CN101899407A - 一株高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌mel09的筛选及应用 - Google Patents
一株高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌mel09的筛选及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及一株高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)MEL09的筛选及应用。该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M209173。其生物学特性为：形态为棒杆状，在LB固体培养基上菌落圆形、边缘不齐、毛发状、菌苔干燥、不透明、蔓延、灰白色，产芽孢，V.P.反应呈阳性。利用该菌株葡萄糖为碳源，在37℃摇瓶培养36h可产生40.66g/L的3-羟基丁酮。由该菌株产生的3-羟基丁酮是一种重要的化工原料，可广泛应用于食品化工医药等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)MEL09的筛选及应用。
背景技术
3-羟基丁酮又名乙偶姻，自然界存在于玉米、可可、干酪及肉类等多种食品中，3-羟基丁酮作为一种平台化合物，广泛应用于食品、制约及化工等行业。随着对3-羟基丁酮的需求量的日益增加，3-羟基丁酮的生产方法的研究也引起了人研究者的广泛关注。目前，主要采用化学法、酶法利微生物发酵法合成3-羟基丁酮。化学法以丁二酮及2，3-丁二醇为原材料，存在着副产物多、产品纯度低及环境污染严重等问题，且产品的质量很难达到目前3-羟基丁酮的最大消费领域------食用级香料的要求。酶转化法和化学法相似，也是以丁二酮或2，3-丁二醇为原料，经生物体内的酶氧化或还原生成3-羟基丁酮。区别在于酶法产物得率高、副产物少，并且产物具有旋光度，但要获得大量特异性的酶比较困难。而且，生产3-羟基丁酮的原料丁二酮及2，3-丁二醇均来自于不可再生的石化资源石油，这势必会增加生产3-羟基丁酮的成本。因此这两种工艺无法得到大规模地推广应用。
以糖质原料发酵生产3-羟基丁酮的微生物主要包括克雷伯氏菌属、肠杆菌属、芽胞杆菌属、类芽胞杆菌属、沙雷氏菌属及乳球菌属等细菌。但在大多数菌株代谢过程中，3-羟基丁酮均是作为丁二酮，2，3-丁二醇的副产物而存在的，因此发酵过程中积累的3-羟基丁酮浓度较低，直接导致发酵法生产3-羟基丁酮难以实现工业化。因此，筛选得到一株高产3-羟基丁酮的微生物具有非常重要的意义。而关于地衣芽孢杆菌生产3-羟基丁酮的研究并未见国内文献报道。
发明内容
【要解决的问题】
本发明的目的在于针对现有3-羟基丁酮的生产方法中的技术难点及存在的问题，提供一株新型的高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌，利用该菌株发酵可产生高浓度的3-羟基丁酮，该菌株是极具开发研究价值的3-羟基丁酮的生产菌株。
发明内容
本发明的发明人从国内食醋厂取得土样分离筛选获得一株产3-羟基丁酮新型地衣芽胞杆菌MEL09，对这株菌进行了发酵研究。
本发明提供的菌株是从国内食醋厂取得土样分离筛选获得一株芽胞杆菌，16S rDNA结合形态特征、生理生化特性，将其鉴定为Bacillus licheniformis，编号为MEL09。该菌2009年8月7日保存于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M209173。
本发明提供的地衣芽胞杆菌MEL09的形态特征与生理生化特征为经过筛选获得的地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)MEL09菌株形态为棒杆状，在LB固体培养基上菌落圆形、边缘不齐、毛发状、菌苔干燥、不透明、蔓延、灰白色。产芽孢，V.P.反应呈阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，可水解淀粉、酪蛋白、明胶，可利用柠檬酸盐，可在质量分数为7％的NaCl中生长，可在55℃下生长。生理生化特征见表1：
表1
项目 结果 项目 结果
棒杆状 + 水解酪蛋白 +
芽胞 + 水解淀粉 +
V.P.反应 + 吲哚生成 +
D-葡萄糖产酸 + 水解明胶 +
L-阿拉伯糖产酸 + 柠檬酸盐 +
D-木糖产酸 + 丙酸盐 +
甘露醇产酸 + 苯丙氨酸脱氨酶 +
葡萄糖产气 - 酪氨酸水解 -
吲哚 + 触酶 +
硝酸盐还原 +
利用通用引物PCR扩增该菌的16S rDNA，得到上述芽胞杆菌MEL09的16S rRNA基因序列1109bp，Genebank登记号为FJ715927，应用BLAST程序与数据库中的已有细菌16S rDNA序列进行相似性比较分析，MEL09菌株的基因序列(见序列表SEQ ID NO：1)与地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DSM13相似性高达97％。结合生理生化分析及16S rDNA序列分析结果，将菌株MEL09鉴定为芽胞杆菌属地衣芽胞杆菌。
本发明提供的芽胞杆菌MEL09是具有良好前景的产3-羟基丁酮的新型地衣芽孢杆菌株，该菌株可在高渗LB培养基中生长。高渗LB培养基配方为：葡萄糖100-500g/L；蛋白胨5-20g/L；酵母粉4-10g/L；NaCl 5-20g/L；琼脂粉10-20g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min；
上述的地衣芽胞杆菌MEL09可以采用发酵法生产3-羟基丁酮。
应用上述微生物生产3-羟基丁酮的方法，其步骤如下：
(1)采用保藏号为CCTCC NO：M209173的地衣芽胞杆菌MEL09为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到LB固体培养基上；
(2)制备的地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物：挑取步骤(1)的LB 固体培养基上的MEL09菌株一环，接种于装有30-100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为30-40℃，置摇床上以200r/min的转速培养9-12h至对数生长中期，即得到MEL09菌株的细胞液体培养物；
(3)发酵培养：按250mL三角瓶装20-60mL的量，投入发酵培养基，接种步骤(2)的地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物，接种量按体积比计为1-5％，培养温度为30-40℃，在摇床上以120-200r/min的转速下培养36-48h，得到发酵液；或按发酵罐容积的40-80％投入所述的发酵培养基，以0.07-0.1MPa高压蒸汽灭菌维持30min，冷却至30℃-40℃，接入步骤(2)所述的地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物，接种量按体积比计为1-5％；培养温度为30℃-40℃，控制通气量为1：0.5-2vvm，控制发酵罐的搅拌转速为200-600r/min；发酵时间为36-48h，得到发酵液；
(4)产物检测：将步骤(3)的发酵液在8000-12000r/min下离心5-10min，收集上清进行气相色谱检测分析发酵液中3-羟基丁酮的含量；以色谱纯异丁醇(1g/L)作为内标，测定条件：使用FFAP毛细管柱，FID检测器，载气为氮气(N2)流速柱头压0.1Mpa；进样口温度：200℃，检测器温度：200℃；程序升温：80℃保1min，10℃/min升温至150℃，保时2min；进样量0.2μL。上述条件下3-羟基丁酮的保留时间为3.1min，丁二醇保留时间为6.2min。
其中
步骤(1)或(2)中所述的LB培养基的成分及配比为：蛋白胨5-20g/L；酵母粉4-10g/L；NaCl 5-20g/L；琼脂粉10-20g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为：碳源40-160g/L，有机氮源6-30g/L，(NH4)2SO4 1-13g/L；K2HPO4 0.1-5.0g/L；MgSO4 0.1-5g/L；NaCl 0.5-2g/L；ZnCl2 0.05-0.50g/L；FeCl3 0.01-0.5g/L；MnSO4 0.005-0.10g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至6.5-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
在本发明中，上述步骤(3)所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-甘露糖、木糖、糖蜜的一种或两种；所述的有机氮源选自玉米浆、蛋白胨或酵母粉中的一种或两种。
本发明所述的地衣芽胞杆菌MEL09可转化碳源直接生成3-羟基丁酮，发酵液中3-羟基丁酮浓度高，碳源转化率高，是一株极具开发研究价值的3-羟基丁酮的生产菌株。
附图说明(图或表)
图1为本发明的B.licheniformis MEL09菌株在葡萄糖发酵培养基中发酵生产3-羟基丁酮的结果。
【有益效果】
提供了一种具有工业应用潜力的生产3-羟基丁酮的优良菌株。
具体实施方式
实施例1地衣芽胞杆菌MEL09的分离鉴定以及菌株的保存
(1)芽胞杆菌MEL09的分离、筛选
本发明从国内食醋厂取得土样，称取1.0-2.0g土样于250mL三角瓶中，用10-50mL无菌水悬浮，然后置于水浴锅中，60℃处理10min，冷却后进行梯度稀释，取0.2mL稀释液涂布于LB 固体平板上，30℃-40℃培养24-36h后，挑取单菌落，进行V.P.实验检测。挑选V.P.反应阳性的菌株进行发酵验证。挑取V.P.反应阳性的菌株单菌落接种到新鲜的LB液体培养基中培养12h后，细胞液体培养物以3％的体积比的接种量接于装有30mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，30℃-40℃，以200r/min的转速振荡培养，36h后收集发酵液，8000-12000r/min离心5-10min，收集上清液，采用气相色谱法检测3-羟基丁酮产量。
(2)芽胞杆菌MEL09的鉴定
生理生化鉴定：参照伯杰细菌鉴定手册第8版
菌株形态为棒杆状，在LB固体培养基上菌落圆形，边缘不齐，毛发状，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰白色。产芽孢，V.P.反应呈阳性，可利用葡萄糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇产酸，可水解淀粉，酪蛋白，明胶，可利用柠檬酸盐。
16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定：
芽孢杆菌MEL09基因组DNA抽提：将筛选得到的菌株在LB固体平板上划线，置37℃过夜培养后，挑取少量菌体，转接于LB摇瓶培养，于37℃以200r/min振荡培养到OD600的值约为0.2-0.3；离心收集菌体，以STE(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗涤菌体1次；加100L溶液I(50mmol/L蔗糖，25mmol/LTris HCl，pH 8.0，10mmol/LEDTA)悬浮菌体，再加30mg/mL的溶菌酶20μL，冰浴放置过夜；加200μL 2％SDS，轻缓混匀后置60℃水浴30min；加100μL的5mol/LNaCl溶液，轻缓混匀后置冰浴上10min；以12000r/min离心5min，吸取上清液到一个新的Eppendorf管，用苯酚氯仿异戊醇溶液(24∶24∶1，v/v)抽提2次；上清液加2倍体积的95％乙醇，于室温下放5-10min后，把溶液吸除后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再用70％乙醇离心洗涤沉淀1次；真空干燥沉涤，用20μL ddH2O，加入10mg/mL的RNase溶液1-2μL，混匀后置37℃0.5h以上，即为制备的总DNA溶液。取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，按基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。扩增用引物为原核生物通用引物，引物由北京奥科生物技术公司合成。
Primer 1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
Primer 2：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′
PCR反应采用25μL的体系：
10×buffer(含Mg2+) 25μL
dNTPs(10mmol/L) 2.5μL
P1(10pmol/L) 1μL
P2(10pmol/L) 1μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25μL
Template DNA(1-3ug) 1μL
ddH2O 16.75μL
PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、57℃退火1min、72℃延伸1.5min、28个循环；72℃补平末端5min；4℃保温10min。PCR扩增产物的纯化按上海华舜生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明，测序由北京奥科生物技术公司完成。经测序后获得的16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属。
菌株保存：挑取本发明菌株MEL09接于LB液体培养基中，30-40℃，200r/min振荡培养24-30h后，取0.8mL的细胞培养液转入装有0.8mL的80％的甘油保藏管中，-70℃冷冻保藏。该菌2009年8月7日保存于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M209173。
实施例2：利用葡萄糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物
挑取固体LB培养基上的地衣芽胞杆菌MEL09菌株一环，接种在装有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，在30℃-40℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养9-12h至对数生长中期，即制得地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖60g/L；蛋白胨5g/L；酵母膏6g/L；(NH4)2SO4 5g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4 0.5g/L；NaCl 2.0g/L；ZnCl2 0.05g/L；FeCl3 0.01g/L；MnSO4 0.005g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的产量达到18.02g/L。
实施例3：改变发酵条件，利用葡萄糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖140g/L；蛋白胨9g/L；酵母膏8g/L；(NH4)2SO4 9g/L；K2HPO41.0g/L；MgSO4 1.0g/L；NaCl 0.5g/L；ZnCl2 0.40g/L；FeCl3 0.50g/L；MnSO4 0.10g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到40.66g/L。
实施例4：改变发酵条件，利用葡萄糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖100g/L；蛋白胨11g/L；酵母膏10g/L；(NH4)2SO4 8g/L；K2HPO4 1.5g/L；MgSO4 1.5g/L；NaCl 1.0g/L；ZnCl2 0.35g/L；FeCl3 0.45g/L；MnSO4 0.05g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后48h，3-羟基丁酮的浓度达到34.83g/L。
实施例5：改变发酵条件，利用葡萄糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述地衣芽胞杆菌MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖80g/L；蛋白胨3g/L；酵母膏12g/L；(NH4)2SO4 3g/L；K2HPO4 2.5g/L；MgSO4 2.5g/L；NaCl 1.5g/L；ZnCl2 0.10g/L；FeCl3 0.02g/L MnSO4 0.01g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到22.32g/L。
实施例6：改变发酵条件，利用葡萄糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖120g/L；蛋白胨5g/L；酵母膏9g/L；(NH4)2SO4 7g/L；K2HPO42.0g/L MgSO4 2.0g/L；NaCl 0.5g/L；ZnCl2 0.15g/L；FeCl3 0.05g/L；MnSO4 0.015g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到38.62g/L。
实施例7：利用蔗糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：蔗糖60g/L；蛋白胨9g/L；酵母膏14g/L；(NH4)2SO4 6g/L；K2HPO43.0g/L；MgSO4 3.0g/L；NaCl 2.0g/L；ZnCl2 0.20g/L；FeCl3 0.10g/L；MnSO4 0.020g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到11.23g/L。
实施例8：利用麦芽糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：麦芽糖60g/L；蛋白胨7g/L；酵母膏7g/L；(NH4)2SO4 11g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4 0.5g/L；NaCl 2.0g/L；ZnCl2 0.25g/L；FeCl3 0.15g/L；MnSO4 0.025g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到19.15g/L。
实施例9：利用甘露糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：甘露糖60g/L；蛋白胨5g/L；酵母膏8g/L；(NH4)2SO4 13g/L；K2HPO43.5g/L；MgSO4 0.5g/L；NaCl 2.0g/L；ZnCl2 0.30g/L；FeCl3 0.20g/L；MnSO4 0.030g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到16.17g/L。
实施例10：利用木糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述Blicheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：木糖60g/L；蛋白胨3g/L；酵母膏6g/L；(NH4)2SO4 11g/L；K2HPO44.5g/L；MgSO4 5g/L；NaCl 2.0g/L；ZnCl2 0.30g/L；FeCl3 0.25g/L；MnSO4 0.025g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到6.25g/L。
实施例11：利用玉米浆为有机氮源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述Blicheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖120g/L；玉米浆25g/L；(NH4)2SO4 5g/L；K2HPO4 4.0g/L；MgSO4 4.5g/L；NaCl 0.5g/L；ZnCl2 0.25g/L；FeCl3 0.05g/L；MnSO4 0.015g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到35.60g/L。
实施例12：利用糖蜜为碳源玉米浆为有机氮源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)糖蜜的处理：粗糖蜜用蒸馏水稀释2倍，再用5mol/L硫酸调整其pH为3.0，在100℃处理1h，然后在室温下过夜放置，过夜处理的粗糖蜜在8000g下离心15min，上清用10mol/L NaOH调整其pH为6.5放置于冰箱中待用；
(3)发酵培养基的成分及配比为：糖蜜上清液200-300mL；玉米浆20g/L；(NH4)2SO4 5g/L；K2HPO4 4.0g/L；MgSO4 4.5g/L；NaCl 0.5g/L；ZnCl2 0.25g/L；FeCl3 0.05g/L；MnSO4 0.015g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到25.18g/L。
实施例13：利用木糖与葡萄糖为碳源的发酵培养基，在摇瓶中发酵生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖45g/L；木糖15g/L；玉米浆25g/L；(NH4)2SO4 8.0g/L；K2HPO42.5g/L；MgSO4 2.0g/L；NaCl 1.0g/L；ZnCl2 0.30g/L；FeCl3 0.025g/L；MnSO4 0.025g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养，接种后36h，3-羟基丁酮的浓度达到13.11g/L。
实施例14：利用葡萄糖为碳源的发酵培养基在发酵罐中生产3-羟基丁酮
(1)制备上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物同实施例1。
(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖100g/L蛋白胨3g/L；酵母膏8g/L；(NH4)2SO4 10g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4 0.5g/L；NaCl 1.5g/L；ZnCl2 0.20g/L；FeCl3 0.04g/L；MnSO4 0.020g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
将上述B.licheniformis MEL09菌株的细胞液体培养物以体积比3％的接种量接种在装有灭菌的2.1L发酵培养基的3L发酵罐中，通气量1∶1(vvm)，转速600r/min，温度37℃，发酵至36h结束发酵。气相色谱检测分析所得到的3-羟基丁酮的浓度为36.28g/L。
<110>江南大学
<120>一株高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌株MEL09的筛选及应用
<160>1
<170>Patent Inversion 3.1
<210>1
<211>1109
<212>DNA
<213>地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1109)
<223>n＝a或g或c或t
<308>FJ715927
<400>1
cgagtccgac ggaggcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcgatcgta actctgtgta 60
gggaagacaa gtacgtcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaacaga aagccacggc 120
tactacgtgc cagcagcgcg gtaatacgta ggtgcaagcg tgtcctgaat atgggcgtaa 180
agcgcgcgca ggctgtttcc taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 240
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 300
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 360
cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 420
aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc aaacgcatta 480
agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 540
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 600
gacatcctct ggcaacccta gagatagggc ttccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 660
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 720
ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 780
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 840
ctacaatggg cagaacaaag ggcagcgaag ccgcgaggct aagccaatcc cacaaatctg 900
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 960
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1020
cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt ggagccagcc gccgaaggtg 1080
ggacagatga ttaagtgaag tcataacaa 1109
Claims (7)
1.一株高产3-羟基丁酮的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)MEL09，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO M209173。
2.如权利要求1的MEL09属地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，其分离筛选条件：从国内食醋厂取得土样，称取1.0-2.0g土样于250mL三角瓶中，用10-50mL无菌水悬浮，60℃处理10min，冷却后进行梯度稀释，取0.2mL稀释液涂布于LB固体平板上，30-40℃培养24-36h，挑取单菌落，进行V.P.实验检测。挑选V.P.反应阳性的菌株进行发酵验证。
3.如权利要求1的MEL09属地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，其形态及生理生化特征为：棒杆状、在LB固体培养基上菌落圆形、边缘不齐、毛发状、菌苔干燥、不透明、蔓延、灰白色，产芽孢。MEL09的生理生化特征：
项目 结果 项目 结果
棒杆状 + 水解酪蛋白 +
芽胞 + 水解淀粉 +
V.P.反应 + 吲哚生成 +
D-葡萄糖产酸 + 水解明胶 +
L-阿拉伯糖产酸 + 柠檬酸盐 +
D-木糖产酸 + 丙酸盐 +
甘露醇产酸 + 苯丙氨酸脱氨酶 +
葡萄糖产气 - 酪氨酸水解 -
吲哚 + 触酶 +
硝酸盐还原 +
核甘酸序列分析：利用通用引物PCR扩增该菌的16S rDNA，得到上述芽胞杆菌MEL09的16S rRNA基因序列1109bp，Genebank登录号为FJ715927，应用BLAST程序与数据库中的已有细菌16S rDNA序列进行相似性比较分析，MEL09菌株的基因序列与地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DSM13相似性高达97％。结合生理生化分析及16S rDNA序列分析结果，将菌株MEL09鉴定为芽胞杆菌属地衣芽胞杆菌。
4.如权利要求1的MEL09属地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，其生产3-羟基丁酮的发酵培养基(g/L)：碳源50-150，有机氮源6-30，(NH4)2SO4 1-13，K2HPO40.1-5.0，MgSO40.1-5，NaCl 0.5-2，ZnCl2 0.05-0.50，FeCl30.01-0.5，MnSO40.005-0.10，补充蒸馏水至1L，调pH至6.5-7.4，115℃高压蒸汽下灭菌20min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的碳源选自葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，D-甘露糖，木糖，糖蜜的一种或两种；所述的有机氮源选自玉米浆，蛋白胨，酵母粉中的一种或两种。
6.如权利要求1的MEL09属地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，其发酵生产3-羟基丁酮的条件：250mL二角瓶装20-60mL的发酵培养基，接种量为1-5％(体积比)，培养温度30-40℃，摇床转速120-200r/min，发酵时间36-48h；或按发酵罐容积的40-80％投入所述的发酵培养基，以0.07-0.1Mpa灭菌30min，冷却至30-40℃，接种量为1-5％(体积比)，培养温度为30-40℃，通气量为1∶0.5-2(vvm)，发酵罐的搅拌转速为200-600r/min；发酵时间36-48h。
7.如权利要求1的MEL09属地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)作为生产3-羟基丁酮的用途。
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