CN115044479B

CN115044479B - 一种具有高乳酸耐受性的白地霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN115044479B
Application number: CN202210385230.9A
Authority: CN
Inventors: 王新叶; 赵亮; 刘宇恒; 刘玉婷; 罗贞标; 江璐
Original assignee: Moutai University
Current assignee: Moutai University
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2042-04-13
Also published as: CN115044479A

Abstract

本发明公开了一种具有高乳酸耐受性的白地霉菌株及其应用，以乳酸为唯一碳源，从酱香型酒醅中筛选得到一株具有高乳酸耐受性的白地霉菌株，该菌株在PDA平板上生长，菌落大而致密，菌落表面微皱致密，呈辐射毛绒状，边缘不整齐，菌丝为白色，孢子堆呈灰白色，在显微镜下观察，菌丝体为无色，菌丝发达，多分枝且不对称，菌丝均为棒状，圆柱形，无运动性；菌丝内有横膈膜，有节孢子。该菌株能够在酱香型白酒发酵后期，作为发酵菌剂，利用酒醅中的乳酸发酵产生乙酸，达到增乙降乳的目的。属于微生物技术领域。

Description

一种具有高乳酸耐受性的白地霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及酱香型酒醅中一株具有高乳酸耐受性，以乳酸为碳源代谢产生乙酸、丙二醇的白地霉JP8。

背景技术

乳酸是白酒酿造过程中微生物代谢的产物之一，是酒醅中的主要有机酸[1]。乳酸是白酒酒体酸香维度的重要贡献物质，它直接赋予白酒酸香的风味特征，同时降低乙醇的感官刺激感，与酒中其他风味物质共同作用形成白酒特有的风味品质。与其他风味特征的白酒相比，酱香型白酒中作为重要的风味化合物乳酸及乳酸乙酯的含量均较高。当乳酸含量适当时，会使酒体有醇和浓厚感，可赋予酒体良好的风味；但是，若乳酸含量过高，会使酒体带酸涩味，并影响到酒体的回甜感。生产中降低乳酸的方法有添加辅酶(食品级富马酸)、控制有优化生产工艺、在发酵过程中添加乳酸降解菌。

白酒发酵过程中起主要作用的微生物为：霉菌、细菌、酵母菌、放线菌四大类，霉菌具有丰富的酶活特性，霉菌所产生的多种水解酶按照催化功效可以分为酯化酶、糖化酶、液化酶、蛋白酶、纤维素酶、单宁酶、果胶酶、淀粉酶、过氧化氢酶等，在酒醅发酵前期霉菌的糖化作用方面起着决定性作用，为其他类型的微生物提供用以发酵的能源；在酒醅发酵的中后期，霉菌的酯化作用能够将酵母、细菌等产生的醇、酸等前体物质合成酯类物质，在改善白酒风味和口感方面具有重要的作用。一些白地霉菌株在酸性条件下能够有效的降低一些高级醇类，特别是正己醇的含量，有较好的耐酸、耐酒精能力，在酒类品质改良及安全性提高方面显示出很大的应用潜力。在发酵过程中，霉菌会生成一定量的酯类、醛类、杂环类物质，这些物质为白酒风格的形成提供物质基础。韩莹等从茅台大曲中分离筛选出1株毛霉，GC-MS分析其发酵主要代谢产物为亚油酸乙酯和油酸乙酯，这两种成分是茅台酒空杯留香的主要成分。

发明内容

本发明的目的在于：提供一株具有高乳酸耐受性，以乳酸为碳源代谢产生乙酸、丙二醇的白地霉JP8。

本发明是这样实现的：提供一种具有高乳酸耐受性的白地霉菌株，经18S rDNA序列比对，该菌株与Galactomyces.geotrichum LMA-75的18S rDNA序列相似性为99.52％，根据系统分类学归属，将该菌株命名为Galactomyces geotrichum JP8，菌株18S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022209，保藏日期为：2022年03月07日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，该菌株18S rDNA的GenBank 登录号：OM967350。

该菌株在PDA平板上生长，菌落大而致密，菌落表面微皱致密，呈辐射毛绒状，边缘不整齐，菌丝为白色，孢子堆呈灰白色，在显微镜下观察，菌丝体为无色，菌丝发达，多分枝且不对称，菌丝均为棒状，圆柱形，无运动性；菌丝内有横膈膜，有节孢子。

该菌株在30℃下生长良好，随着温度升高，菌株的生长逐渐受到抑制，温度高于40℃，菌株的生长停止，菌株在pH＝5的培养基上生长良好，随着培养基的pH逐渐降低，菌株在培养基上的生长逐渐受到抑制；在pH为1的培养基上，菌株仍表现出了较好的生长状况。

菌株表现出了良好的耐酸性能，随着乳酸浓度的升高，菌株的生长逐渐受到抑制，当乳酸的体积分数达到4％时，菌株的生长完全受到抑制；菌株对乳酸的耐受能力最高达到3％，随着乙醇浓度提高，菌株的生长逐渐减弱，当乙醇的体积分数达到2％以上，菌株生长完全受到抑制；菌株对乙醇的耐受能力最高达到 1.5％。

该白地霉菌株以乳酸为唯一碳源进行液体发酵，其代谢产物包括己烷、乙酸、乙烯、1,2-丙二醇、丙酰胺等，其中，1,2-丙二醇的产量最高，该菌株对乳酸和乙醇有一定的耐受性，可在酱香型白酒发酵后期，作为发酵菌剂，利用酒醅中的乳酸发酵产生乙酸，实现增乙降乳。

与现有技术相比，本发明所述白地霉菌株对乳酸和乙醇有一定的耐受性，可在酱香型白酒发酵后期，作为发酵菌剂，利用酒醅中的乳酸发酵产生乙酸，达到增乙降乳的目的，同时，丙二醇是重要的化工原料，不仅是良好的溶剂、抗冻剂、保护剂，而且还可参与多种化学合成反应，可以作为生产具有优良性质的聚酯、聚醚和聚氨酯的单体，是具有广阔应用前景的化工原料之一，采用微生物法生产丙二醇的关键在于菌株，本发明提供的白地霉菌株能够以乳酸为初始底物，发酵产生丙二醇，扩大了丙二醇生产菌株的范围，具有很好的应用价值。

附图说明

图1为霉菌JP8的菌落形态(1A)和菌丝形态(1B)；

图2为霉菌JP8基于18S rDNA序列的系统发育树；

图3为白地霉JP8发酵液GC-MS色谱图。

具体实施方式

为使本发明阐述的更为清楚明了，下面结合附图对本发明做进一步详细说明，但不作为对本发明的任何限制。

实施例

1、酱香型酒醅中耐乳酸霉菌的的筛选

称取10g酱香型酒醅样品加入到90mL无菌蒸馏水中，逐级稀释到10^-1、 10^-2和10^-3三个梯度，吸取100uL稀释液，涂布在改良Lu-Ye固体培养基(乳酸1g/L；(NH₄)₂SO₄2g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 14.3g/L；KH₂PO₄3g/L；MnSO₄·H₂O 0.28mg/L；FeSO₄·7H₂O 0.3mg/L；MgSO₄·7H₂O 0.06mg/L；CaCl₂1mg/L；CuSO₄0.05mg/L；H₃BO₃0.05mg/L；琼脂18g/L)上；将培养皿倒置于培养箱中培养， 30℃，培养3天。挑取培养皿上的单菌落，在改良Lu-Ye培养基上，用三划线法进行纯化，连续纯化三次后，获得纯种菌株。

2、霉菌的形态学观察

将筛选得到的霉菌菌株JP8点接于PDA培养基上，30℃培养2天，观察菌落形态。用无菌接种环蘸取霉菌的菌丝，用次甲基蓝染色后，置于显微镜下观察，显微镜放大倍数为100倍(目镜10倍，物镜10倍)。

结果表明：该菌株在PDA平板上生长，菌落大而致密，菌落表面微皱致密，呈辐射毛绒状，边缘不整齐，菌丝为白色，孢子堆呈灰白色(附图1A)。在显微镜下观察，菌丝体为无色，菌丝发达，多分枝且不对称，菌丝均为棒状，圆柱形，无运动性；菌丝内有横膈膜，有节孢子(附图1B)。

3、霉菌的分子生物学鉴定

用月硅酸钠法提取霉菌JP8的基因组DNA，实施方法如下：将JP8接种在 PDA培养基上，培养3～5d，用无菌的接种环刮JP8菌苔表面形成的孢子；加入800μL月桂酸钠提取液，上下颠倒混匀；在离心管中加入等体积的DNA提取液，缓慢摇匀后，12000rpm、4℃离心20min；吸取上清液于新灭菌的2mL 离心管中，重复上述步骤2次；向离心管上清液中1/10体积3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)，再加入等体积的异丙醇溶液，置于-20℃冰箱过液；12000rpm、4℃离心15min，小心倒掉离心管中的异丙醇；向离心管中加入200μL 70％乙醇，轻轻震荡洗涤，12000rpm、4℃离心5min，弃上清，重复此步骤1次；打开离心管盖，待离心管中的乙醇挥发干净后(管中无明显乙醇味)，加入50μL ddH₂O，溶解管壁上的DNA，置于-20℃冰箱保存，备用。

18S rDNA的扩增引物为：NS1-GTAGTCATATGCTTGTCTC， NS8-TCCGCAGGTTCACCTACGGA。扩增体系为：2×Taq PCRMasterMix 15μL，ddH2O 12μL，NS10.5μL，NS80.5μL，基因组DNA2μL。扩增程序为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，2min；终延伸72℃，7min；循环数35。将PCR扩增产物序列提交至上海生物工程股份有限公司进行测序，序列信息提交至NCBI的GenBank数据库中进行BLAST 比对。下载与菌株JP8的18S rDNA基因序列同源性较高的已知菌株的18S rDNA序列，利用MEGA7.0.26软件中的邻近(Neighbor-Joining，NJ)法构建系统发育树。

结果表明：获得的JP8的18S rDNA序列(SEQ ID NO.1)见后。

该菌株的18S rDNA序列已经提交到GenBank数据库(GenBank登录号： OM967350)。

根据系统发育分析(见附图2)，JP8与Galactomyces geotrichum LMA-75 和Geotrichum candidum IFO 4599距离最近，JP8与这两株菌的序列相似性分别为99.52％和99.40％，JP8与G.geotrichum LMA-75的序列相似性最高。

鉴于上述菌株JP8的菌落形态特征、菌丝形态特征以及18S rDNA的系统发育结果，将菌株JP8鉴定为Galactomyces geotrichum JP8。该菌株于2022年 03月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M 2022209。

4、白地霉JP8的环境耐受性分析

具体步骤为：

(1)温度耐受性

将JP8接种到PDA培养基上，设置培养箱温度分别为30℃、35℃、40℃、 45℃、50℃，3天后，观察菌株生长情况。

(2)pH耐受性

以PDA培养基为基础培养基，用1mol/L盐酸调节培养基的pH为1、3、 5，将JP8接种到pH梯度培养基上，置于30℃培养箱中，3天后观察菌株生长情况。

(3)乙醇耐受性

以PDA培养基为基础培养基，添加乙醇体积百分比分别为0.5％、1.0％、 1.5％、2.0％、2.5％，将JP8接种到乙醇梯度培养基上，置于30℃培养箱中，3 天后观察菌株生长情况。

(4)乳酸耐受性

以PDA培养基为基础培养基，添加乳酸体积百分比分别为1％、2％、3％、 4％，将JP8接种到乳酸梯度培养基上，置于30℃培养箱中，3天后观察菌株生长情况。

结果表明：地霉菌JP8在30℃下生长良好，随着温度升高，白地霉菌JP8 的生长逐渐受到抑制，温度高于40℃，白地霉菌JP8的生长停止。白地霉菌JP8 在pH＝5的培养基上生长良好，随着培养基的pH逐渐降低，白地霉菌JP8在培养基上的生长逐渐受到抑制；在pH为1的培养基上，白地霉菌JP8仍表现出了较好的生长状况，白地霉菌JP8表现出了良好的耐酸性能。随着乳酸浓度的升高，白地霉菌JP8的生长逐渐受到抑制，当乳酸的体积分数达到4％时，白地霉菌JP8 的生长完全受到抑制；白地霉菌JP8对乳酸的耐受能力最高达到3％。随着乙醇浓度提高，白地霉菌JP8的生长逐渐减弱，当乙醇的体积分数达到2％以上，白地霉菌JP8生长完全受到抑制；白地霉菌JP8对乙醇的耐受能力最高达到1.5％。

5、白地霉JP8代谢产物解析

具体步骤为：

发酵培养基为Lu-Ye(乳酸1g/L；(NH₄)₂SO₄2g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 14.3g/L；KH₂PO₄3g/L；MnSO₄·H₂O 0.28mg/L；FeSO₄·7H₂O 0.3mg/L；MgSO₄·7H₂O 0.06mg/L；CaCl₂1mg/L；CuSO₄0.05mg/L；H₃BO₃0.05mg/L)，接种JP8，液体培养72h，离心，弃去菌体。将上清液用0.2μm微孔滤膜过滤后，用气-质联用色谱检测发酵产物。色谱质谱检测条件为色谱柱：安捷伦DB-5，30m*0.32 mm，0.25μm；载气：氦气；流速：1.8mL/min，分流比＝5:1；升温程序：40℃，保持4min；10℃/min升至100℃，保持0min；25℃/min升至200℃，保持0min；前进样口温度：150℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；进样量：1μL； Mass Range：20-150m/z；离子源：EI；扫描方式：SIM/SCA。

结果表明：如附图3所示，以乳酸为唯一碳源进行液体发酵，JP8的代谢产物有己烷、乙酸、乙烯、1,2-丙二醇、丙酰胺等。其中，1,2-丙二醇的产量最高，如表1所示。

表1白地霉JP8发酵产物解析

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 茅台学院

<120> 一种具有高乳酸耐受性的白地霉菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1666

<212> DNA

<213> 白地霉(Geotrichum candidum)

<400> 1

acttttactt cctctaaatg accaagtttg actagcttct cgttcaatca gaaaagttgc 60

cctctccaat taatcaatcc ggaagcctca ctaagccatt caatcggtag tagcgacggg 120

cggtgtgtac aaagggcagg gacgtaatca acgcaagctg atgacttgcg cttactagga 180

attcctcgtt gaagagcaat aattgcaatg ctctatcccc agcacgacgg agtttcacaa 240

gattacccat acctctcggc acaggttaga ctcgctggct ccgtcagtgt agcgcgcgtg 300

cggcccagaa cgtctaaggg catcacagac ctgttattgc ctcaaacttc catcgacttg 360

aaaatcgata gtccctctaa gaagctgtca aaacaataat ctattgttac agctatttag 420

caggttaagg tctcgttcgt tatcgcaatt aagcagacaa atcactccac caactaagaa 480

cggccatgca ccaccaccca caaaatcatg aaagagctct caatctgtca atccttattg 540

tgtctggacc tggtgagttt ccccgtgttg agtcaaatta agccgcaggc tccactcctg 600

gtggtgccct tccgtcaatt cctttaagtt tcagccttgc aaccatactc cccccagaac 660

ccaaaaactt tgatttctcg taaggtgccg gagaggttat tataacgccc tccgatccct 720

agtcggcata gtttacggtt aagactacga cggtatctga tcgtcttcga tcccctaact 780

ttcgttcttg attaatgaaa acgtccttgg caaatgcttt cgcagtagtt agtcttcagt 840

aaatccaaga atttcacctc tgacaactga atactgatgc ccccgaccgt ccctattaat 900

cattacgacg gtcctagaaa ccaacaaaat agaaccaata cgtcttattc tattattcca 960

tgctaatata ttggagcaaa ggcctgcttt gaacactcta attttttcaa agtaaatgtt 1020

tggtttacac ttcttaaata aatagaaagt ttacaccaaa gaaagatgtt tcagggtagt 1080

actctaaaag agaccgcccc tacacaccca agtttcaact acgagctttt taactgcaac 1140

aactttaata tatactatca gagctggaat taccgcggct gctggcacca gacttgccct 1200

ctaattgttc ctcgttaagg tatttaaatt gttctcattc caattacgag acctaatagg 1260

ccccgtatcg ttatttattg tcactacctc cctgtgtcag gattgggtaa tttgcgcgcc 1320

tgctgccttc cttggatgtg gtagccgttt ctcaggctcc ctctccggaa tcgaaccctg 1380

attccccgtt acccgttaaa accatggtag gcctctatcc taccatcgaa agttgatagg 1440

gcagaaattt gaatgaacca tcgccagcac aaggccatgc gattcgacaa gttattatga 1500

ttcaccatag agcccgaagg cattggtttt ttatctaata aataccagcc gggaacccgg 1560

ccgttttagc atgtattagc tctagaatta ccacggttat ccaagtagta atgtaatatc 1620

aaataaacga taactgattt aatgagccat tcgcagtttc actgta 1666

Claims

1.一种具有高乳酸耐受性的白地霉菌株，其特征在于：经18S rDNA序列比对，该菌株与G. geotrichum LMA-75的18S rDNA序列相似性为99.52%，根据系统分类学归属，将该菌株命名为G. geotrichum JP8，菌株18S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，保藏编号为：CCTCC M2022209，保藏日期为：2022年3月11日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述白地霉菌株的应用，其特征在于：该白地霉菌株用在酱香型白酒发酵后期，作为发酵菌剂，利用酒醅中的乳酸发酵产生乙酸，实现增乙降乳。