CN112143664B

CN112143664B - 一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成微生物多糖中的应用

Info

Publication number: CN112143664B
Application number: CN202010649533.8A
Authority: CN
Inventors: 吴凌天; 刘尚; 顾纹滔; 陈国轩; 秦翘; 蒋雯; 徐庶; 吴金男
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2040-07-08
Also published as: CN112143664A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT‑2(Bacillus velezensis LT‑2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2019904，保藏日期为2019年11月7日。本发明还公开了贝莱斯芽孢杆菌在合成微生物多糖中的应用。该菌株以非粮原料菊芋粉为碳源，大豆分离蛋白为有机氮源，磷酸氢二铵为无机氮源发酵合成微生物多糖的产量可达28.06g/L，生产速率为0.70g/L/h。本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌LT‑2菌株能利用非粮原料菊芋粉作为碳源快速发酵合成微生物多糖，总糖转化率最高可达70.15％，可大大降低微生物多糖发酵成本。本发明所述操作方法简单，成本较低，极具工业化推广应用前景，同时为微生物多糖的生物合成提供一种新工艺。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成微生物多糖中的应用

技术领域

本发明具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在合成微生物多糖中的应用，属于微生物学、生物工程技术和化工技术领域。

背景技术

生物多糖(Biological polysaccharide)广泛存在于微生物、大型真菌、动物和植物中，是天然界最丰富的聚合物之一。随着生物技术的高速发展，微生物多糖功能的研究也日益完善，成为免疫学、生物学和药学的研究热点。研究表明，微生物多糖(Microbialpolysaccharide)由于其独特的化学结构、优越的物理化学性质、流变学特性以及本身的生物活性和营养价值，微生物多糖在各个领域均具有相关应用。此外，微生物多糖具有生产周期短、原料廉价、纯化简单以及可在人工控制下进行大规模工业化生产等动植物多糖所不具备的优势。因此，微生物多糖正迅速成为重要的新兴的生物材料。但由于目前大多数微生物多糖的合成均以昂贵的粮食原料为底物，造成微生物多糖生产成本较高，使其价格居高不下，限制了微生物多糖的应用。因此，探寻一种能够利用非粮廉价原料合成微生物多糖的菌株不仅可以改善“与民争粮”的现象，也可大大降低微生物多糖生产成本。然而这类利用非粮原料合成微生物多糖菌株的产率极低，至今还未有用于生产的报道。

经检索，目前未见有使用贝莱斯芽孢杆菌发酵合成微生物多糖的专利报道。此外，目前报道的微生物多糖合成存在原料利用率低和生产成本高等问题，因此难以大规模工业化生产，从而限制了微生物多糖的大规模开发与应用。

发明内容

技术问题：针对于现有技术不足，本发明所要解决的问题是提供一株能够利用非粮廉价原料菊芋粉合成微生物多糖的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

本发明还要解决的技术问题是提供上述贝莱斯芽孢杆菌的应用。

技术方案：为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：

本发明从酒糟中筛选得到一株贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT-2(Bacillus velezensis LT-2)，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：M2019904，保藏日期为2019年11月7日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。

所属菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。

表1菌落形态学特征与生理生化特性

2、16S rDNA序列分析：

测得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQIDNo.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

上述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2利用非粮廉价原料菊芋粉发酵合成微生物多糖的应用也在本发明的保护范围之内。将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2接种于发酵培养基中进行好氧培养，制备微生物多糖。

具体的应用方法为：将贝莱斯芽孢杆菌LT-2接种于斜面固体培养基，然后转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有微生物多糖。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2及其所述菌在制备微生物多糖的应用，依次包括以下步骤：

1.培养基配制：

(1)斜面培养基成分为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5；

(2)液体种子培养基为：菊糖3g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氢钾5g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5；

(3)固体种子培养基为：菊糖3g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氢钾5g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5；

(4)发酵培养基：碳源10～50g/L，氮源5～20g/L，金属盐2.0～8.0g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5。

其中所述碳源为麦芽糖、菊糖、菊芋粉、果糖、葡萄糖和半乳糖的任意一种或几种的组合，碳源的添加量为10g/L～50g/L；优选碳源为菊糖、菊芋粉中的一种或两种的组合物，所述菊糖或菊芋粉加入后总糖浓度为量10g/L～50g/L，优选总糖浓度为20g/L。

所述氮源包括无氮源和有机氮源，所述的有机氮源包括：牛肉膏、大豆分离蛋白、鱼粉蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉和蛋白胨中的任意一种或几种的组合；所述有机氮源优选为大豆分离蛋白，所述大豆分离的优选添加量为8g/L；所述无机氮源包括：氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和硝酸铵中的任意一种或几种的组合，所述无机氮源优选为磷酸氢二铵，所述磷酸氢二铵的优选添加量为10g/L。

金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种的组合，优选硫酸亚铁0.20g/L，硫酸镁0.4g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸锰0.004g/L，氯化钙0.05g/L。

最优选的发酵培养基包含如下组分：菊芋粉(使培养基中总糖浓度为20g/L)、大豆分离蛋白8g/L、磷酸二氢铵10g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸亚铁0.20g/L，硫酸锰0.004g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.4g/L，利用氨水将发酵液初始pH调至7.5。其中所述菊芋粉由新鲜菊芋晒干粉碎制得。

2.菌种选择：

选已保藏菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

3.菌种活化：

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养16～20h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，24～36℃培养16～20h，得到活化菌种备用；

4.种子液制备：

取步骤(3)中活化好的菌种，无菌条件下接种3环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为24～36℃培养12h，最优选培养温度为32℃，得到发酵种子液；

5.摇瓶发酵培养：

将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以1％～8％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵培养基中，置于转速为200rpm的摇床上，24～36℃培养16～24h；当发酵液中微生物多糖浓度不再上升时，停止发酵；

6.发酵罐发酵培养：

将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以1％～15％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵罐中，装液量为3L/5L，转速为200～500rpm，通气比为1.0～1.2VVM，培养温度为24～36℃，初始pH为7.0～8.0，培养16～48h；当发酵液中微生物多糖浓度不再上升时，停止发酵；

7.微生物多糖的提取：

(1)取步骤5中贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵液离心除去菌体，上清液在65℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5后加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用75％乙醇洗涤，再高速离心收集沉淀恒温干燥后可获得微生物多糖粗品；

(2)将步骤(1)所得的多糖粗品溶解于双蒸水中，用Na₂CO₃调pH至7.0～8.0，加入质量为多糖1％～5％的胰蛋白酶，50～60℃水解1～2h后，用草酸调pH至5.0～6.0添加质量为多糖质量2‰～5‰的木瓜蛋白酶，60～70℃水解2～4h后，于100℃水浴加热4～6min，以终止酶反应；

(3)将步骤(2)所得蛋白酶处理液用草酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，12,000rpm离心10～15min，取上清；

(4)将步骤(3)所得清液加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；

(5)将步骤(4)所得多糖溶液用氨水调pH值至8.0，在50℃下滴加30％的H₂O₂，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用草酸中和pH至7.0；双蒸水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖精品；

8.微生物多糖含量测定：

本发明利用苯酚硫酸法测定多糖含量：

精密称取干燥恒重的葡萄糖，分别配置成0.000、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mg/mL的标准液，同时配置一定浓度的多糖溶液。精密吸取各标准液和多糖溶液0.2mL，分别置于试管内，各加5％苯酚试剂0.1mL和浓硫酸0.5mL，立刻摇匀。沸水加热15min，冰浴，以0mg/mL的标准液作空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，并计算多糖的含量。

9.微生物多糖的鉴定

采用高效液相色谱仪、红外光谱仪和核磁共振仪来鉴定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物。

①产物水解组分的分析

取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵提纯产物0.1g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于32℃水浴60min，取出后加入84mL双蒸水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，得到贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵水解液，将水解液进行液相色谱分析，确定其单糖组分。

②红外光谱与核磁共振分析

利用红外光谱仪测定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵提纯产物的红外光谱图：取样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm^-1。以D₂O为溶剂，对贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵提纯产物进行NMR¹H和NMR¹³C检测。

经分析本发明制备得到的微生物多糖的结构如下：

有益效果：本发明具有如下优势：

本发明首次筛选得到一株微生物多糖合成菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2，贝莱斯芽孢杆菌为食品安全性微生物，该菌株能够以菊芋粉和菊糖中的一种或两种的混合物为廉价碳源发酵合成微生物多糖，微生物多糖的产量可达到28.06g/L，总糖转化率为70.15％，生产速率为0.70g/L/h，大大降低了生产成本，而且操作简单，这对于微生物多糖的生产和菊芋资源的拓展应用具有十分重要的社会与经济意义。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌LT-2的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2的系统发育树(B)。

图2贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖水解后单糖组分高效液相色谱图。

图3为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖的红外光谱图。

图4为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖的核磁共振图(NMR)¹H图谱。

图5为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖的核磁共振图(NMR)¹³C图谱。

图6碳源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图7碳源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图8有机氮源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图9有机氮源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图10无机氮源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图11无机氮源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图12温度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图13pH对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图14为贝莱斯芽孢杆菌LT-2摇瓶水平合成微生物多糖进程曲线。

图15为50L发酵罐分批补料合成微生物多糖进程曲线。

图16为1t发酵罐分批补料合成微生物多糖进程曲线。

具体实施方式：

根据下列实施例可以更好的理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的分离筛选。

该实施例所用培养基的组成如下：

(1)富集液体培养基：菊糖20g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0；

(2)固体筛选培养基：菊糖20g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，苯胺蓝0.05g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值调至7.0～8.0；

(3)发酵培养基：菊糖20g/L，酵母粉5g/L、磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.8g/L，硫酸锰0.005g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0。

该实施例的具体操作过程如下：

筛选微生物多糖产生菌步骤如下：从36份酒曲中各取2g分别接入装有富集培养基的三角摇瓶中，装液量为80mL/500mL，在32℃、200rpm条件下富集培养24h。取3mL培养液转接到相同的液体富集培养基中在相同条件下进行第二次富集培养，培养24h，再反复1次，即富集3次。在无菌条件下，将第三次富集的培养液稀释至10^-8和10^-9，各取200μL涂布于固体筛选培养基上，32℃培养24h。根据菌落表面湿润粘稠的程度和合成产物与苯胺蓝反应的颜色变化，筛选出阳性菌株并进行分离纯化，再接种到多糖发酵培养基中，在32℃，200rpm条件下培养24h，然后测定初筛菌株多糖的产量，以此获得产量最高的菌株。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的鉴定。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的基因组DNA，以上游引物27F和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测序结果与GeneBank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程序进行同源性比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体命名为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2。

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物的鉴定

①水解产物分析

取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵液于5,000rpm条件下离心除去菌体，上清液在60～70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5，加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用无水乙醇脱水，经过高速离心收集沉淀，恒温干燥后可获得发酵产物粗品；将发酵产物粗品溶解于双蒸水中，用Na₂CO₃调pH至7.0～8.0，加入质量为多糖2％～5％的胰蛋白酶，45～55℃酶解1～2h后，用醋酸调pH至5.0～6.0添加质量为发酵产物质量2％～5％的木瓜蛋白酶，55～65℃水解2～4h后，于100℃水浴加热15～30min，终止酶反应；将蛋白酶处理液用醋酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，5,000rpm离心10～15min，取上清加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得发酵产物溶液；用氨水调pH值至8.0，在50℃下滴加30％的H₂O₂，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用稀盐酸中和pH至7.0；双蒸水透析2～4d后，冷冻干燥得发酵提纯产物。

取发酵提纯产物0.1g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于32℃水浴60min，取出后加入双蒸水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，得到发酵产物水解液，发酵产物水解液液相色谱结果如图2所示。从高效液相色谱图中可以看出，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物共有1种单糖组分，且与葡萄糖标准品出峰时间一致，因此可以初步确定发酵产物为葡聚糖。

②红外光谱与核磁共振分析

利用红外光谱仪测定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵提纯产物的红外图谱，取样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm^-1。以氘水为溶剂，对B.velezensis LT-2发酵产物进行一维核磁共振检测。结果如图3、图4和图5所示，红外光谱、NMR ¹H和NMR ¹³C所示贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2发酵产物的特征峰均属于生物多糖特征峰。确定B.velezensis LT-2发酵产物为微生物多糖即葡聚糖。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖碳源种类的优化

本实施例说明不同种类的碳源对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于含20g/L(发酵液中总糖浓度)麦芽糖(Mal)、菊糖(Inu)、菊芋粉(JATP)、果糖(Frc)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同碳源发酵液进行步骤8的操作，计算微生物多糖的含量。以菊糖和菊芋粉为碳源所得微生物多糖产量最高，考虑到菊芋粉成本较低，因此选用菊芋粉为最佳碳源。微生物多糖产量达到6.88g/L，总糖转化率为34.40％，生产速率为0.29g/L/h(图6)。

实施例5：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖碳源浓度的优化

本实施例说明不同总糖(菊芋粉)浓度对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于总糖浓度为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L、的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同糖浓度的发酵液，进行步骤8操作，计算微生物多糖的含量，测得当总糖的浓度为20g/L时，总糖转化率最高为42.70％，微生物多糖产量达到8.54g/L，生产速率为0.36g/L/h。因此，选用20g/L的糖浓度为进行后续发酵(图7)。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖有机氮源种类的优化

本实施例说明不同有机氮源对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于5g/L牛肉膏(BE)、大豆分离蛋白(SPI)、鱼粉蛋白胨(FP)、黄豆粉(SC)、花生饼粉(PM)和蛋白胨(PT)的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同有机氮源发酵液进行步骤8的操作，计算微生物多糖的含量，以大豆分离蛋白为有机氮源时微生物多糖产量达到最高为8.98g/L，总糖转化率最高为44.90％，生产速率为0.37g/L/h。因此，选用大豆分离蛋白作为最佳有机氮源(图8)。

实施例7：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖大豆分离蛋白浓度的优化

本实施例说明不同大豆分离蛋白浓度对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于含2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L和12g/L大豆分离蛋白的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取各个浓度大豆分离蛋白发酵液进行步骤8的操作，计算微生物多糖的含量。当大豆分离蛋白浓度为8g/L时微生物多糖产量达到9.83g/L，总糖转化率为49.17％，生产速率为0.41g/L/h。因此，鉴于经济原因，选用8g/L的大豆分离蛋白进行后续发酵(图9)。

实施例8：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖无机氮源种类的优化

本实施例说明不同无机氮源对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于5g/L氯化铵(A)、硫酸铵(B)、尿素(C)、磷酸氢二铵(D)、磷酸二氢铵(E)和硝酸铵(F)的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同无机氮源发酵液进行步骤8的操作，计算微生物多糖的含量，以磷酸氢二铵为无机氮源时微生物多糖产量达到11.56g/L，总糖转化率为57.80％，生产速率为0.48g/L/h。因此，选用磷酸氢二铵为最佳无机氮源(图10)。

实施例9：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖磷酸氢二铵浓度的优化本实施例说明不同磷酸氢二铵浓度对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于含5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L磷酸氢二铵的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取各个浓度磷酸氢二铵发酵液进行步骤8的操作，计算微生物多糖的含量。当磷酸氢二铵浓度为10g/L时微生物多糖产量为12.10g/L，总糖转化率为60.50％，生产速率为0.50g/L/h。因此，鉴于经济原因，选用10g/L的磷酸氢二铵进行后续发酵(图11)。

实施例10：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖温度的优化

本实施例说明不同温度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵制备微生物多糖产量的影响，将种子培养液5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，培养温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取各个温度的发酵液进行步骤8的操作，计算微生物多糖的含量，得出当温度为28℃时微生物多糖含量最高位12.68g/L，总糖转化率为63.42％，生产速率为0.53g/L/h。因此，选用28℃为最佳发酵温度(图12)。

实施例11：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖pH的优化

本实施例说明不同pH值对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，于28℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，培养pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的发酵培养基中，取各pH值下的发酵液进行步骤8的操作，通过标准曲线来计算微生物多糖的含量，得出当pH值为7.5时微生物多糖含量最高为12.98g/L，总糖转化率为64.90％，生产速率为0.54g/L/h。因此，选用pH值7.5为最佳发酵pH值(图13)。

实施例12：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成微生物多糖的所需金属盐种类及其浓度的优化

本实施例说明不同金属盐及其浓度对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以5％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各金属盐浓度中，经过单因素变量实验如下：

硫酸亚铁：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，硫酸亚铁最佳浓度为0.20g/L；

硫酸镁：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2g/L以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.40g/L；

磷酸二氢钾：1、2、3、4、5、6、7、和8g/L以及对照组，磷酸二氢钾最佳浓度为0g/L(不添加)；

磷酸氢二钾：1、2、3、4、5、6、7、和8g/L以及对照组，磷酸氢二钾最佳浓度为6g/L；

硫酸锰0.001、0.002、0.003、0.004、0.005和0.006g/L以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.004g/L；

氯化钙：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，氯化钙最佳浓度为0.05g/L。

对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属盐设置3组平行对照，初始pH值为7.5，于28℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，取各金属盐浓度下的发酵液进行步骤8的操作计算微生物多糖的含量。当在上述最优金属盐条件下(硫酸亚铁0.20g/L，硫酸镁0.4g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸锰0.004g/L，氯化钙0.05g/L)，菌株产微生物多糖产量为13.25g/L，总糖转化率为66.25％，生产速率为0.55g/L/h(图14)。

实例13：50L发酵罐分批补料合成微生物多糖

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，32℃静置培养16h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，32℃培养16h，得到活化菌种备用；取活化好的菌种，无菌条件下接种2环于含有种子培养基的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为32℃培养16h，得到发酵种子液；将种子液按体积比为5％的接种量接入无菌发酵培养基(菊芋粉(使培养基中总糖浓度为20g/L)、大豆分离蛋白8g/L、磷酸二氢铵10g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸亚铁0.20g/L，硫酸锰0.004g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.4g/L，利用氨水将发酵液初始pH调至7.5。)中，发酵罐总装液量为30L，发酵温度为28℃，搅拌转速200rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.5，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.5左右；发酵时间为48小时。每隔4小时取样测定发酵液中的微生物多糖浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中微生物多糖含量，发现经过一次补料微生物多糖产量达到27.59g/L，总糖转化率为68.98％，生产速率为0.63g/L/h(图15)。

实例14：1t发酵罐分批补料合成微生物多糖

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2种子液按体积比为8％的接种量接入无菌发酵培养基(菊芋粉(使培养基中总糖浓度为20g/L)、大豆分离蛋白8g/L、磷酸二氢铵10g/L，磷酸氢二钾6g/L，硫酸亚铁0.20g/L，硫酸锰0.004g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.4g/L，利用氨水将发酵液初始pH调至7.5。)中，发酵罐总装液量700L，发酵温度为28℃，搅拌转速260rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.5，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.5左右；发酵时间48小时。每隔4小时取样测定发酵液中的微生物多糖浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中微生物多糖产量达到28.06g/L，总糖转化率为70.15％，生产速率为0.70g/L/h(图16)。

注：本实施例中发酵培养基是优化后的最佳培养基，但碳源进行补料了，因此得到了更高产量的微生物多糖和γ-聚谷氨酸。

最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成微生物多糖中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 60

gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatgcttgt 120

ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 180

ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 240

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 360

ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca 420

ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480

gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa 540

gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 600

tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 660

caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 720

agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 780

ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 840

tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag 960

ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1020

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt 1080

cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgggcag aacaaagggc 1200

agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 1260

caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1320

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1380

cggtgaggta accttt 1396

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌在制备微生物多糖的应用，所述贝莱斯芽孢杆菌的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LT-2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019904，保藏日期为2019年11月7日。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌合成的微生物多糖结构如下：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)LT-2接种于发酵培养基中进行好氧培养，制备微生物多糖。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下组分：碳源10～80g/L，氮源5～20g/L，金属盐2.0～8.0g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为麦芽糖、菊糖、菊芋粉、果糖、葡萄糖、半乳糖的任意一种或几种的组合；

所述氮源为牛肉膏、大豆分离蛋白、鱼粉蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉和蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硝酸铵中的任意一种或几种的组合；

所述金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙中的一种或几种的组合。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述碳源为菊芋粉、菊糖中的一种或两种的混合物。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包含如下组分：菊芋粉10～80g/L、大豆分离蛋白2～12g/L、磷酸二氢铵5～15g/L，磷酸氢二钾2～12g/L，硫酸亚铁0.10～0.20g/L，硫酸锰0.001～0.005g/L，氯化钙0.02～0.08g/L，硫酸镁0.2～0.8g/L，利用氨水调节pH为7.5。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的好氧培养，其培养条件如下：初始pH为7.0～8.0、培养温度为28～32℃；

当好氧培养为摇瓶培养时，接种量为每100mL发酵液接种1～8mL种子液，培养时间36～54h；

当好氧培养为发酵罐培养时，发酵罐接种量为每100mL发酵液接种1～15mL种子液，发酵方式为分批补料法，通气比为1.0～1.4VVM，发酵罐培养时间24～48h。