank中与已知序列进行BLAST比对后的结果采用CLUSTAL X ver. 1.81和MEGA ver. 3.1软件，用neighbor-joining法构建系统发育树，系统发育树结果显示，菌株SM-01与胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus AHZ1 (EU592042)的同源性达到99%，可知SM-01菌株与该菌株属于同一个分枝。故结合传统的形态特征鉴定以及16S rDNA序列分析的结果，判定菌株SM-01即为胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus。
（3）菌株保藏：挑取一环胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株接种于无氮液体培养基中，28-32℃，150 r/min振荡培养40-48h后，取0.5 mL的细胞培养液转入装有0.5mL的60%甘油保藏管中，-80℃冷冻保藏。该菌2012年2月16日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为 CGMCC No.5766。  
实施例2胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01在500ml摇瓶中发酵产糖。
（1）制备胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物
挑取无氮固体培养基上的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株一环，接种在装有50 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以150 r/min的转速培养20-28h至对数期，即制得胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物。
（2） 发酵培养基的成分及配比为：蔗糖5-15 g/L； 尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）摇瓶发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以150 r/min的转速培养，发酵60 h得多糖发酵液。
实施例3胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）在5L发酵罐中发酵产糖。
（1）制备胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物
挑取无氮固体培养基上的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株一环，接种在装有50 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以150 r/min的转速培养20-28 h至对数期，即制得胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物。
（2） 发酵培养基的成分及配比为： 蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）摇瓶发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以150 r/min的转速培养，发酵20-28 h，菌体进入对数期。
（4）5L发酵罐发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（v/v）的接种量接种在装有已灭菌的3L发酵培养基的5L发酵罐中，在30℃条件下，转速为500r/min，通气量为300vvm，发酵48h得多糖发酵液。
实施例4胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01在15L发酵罐发酵产糖。
（1）制备胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物
挑取无氮固体培养基上的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株一环，接种在装有50 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以150 r/min的转速培养20-28 h至对数期，即制得胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物。
（2） 蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）摇瓶发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以150 r/min的转速培养，发酵20-28h至对数期。
（4）15L发酵罐发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（v/v）的接种量接种在装有已灭菌的10L发酵培养基的15L发酵罐中，在30℃条件下，转速为500r/min，通气量为300vvm，发酵48h得多糖发酵液。
实施例5胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01在50L发酵罐中发酵产糖。
（1）制备胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物
挑取无氮固体培养基上的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株一环，接种在装有50 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以150 r/min的转速培养20-28 h至对数期，即制得胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物。
（2）发酵培养基的成分及配比为： 蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）摇瓶发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以150 r/min的转速培养，发酵20-24h至对数期。
（4）5L发酵罐发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（v/v）的接种量接种在装有已灭菌的3L发酵培养基的5L发酵罐中，在30℃条件下，转速为500r/min，通气量为300vvm，发酵20h得多糖发酵液。
（5）50L发酵罐发酵：将上述5L发酵罐中培养到对数期的细胞液培养物为种子以1%（v/v）的接种量接种在装有已灭菌的30L发酵培养基的50L发酵罐中，在30℃条件下，转速为500r/min，通气量为400vvm，发酵60h得多糖发酵液。
实施例6胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01在500公斤发酵罐中发酵产糖。
（1）制备胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物
挑取无氮固体培养基上的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株一环，接种在装有50 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以150 r/min的转速培养20-28h至对数期，即制得胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物。
（2）发酵培养基的成分及配比为： 蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）摇瓶发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以150 r/min的转速培养，发酵20-24 h至对数期。
（4）500公斤发酵罐发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以3‰（v/v）的接种量接种在装有已灭菌的350 公斤发酵培养基的500 公斤发酵罐中，在30-31℃条件下，通气量为25Nm3/h，转速为100-150r/min,，发酵72h。
实施例7胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01在1t发酵罐中发酵产糖。
（1）制备胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物
挑取无氮固体培养基上的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株一环，接种在装有50 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以150 r/min的转速培养20-24 h至对数期，即制得胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物。
（2）发酵培养基的成分及配比为： 蔗糖5-15 g/L；尿素0.1-1g/L；K2HPO4 0.2-2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2-2g/L；NaCl 0.2-2g/L；CaCO3 3-8g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）摇瓶发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，在30℃条件下，置于摇床上以150 r/min的转速培养，发酵20-24 h至对数期。
（4）1t发酵罐发酵：将上述胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01菌株的细胞液体培养物以1‰（v/v）的接种量接种在装有已灭菌的700 公斤发酵培养基的1t发酵罐中，在30-32℃条件下，通气量为30Nm3/h，转速为100-150r/min,，发酵84h。 

Claims (2)

1.一株高产多糖的菌株，该菌株为胶质芽孢杆菌，又名硅酸盐细菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01，该菌于2012年2月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5766。
2. 一种利用胶质芽孢杆菌SM-01生产微生物多糖的方法，其特征为按以下步骤生产：
（1） 斜面种子培养：采用保藏号为CGMCC No.5766的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01为生产菌株，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到无氮固体培养基上；
（2） 摇瓶种子培养：挑取步骤（1）中固体培养基上的SM-01菌株一环，接种于已灭菌的装有40-80 mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，培养温度为28-32℃，置摇床上以150-200 r/min的转速培养20-32 h至对数生长期，即得到SM-01菌株的细胞液体培养物；
（3） 发酵罐培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以4-8%w/w的接种量接入发酵培养基，装液量为500 mL锥形瓶中装40-80 mL发酵培养基，培养温度为28-32℃，在150-200 r/min的转速下培养60-84 h，得多糖发酵液；
（4） 多糖的分离提取：取步骤（3）所得发酵液按体积稀释2-4倍，将稀释后的发酵液于冷冻离心机8000-12000rpm，4℃离心20-40min去除菌体，取上清液于旋转蒸发仪浓缩至原体积，加2-4倍体积95%乙醇并不断搅拌，4℃静置12-24h，4000-6000rpm，4℃,离心10-20min得到沉淀，将沉淀用适量乙醇抽提3次，用等体积去离子水复溶沉淀，多糖溶液置4℃透析过夜，加入2-4倍体积95%乙醇不断搅拌，4℃放置24h，4000-6000rpm，4℃离心10-20min得沉淀，将沉淀于真空干燥机烘干或复溶后冷冻干燥得多糖；
其中步骤（1）中所述的固体培养基的成分及配比为（g/L）：蔗糖5-15；尿素0.1-1；K2HPO4 0.2-2；MgSO4·7H2O 0.2-2；NaCl 0.2-2；CaCO3 1-5；琼脂粉10-20，pH 7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；步骤（2）所述种子培养基的成分及配比为（g/L）：蔗糖5-15；尿素0.1-1；K2HPO4 0.2-2；MgSO4·7H2O 0.2-2；NaCl 0.2-2；CaCO33-8，121℃高压蒸汽灭菌20min；步骤（3）所述发酵培养基的成分及配比同步骤（2）。
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