CN113817650A - 一株产吡嗪高温放线菌、分离筛选及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有产吡嗪类组分特性的高温放线菌，其特征在于：该菌株保藏号为：CCTCCNOM20211167，名称为：甘蔗莱西氏菌FBKL4.012(LaceyellasacchariFBKL4.012)，该菌株的气生菌丝及分生孢子均呈白色，菌落形状则呈缺刻圆状。其在小麦/高粱固态培养基质上可代谢产生四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,5‑二甲基吡嗪、2,3‑二甲基吡嗪等风味组分，是一株具有良好产风味特性的菌种，展现出应用于白酒酿造、食品发酵等行业的巨大潜力。

Description

一株产吡嗪高温放线菌、分离筛选及应用

技术领域

本发明涉及一株高温放线菌菌株FBKL4.012，该菌株从酱香型高温大曲中分离得到，经多相分类学鉴定后确定为定菌株FBKL4.012为Laceyella属下的菌种，并命名为Laceyella sacchari FBKL4.012。

背景技术

吡嗪类物质是含有2个对称氮原子的一系列六元杂环化合物的总称，是热处理食品中最主要的香气组分之一，其中的一些吡嗪物质还具有一定的药用价值。经过高温蒸馏的中国传统白酒中，吡嗪类物质同样被大量检出，相比于其它香型的白酒，酱香型白酒中香气成分中吡嗪类成分最丰富，其含量是其它香型白酒检出量的十余倍，为主要的风味组分之一。酱香白酒中的吡嗪类成分主要由微生物代谢产生，而酱酒酿造环境中的微生物类群十分复杂，由于酿造过程多于高温环境下进行，因此具有嗜热特性的微生物类群尤其是细菌类群得以大量富集，从而成为发酵体系中吡嗪类物质主要产生来源。

由于芽孢杆菌良好的可培养特性，导致目前酱香大曲中嗜热细菌类群方面的研究多集中在芽孢杆菌类群上，多年的研究证实其在酱香大曲固态发酵过程中与吡嗪等酿造风味的产生密切相关。但除了芽孢杆菌外，酱香大曲中还有将近90％的嗜热细菌由于可培养方法的制约而未能得到有效的研究，因而这些细菌能否在吡嗪类物质的生成中发挥作用也就无从得知。目前，通过宏基因组分析技术，以高温放线菌类群为代表的多种未实现培养化的嗜热细菌也从酱香大曲中广泛检出，从丰度上分析，高温放线菌甚至在酱香白酒的一些发酵阶段成为体系中的优势细菌类群，考虑到芽孢杆菌在酿造过程中重要的产吡嗪类风味组分的代谢特性，这无疑暗示着高温放线菌很可能与芽孢杆菌类似，在酿造环境中是一类具有潜在产吡嗪类风味组分的微生物，因而针对酱香大曲中高温放线菌类群资源的发掘就显得很有价值。

高温放线菌类群最早于1899年发现，并做为一个独立的菌属被详细描述，从分类学上来看，高温放线菌类群是一类介于细菌与放线菌之间的特殊微生物类群，也是一类能够在高温环境下生长代谢的革兰氏阳性、好氧极端微生物类群，能在37～65℃的生长温度范围内生长代谢。大多数高温放线菌具有发育丰富的气生菌丝与基内菌丝，与放线菌具有较高的形态学相似性。在自然界中，高温放线菌类群分布广泛，尤其在陆生性热泉、堆肥、甘蔗渣、海底沉积物以及大曲等高温环境中分布密集。通过可培养分离方法的设计，研究者目前已经从高温堆肥、火山热泉、芝麻香型大曲等环境中成功分离得到高温放线菌菌株，为后续深入探究该类群的功能特性打下了良好的基础。而高温放线菌代谢所产生的各种耐高温、特征性酶类及一些活性物质同样具有很高的研究、应用价值，从而极大的拓展了学术界对于高温放线菌类群功能特性的认识。

但在酱香型白酒酿造研究领域，针对高温放线菌类群的研究很少且多数较为零散，并未形成系统性的研究，研究内容也仅限于菌株的分离、鉴定及简单的产酶特性研究，对高温放线菌在酿造过程中代谢产吡嗪类风味组分方面的研究十分缺乏。因此，对酱酒酿造环境中未培养高温放线菌菌种资源进行系统性发掘，明确高温放线菌固态发酵条件下产吡嗪类风味组分的功能特性，可以为今后酿造行业提供更多的发酵产香菌种资源，从而促进白酒行业的绿色化发展。

发明内容

本发明的目的在于解决酱香白酒酿造领域稀有发酵功能性菌种资源开发的问题，为酿造行业提供一株可于固态发酵条件下有效代谢产生四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等风味组分的高温放线菌菌株。

本发明的技术方案是：一株具有产吡嗪类组分特性的高温放线菌，该菌株保藏号为：CCTCC NO M20211167,名称为：甘蔗莱西氏菌FBKL4.012(LaceyellasacchariFBKL4.012)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期：2021年9月13日。

该菌株的气生菌丝及分生孢子均呈白色，菌落形状则呈缺刻圆状。

所述的菌株的气生菌丝发达，基内菌丝颜色相近且无可溶性色素产生，菌落外形褶皱十分明显且中间隆起。

所述的菌株FBKL4.012生长温度范围为37～60℃，生长pH范围为6.0～9.0，NaCl耐受浓度为0％(w/v)。

所述的菌株FBKL4.012最适生长温度范围为45～55℃，最适生长pH范围为pH 5.5～7.0，NaCl耐受浓度为0％(w/v)。

所述的菌在白酒酿造中的应用。

所述的菌在食品发酵中的应用。

本发明分离的菌株Laceyella sacchari FBKL4.012为革兰氏阳性菌，其在ISP2培养基上的进行培养时，菌落形状呈缺刻圆状，菌落外形上存在十分明显的隆起和褶皱，菌落质地干燥致密，不易挑起，气生菌丝呈乳白色且菌丝体较为发达，菌落总体直径在9mm～11mm范围内，无可溶性色素产生。菌株的微观形态学观察则于扫描电子显微镜下进行，主要特征为：FBKL4.012的菌丝体则由短棒状菌丝构成，大串孢子直接着生于菌丝体上，分生孢子密度大，孢子梗短。

菌株FBKL4.012在小麦/高粱固态培养基质上经过高温发酵可代谢产生四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等风味组分；菌株产生的所有吡嗪类物质的相对含量可占到总挥发性物质的63.875％，研究确定了吡嗪类物质为菌株FBKL4.012固态发酵产生一类主要风味物质，这也表明该菌株在食品发酵、白酒酿造方面具有良好的研究、应用潜力。

本发明的有益效果：通过该发明中阐述的菌株筛选、纯化方法，有效实现了该菌株在实验室条件下快速培养，从而为今后酱香白酒酿造环境中未培养微生物资源的开发提供重要的研究参考。

从酱香大曲样品中分离筛选到菌株FBKL4.012，经多相分类学鉴定，确定其归属于芽胞杆菌目(Bacillale)、高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)，莱西氏属(Laceyella)下的菌种，其在小麦/高粱固态培养基质上可代谢产生四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等风味组分，是一株具有良好产风味特性的菌种，展现出应用于白酒酿造、食品发酵等行业的巨大潜力。

附图说明

图1为菌落形态特征图；

图2为菌株的电子显微镜图片；

图3为菌株系统发育分析图。

具体实施方式

1.实验方案：

1.1实验材料

菌株筛选用的酱香大曲由贵州某酿酒厂提供，该公司的酒厂位于贵州赤水河畔的茅台镇酱酒核心产区，所用酱香大曲是取粉碎混匀后待投料的陈曲粉(高温制曲后，经过6个月的存储)。

菌株分离筛选培养基采用改良高氏二号培养基：葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、胰蛋白胨0.3g、氯化钠0.5g、复合维生素2.75mg(包括VB₁、VB₂、VB₃、VB₅、VB₆各0.5mg，VB₇0.25 mg)、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4，121℃灭菌20min。

筛选菌株的纯化培养、菌株斜面保藏使用ISP2培养基：酵母膏4g、麦芽汁10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，pH调至7.0～7.2，121℃灭菌20min。

菌株的扩大培养采用液体扩培培养基：葡萄糖10g、小麦浸出物20mL、氯化钠5g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾2g、七水硫酸镁0.5g、蛋白胨4g、蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2，115℃灭菌30min。

筛选菌株的纯种固态发酵产香实验在高粱小麦固态发酵产香培养基上进行，该培养基为天然培养基，具体的制作过程如下：按照高粱与小麦质量比1∶1，小麦全粉碎，高粱的部分又以高粱整粒、细粉质量比为3∶1的原则混合均匀；每1000mL烧杯装入160g原料，加入60％的沸水润粮5～6h，然后加入预先活化好的糖化酶搅拌均匀，使得其酶活力在200U/g左右，于60℃水浴条件下糖化3～4h，8～12层纱布密封处理，115℃灭菌30min。

1.2酱香大曲样品的预处理

酱香大曲预处理方法为：先进行干热处理，使用灭菌三角瓶称取10g大曲样品，封口置于烘箱里85℃加热1h，杀灭大曲样品中对高温放线菌筛选有较大干扰的杂菌，取出后于无菌环境下加入1g碳酸钙粉末，利用Ca²⁺离子促进芽孢萌发的特性达到针对性富集目标菌株芽孢的效果，而后向样品中添加10％的无菌水，混合均匀，在空气湿度饱和的条件下置于28～30℃培养箱中放置5～7d，观察样品中是否有明显的杂菌长出，从而判断干热处理对干扰性杂菌的杀灭效果，若样品无杂菌长出则取1g处理好的曲样放入带有玻璃珠的三角烧瓶中，混合2.5g/L质量浓度的羧甲基纤维素缓冲液或生理盐水10mL，于45～50℃恒温摇床中以180～200rpm的转速快速振荡30min后完成大曲样品的预处理。

1.3菌株FBKL4.012的分离、纯化及保藏

改良高氏二号分离筛选培养基灭菌处理后，在其冷却凝固前加入经0.22μm水相无菌滤膜过滤后的新生霉素(使其在培养基中的浓度为30mg/L)和制霉菌素(使其在培养基中的浓度为20mg/L)两种抑制剂；随后将处理好的大曲预处理样品的菌悬液视为10^-1浓度，分别吸取1mL菌悬液以10倍为稀释单位进行稀释，逐次稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍，并从不同稀释倍数的菌悬液中各取0.2mL涂布接种于分离筛选培养基上，其中10^-2、10^-3倍各做3个平行，其余浓度梯度做2个平行，于45℃恒温培养箱中倒置培养进行菌株的分离筛选。

待筛选平板上长出单菌落后，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》中对高温放线菌特征的描述，在同样添加有新生霉素(30mg/L)和制霉菌素(20mg/L)两种抑制剂的ISP2培养基平板上进行3区划线纯化，至少纯化2次，并通过形态特征观察去除重复菌株，最终挑取平板上的单菌落，得到纯化单菌株。

所有纯化菌株的斜面保藏是将筛选菌株接种于ISP2斜面培养基上，于4℃条件下进行菌种保藏，用于短期类所进行的相关研究工作；而菌株的长期保藏采用甘油管保藏的方式，将经液体扩培培养基扩培48h后的菌株细胞收集于无菌30％(W/V)甘油溶液中，于-80℃冷冻长期保藏。

1.4菌株形态学观察鉴定

将分离出的菌株分别接种于ISP2培养基上，于45℃恒温培养箱中培养5d后分别从菌落形状、基内菌丝、气生菌丝颜色及可溶性色素产生情况等方面观察并记录结果，同时对菌落的大小进行测量。

菌株的微观形态学观察则于S-3400N型扫描电子显微镜下进行，通过观察、描述菌丝体及孢子结构特点，并结合《伯杰氏细菌鉴定手册》完成菌株的微观形态学鉴定。

1.5菌株生长温度范围、pH范围及盐(NaCl)浓度耐受范围的确定

菌株FBKL4.012的生长温度范围、pH值范围及生长盐(NaCl)浓度耐受范围实验均在ISP2培养基上完成；其中，菌株生长温度范围的测定分别在4、10、16、28、30、37、45、50、55、60及65℃下进行，将经液体扩培48h的新鲜菌液分别吸取0.5mL涂布与ISP2培养基上培养5d，观察记录菌株在平板上的生长状况。菌株生长pH范围的测定在pH值4.0和10.0之间(间隔1.0pH单位)进行，45℃条件下培养，观察和记录5d的生长情况。菌株生长盐(NaCl)浓度耐受范围则在0～5％(w/v)(间隔为1％)之间进行测试，45℃条件下培养，观察和记录7d的生长情况。

1.6菌株生理生化特征描述

菌株的唯一碳(氮)源利用实验、明胶液化、黑色素产生等生理生化鉴定实验均依照细菌或放线菌的鉴定手册进行，其中唯一碳源利用所选用的基础培养基为戈特利布(Gottlieb)的基础矿物盐培养基，而唯一氮源利用实验则是在基本液体培养基中进行，该培养基的具体配方为：1g葡萄糖，0.05g MgSO₄·7H₂O，0.05g NaCl，0.001g FeSO₄·7H₂O，0.01g K₂HPO₄，1000mL水，调pH 7.2，121℃灭菌20min。而其余13株用于新种鉴定的参考模式菌种的生理生化特性测定均按照上述的研究方法来进行，并对各菌株的生理生化结果详细记录。

1.7菌株16S rDNA基因系统发育分析及分子杂交

通过细菌基因组提取试剂盒提取菌株FBKL4.012基因组DNA；同时分别采用细菌通用的16S rDNA上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和下游引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’对分离菌株的特征16S rDNA片段进行PCR扩增。具体的反应体系如下：

而PCR的扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最终72℃延伸10min。

在获得菌株FBKL4.012的16S rDNA扩增序列后，送至上海派森诺测序公司完成测序工作，得到菌株16S rDNA基因序列信息。利用NCBI的BLAST工具以及韩国的EzTaxon细菌基因线上比对服务(http://www.eztaxon.org/)进行序列BLAST，GenBank/EMBL/DDBJ及EzBioCloud数据库中选取序列比对结果相似度较高、高温放线菌科水平下所有已发表模式菌株的16S rDNA基因序列为标准参比序列。采用MEGA(version X)软件进行系统发育分析，选用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，并以基于1000次采样的bootstrap分析对树的拓扑结构进行评估，从而确定筛选菌株FBKL4.012的分类学地位。

1.8菌株FBKL4.012保藏信息

该菌株保藏号为：CCTCC NO M20211167,名称为：甘蔗莱西氏菌FBKL4.012(Laceyella sacchariFBKL4.012)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期：2021年9月13日。

1.9菌株固态发酵条件下风味产物的分析

将菌株FBKL4.012接种到液体扩培培养基中，于45℃恒温振荡箱中以150rpm培养36h，完成菌株接种液的制备，无菌条件下以6％的接种量向固态发酵培养基中接入菌株种子液，混合均匀并采用8层纱布封口，置于45℃恒温培养箱中发酵5d后，取样品10g左右，置于固相微萃取采样瓶中，插入手动萃取进样器，60℃下顶空固相微萃取30min后取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250℃)中，热解吸3min后进样，每个样品做3个平行，同时进行空白对照实验。

菌株风味组分的GC-MS分析的条件具体如下：气相色谱的条件为：Agilent J&WDB-WAX(30m×0.25mm，0.25μm)强极性毛细管色谱柱；升温程序：柱温35℃(保留5min)，以4℃/min升温至135℃，保持2min；再以8℃/min升温至180℃，保持5min；汽化室温度250℃，载气为高纯He(99.999％)，柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min，不分流进样，溶剂延迟时间2min。

质谱条件为：采用电子电离源，离子源温度为230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，发射电流34.6μA，倍增器电压1350V，接口温度280℃，分子质量范围为20～450amu。GC-MS测定得到的总离子流图及相关数据利用质谱自带的数据检索系统进行分析，将未知物的质谱图谱与Nist 2011与Wiley 275标准质谱图进行比对，初步确定挥发性化学成分，并采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量，并进一步按物质类别对主要挥发性物质的平均相对含量作图，反映菌株固态发酵条件下代谢风味产物的总体情况。

2.实验结果：

2.1菌株FBKL4.012形态特征描述

由菌落形态特征来看，菌株FBKL4.012的气生菌丝及分生孢子均呈白色，气生菌丝较为发达，基内菌丝颜色相近且无可溶性色素产生，菌落形状则呈缺刻圆状，菌落外形褶皱十分明显且中间隆起，菌种总体质地干燥而致密(附图1)。

菌株的微观形态特征描述在扫描电子显微镜下完成(附图2)，结果表明菌株FBKL4.012菌丝体由短棒状菌丝构成，大串孢子直接着生于菌丝体上，分生孢子密度很大，孢子梗较短。

2.2菌株生长温度范围、pH范围及盐(NaCl)浓度耐受范围的确定

菌株FBKL4.012生长温度范围为37～60℃(最适生长温度范围为45～55℃)，生长pH范围为6.0～9.0(最适生长pH范围为pH 5.5～7.0)，NaCl耐受浓度为0％(w/v)。

2.3菌株生理生化及生物化学特征描述

菌株FBKL4.012对明胶液化、牛奶凝固、牛奶胨化、硝酸盐还原、淀粉降解、纤维素降解等生理生化实验呈阳性反应，而对黑色素生成，硫化氢产生等生理生化实验成阴性反应。

2.4菌株系统发育分析及分子杂交实验

基于16S rDNA基因序列相似性分析结果表明，菌株FBKL4.012与莱西氏属(Laceyella sp.)内典型菌株呈现出高度相似性，其中相似性最高的有效种为Laceyellasacchari，菌株FBKL4.012与Laceyella sacchari典型菌株(NCBI编号为EU430566)聚类在一个系统发育分支上，进化距离差异很小(附图3)；再进一步结合前述的形态学、生理生化分类学鉴定结果，初步确定菌株FBKL4012在分类学地位上属于高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)、莱西氏属(Laceyella sp.)，并命名为Laceyella sacchariFBKL4.012

2.5菌株固态发酵条件下风味产物的分析

从菌株FBKL4.012小麦/高粱固态发酵物中共检出挥发性成分近40余种，从大的类别上划分主要有醇、醛、酮、芳香族、吡嗪、醚、烯及酯等七大类物质；该菌株FBKL4.012在固态培养基质上主要代谢产生四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等风味组分，其所有吡嗪类物质的相对含量可占到总挥发性物质的63.875％，其中又以四甲基吡嗪组分的相对含量最高，约占到总挥发性物质的37.975％。

酱香白酒风味组分中吡嗪类物质普遍存在，这说明该物质应为酱香白酒的风味构成之一。菌株FBKL4.012固态发酵条件下风味组分的分析结果与以往茅台大曲中分离到的枯草杆菌MTDB-03、地衣杆菌FBKL1.0199和FBKL1.0201的GC-MS产香分析结果十分类似，吡嗪类组分的相对含量均超过了各菌株总体风味成分的50％。在以前的研究中，并未发现高温放线菌具有代谢产四甲基吡嗪的能力，而这一测定结果则表明酱香大曲中以菌株FBKL4.012为代表的一些高温放线菌在固态发酵条件下也具有代谢产生吡嗪类物质尤其是四甲基吡嗪的能力，这与大曲中芽孢杆菌类群的发酵功能特性十分相似，同时也暗示着菌株FBKL4.012在实际的酿造过程中具有潜在产吡嗪类风味物质的功能特性，为今后以菌株FBKL4.012为载体大规模工业化生产吡嗪类组分打下研究基础，同时也为酿造行业有效提供发酵产风味菌种资源。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一株具有产吡嗪类组分特性的高温放线菌，其特征在于：该菌株保藏号为：CCTCC NOM20211167,名称为：甘蔗莱西氏菌FBKL4.012(Laceyella sacchari FBKL4.012)，该菌株的气生菌丝及分生孢子均呈白色，菌落形状则呈缺刻圆状。

2.一株具有产吡嗪类组分特性的高温放线菌，其特征在于：所述的菌株的气生菌丝发达，基内菌丝颜色相近且无可溶性色素产生，菌落外形褶皱十分明显且中间隆起。

3.根据权利要求1所述的一株具有产吡嗪类组分特性的高温放线菌，其特征在于：菌株FBKL4.012生长温度范围为37～60℃，生长pH范围为6.0～9.0，NaCl耐受浓度为0％(w/v)。

4.根据权利要求3所述的一株具有产吡嗪类组分特性的高温放线菌，其特征在于：菌株FBKL4.012最适生长温度范围为45～55℃，最适生长pH范围为pH 5.5～7.0，NaCl耐受浓度为0％(w/v)。

5.如权利要求1-4之一所述的菌在白酒酿造中的应用。

6.如权利要求1-4之一所述的菌在食品发酵中的应用。

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