CN110066757B - 一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌及其应用 - Google Patents

一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。本发明的假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y‑5，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018480。该菌株能分泌阿魏酸酯酶，在麸皮诱导下，其发酵粗酶液的阿魏酸酯酶酶活为116U/L，且以麦麸为底物发酵生产阿魏酸，产量可达59.51±0.6mg/L。本发明的假单胞菌在不影响黄酒的酒精度、pH值和还原糖含量的同时，能够增加黄酒中阿魏酸的含量，接种了本发明的假单胞菌的强化麦曲发酵后黄酒中阿魏酸含量约为传统麦曲的2.6倍。

Description

一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
阿魏酸(Ferulic Acid,FA)的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，它具有能够清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制肿瘤、抗衰老、抑制低密度脂蛋白的氧化和抗血小板聚集的生理功能，被广泛应用于保健品、食品添加剂、化妆品和医药等领域；同时，阿魏酸既是黄酒中的风味物质，也是黄酒保健功能的重要物质基础。
阿魏酸酯酶(EC.3.1.1.73，ferulic acid esterase，FAE)属于胞外酶，该酶能够切断阿魏酸与多糖或木聚糖之间的酯键，是把阿魏酸从束缚态释放成游离态的关键酶。细菌、真菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶。但到目前为止，真菌仍然是阿魏酸酯酶的主要来源，只有少数来自于细菌，如枯草芽孢杆菌、乳酸菌等，但是由于天然真菌生长、酶产量以及真菌对生长条件的要求等都严重的限制了酶法生产阿魏酸的工业化进程，因而筛选新的阿魏酸酯酶产生菌株仍有很大的必要性。
随着人们生活水平的提高，消费者对黄酒的需求逐渐由“嗜好性”转向“健康性”，目前市面上黄酒中阿魏酸的含量约为3.5mg/L，如何提高黄酒中阿魏酸的含量一直是研究热点之一。黄酒中阿魏酸主要来源于麦曲，麦曲是一个多菌种混合相对复杂的固态体系，微生物复杂多样，其中的微生物具有分泌阿魏酸酯酶的能力，阿魏酸酯酶可以将麦曲中处于交联状态的阿魏酸释放出来，是黄酒中阿魏酸产生的重要途径。但是，目前麦曲和黄酒的发酵过程中微生物仅能释放麦曲中少量的束缚型阿魏酸，无法实现提高黄酒中阿魏酸含量的目标，这就需要通过微生物强化技术来提高黄酒中阿魏酸含量。有研究采用一种可产阿魏酸酯酶的真菌——枝状枝孢霉来提高黄酒中阿魏酸的含量，但是真菌培养易形成菌丝或菌球，给接种操作带来很大的困难。且由于黄酒发酵是多菌种参与的复杂过程，麦曲中微生物的组成和数量具有很大的复杂性，不同菌种在黄酒发酵过程中所发挥的具体作用尚不十分明确，而额外添加微生物菌种到麦曲中，有可能导致麦曲原有的微生物菌群结构发生迁移，使得发酵最终所得到的黄酒品质发生改变。因此，从麦曲中筛选高酶活的、野生型的，且能够添加到黄酒发酵过程中增加黄酒中阿魏酸的含量的同时不影响黄酒的其他品质的阿魏酸酯酶产生菌，对于“健康性”黄酒的开发具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌(Pseudomonasoryzihabitans)，所述假单胞菌已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018480，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明的第二个目的是提供一种生产阿魏酸酯酶的方法，所述方法是应用所述的假单胞菌进行发酵生产。
本发明的第三个目的是提供一种生产阿魏酸的方法，所述方法是以阿魏酸乙酯为底物，利用所述的假单胞菌进行发酵生产。
本发明的第四个目的是提供一种从植物中得到游离型阿魏酸的方法，所述方法是应用所述的假单胞菌发酵产生的阿魏酸酯酶使植物中束缚型阿魏酸释放出来。
本发明的第五个目的是提供一种提高发酵食品中阿魏酸含量的方法，是将所述假单胞菌接种到发酵食品的生产过程中，通过假单胞菌将交联状态的阿魏酸酯类转化为阿魏酸，进而提高发酵食品中的阿魏酸含量。
在一种实施方式中，所述发酵食品为黄酒。
在一种实施方式中，所述方法是将所述的假单胞菌种子液接种到麦曲中，得到强化麦曲，再利用强化麦曲进行黄酒酿造。
在一种实施方式中，所述假单胞菌种子液为将假单胞菌接种到培养基中，于28±2℃培养24～32h后得到。
本发明的第六个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述的假单胞菌。
本发明还提供所述的假单胞菌或所述的微生物菌剂在食品技术领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5具有产阿魏酸酯酶的能力，可从麦麸中释放出束缚型阿魏酸，在麸皮诱导下，本发明的假单胞菌发酵粗酶液的阿魏酸酯酶酶活为116U/L；
(2)本发明的假单胞菌发酵后发酵培养基中阿魏酸的含量高达59.51±0.6mg/L，在发酵行业具有潜在的应用价值；
(3)本发明的假单胞菌发酵麸皮后，测得阿魏酸的量为5.12mg/g麦麸，释放的束缚型阿魏酸的释放率为77.69％；
(4)本发明的假单胞菌在不影响黄酒的酒精度、pH值和还原糖含量的同时，能够增加黄酒中阿魏酸的含量，接种了本发明的假单胞菌的强化麦曲发酵后黄酒中阿魏酸含量约为传统麦曲的2.6倍。
生物材料保藏
本发明所提供的假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5，分类学命名为Pseudomonas oryzihabitans Y-5假单胞菌Y-5，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018480，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1：Pseudomonas oryzihabitansY-5水解阿魏酸乙酯产生透明圈图。
图2：Pseudomonas oryzihabitansY-5在显微镜1000倍观察的细胞形态图。
图3：HPLC测定的阿魏酸标准品的色谱图。
图4：HPLC测定的阿魏酸标准品的标准曲线。
具体实施方式
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，用去离子水定容到1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。
阿魏酸的高效液相测定方法：采用XBridgeTM C18(4.6×250mm，5μm)，条件为：进样量为10μL，柱温30±2℃，流速1mL/min，流动相为0.01％冰乙酸水溶液(A相)和乙腈(B相)，波长320nm，梯度洗脱，梯度洗脱方法：0-8min，A相流量80％，B相流量20％；8-13min，A相流量72％，B相流量28％；13-19min，A相流量42％，B相流量58％；19-25min，A相流量80％，B相流量20％。准确称取反式阿魏酸标品0.01g，用乙醇定容至10mL得到1g/L的标准贮备液。梯度稀释配制成3.125mg/L、6.25mg/L、12.50mg/L、25.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00、400.00mg/L标准液(阿魏酸标准品色谱图见图3)，将阿魏酸浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得到回归方程为：Y＝4.87×104X-1.53×105，R2＝0.9991。按照标准曲线回归方程求得样品中阿魏酸浓度。
实施例1：麦曲中高产阿魏酸酯酶菌株的筛选及鉴定
(1)样品采集及处理
麦曲采自浙江省绍兴市某黄酒厂，采集的麦曲置于密封的无菌塑料袋中4℃保存。称取麦曲样品5.0g，加至装有45mL已灭菌的富集培养基中，置于摇床上150-200rpm富集培养2-4h，温度为28-30℃。
富集培养基：硫酸铵1.3g，KH2PO4 0.37g，MgSO4·7H2O 0.25g，CaCl2·2H2O 0.07g，FeCl30.02g，酵母提取物1.0g，5mL阿魏酸乙酯(10％W/V溶于二甲基甲酰胺)，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。
(2)菌株的筛选
筛选培养基：NaCl 0.3g，硫酸铵1.3g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，琼脂粉18.0g，15mL阿魏酸乙酯(10％W/V溶于二甲基甲酰胺)，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。每个平板倒入约10-15mL培养基，平板呈均匀的乳白色。
在无菌操作环境下，将富集菌液摇匀，从中吸取5mL菌悬液用无菌水进行系列梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍样品稀释液，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个稀释梯度样液各0.1-0.15mL涂布于筛选培养基上，倒置在28-30℃培养箱内培养1-5d，观察平板上菌落的生长情况及菌落周围的透明圈大小，挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，反复划线确定纯菌落，接种于LB平板上观察个体形态及进行生理生化反应测定，最终筛选得一株菌，提取该菌株基因组，对其进行16S rDNA扩增测序，其16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。用所得的16S rDNA序列进行BLAST比对，结果显示，该菌株的16S rDNA的核苷酸序列与假单胞菌属Pseudomonas spp.不同菌株的序列一致性在99％以上，且与其中的Pseudomonas oryzihabitans strain AA21在构建的进化树的同一分支上，将该菌株命名为假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5。
假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018480，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2：Pseudomonas oryzihabitans Y-5的生理生化特性
将上述假单胞菌Pseudomonas oryzihabitansY-5接种于LB固体培养基上，形成的菌落为点状、表面呈蜡状、不透明、淡黄色、表面凸起，边缘整齐，革兰氏染色为阴性，菌体为杆状，单个出现或呈短链；其生理生化特征为：过氧化氢酶阴性，明胶液化阴性，氧化酶阴性，可利用葡萄糖、木糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖、甘露糖产酸，不可利用淀粉、乳糖，可在42℃下生长。菌株的生理生化特征如表1所示。
表1 Pseudomonas oryzihabitans Y-5的生理生化特征
Figure BDA0002031971740000041
注：+：表示该菌株反应呈阳性，即产气/发酵产酸；-：表示该菌株反应呈阴性；
实施例3：Pseudomonas oryzihabitans Y-5的发酵液中阿魏酸酯酶酶活的测定
将假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5接种到LB液体培养基，于28±2℃培养24～32h，即为假单胞菌种子液。
粗酶液制备方法：将培养24h的菌株种子液按体积比为4％的接种量接种到100mL诱导培养基中，于30℃，200r/min下培养3d，10000g离心15min，上清液即为粗酶液。
诱导培养基：NaCl 1.0g，胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，麦麸10g，蒸馏水100mL，pH自然，于115℃灭菌20min。
阿魏酸酯酶酶活测定：取粗酶液1.0mL于5mL离心管中，于30℃预热5min，然后加入1.0mL阿魏酸甲酯溶液(pH 6.0)，混匀保温10min，然后迅速加入2mL冰乙酸(10％，V/V)终止反应。空白组样品为煮沸灭活的粗酶液代替，其余处理方法同上。将反应后溶液在8000rpm离心20min，取上清液过0.22μm滤膜，用高效液相色谱法测定其阿魏酸含量。
阿魏酸酯酶酶活定义：在30℃，pH值为6.0的条件下，酶液每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成1μmol/L阿魏酸所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。阿魏酸的含量采用高效液相色谱法(HPLC)测定。
经测定，在麸皮诱导下，假单胞菌发酵粗酶液的酶活为116U/L。
实施例4：利用Pseudomonas oryzihabitans Y-5发酵生产阿魏酸
筛选培养基：NaCl 0.3g，硫酸铵1.3g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，琼脂粉18.0g，15mL阿魏酸乙酯(10％W/V溶于二甲基甲酰胺)，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。每个平板倒入约10-15mL培养基，平板呈均匀的乳白色。
发酵培养基：NaCl 0.3g，硫酸铵1.3g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，15mL阿魏酸乙酯(10％W/V溶于二甲基甲酰胺)，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。
将假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5用点接法接种到筛选培养基上，37℃培养48h后，观察因降解培养基中阿魏酸酯乙酯而产生的透明圈。然后将假单胞菌Y-5转接到100mL的发酵培养基中，37℃摇床培养48h，将培养液8000g离心10min，取上清用0.22μm的膜过滤入进样瓶，用高效液相色谱法测定培养液中阿魏酸含量。以不加菌株的培养基作为空白对照，测得发酵培养基中阿魏酸的含量为59.51±0.6mg/L。
实施例5：半固态发酵测定束缚型阿魏酸释放量
将假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5接种到LB液体培养基中，于28±2℃培养24～32h，即为假单胞菌种子液，种子液浓度为107-108个/mL。
将冷却后的假单胞菌种子液5mL接种到100mL发酵培养基中，使得培养基中假单胞菌的终浓度为105～106个/mL，37±2℃摇床150r/min，培养72h。取发酵液离心(8000g，10min)后过0.22μm滤膜到进样瓶中，用高效液相色谱测定发酵液中的阿魏酸含量，将不接种假单胞菌的发酵培养基上清液作为空白对照；
发酵培养基配方为(g·L-1)：粉碎的麦麸10，(NH4)2SO4 1.3，KH2PO4 0.37，MgSO4·7H2O 0.25，CaCl2·2H2O 0.07，FeCl3 0.02，pH自然。
麦麸中总阿魏酸含量测定：采用碱水解的方法提取麦麸中总阿魏酸含量，以此来判断菌株的酶解效率。称取1.0g的麦麸到100mL的摇瓶中，加入80mL的NaOH溶液(1mol/L)，置于37℃摇床中150rpm水解24h。水解完成后，将水解液8000g离心15min后取上清，调节溶液pH至6.0，离心，过0.22μm，用液相测定并计算总阿魏酸含量。
经测定可知，1.0g麸皮中总阿魏酸的含量为6.59mg，占干重的0.66％。利用菌株Pseudomonas oryzihabitans Y-5发酵麸皮后，测得阿魏酸的量为5.12mg/g麦麸，因此，可知菌株Y-5发酵麸皮释放的束缚型阿魏酸的释放率为77.69％，证明通过发酵结束后束缚型阿魏酸得到了极大的释放。该菌株可以高产阿魏酸酯酶及相关酶系并能通过发酵的方法从植物中得到游离型阿魏酸。
实施例6：菌株Pseudomonas oryzihabitans Y-5的应用
将假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)Y-5接种到LB液体培养基中，于28±2℃培养24～32h，即为假单胞菌种子液。
传统麦曲的制备：称取10kg轧碎的小麦，加入1000mL的水，混合均匀堆积1h充分吸水，然后均匀摊平在托盘上，厚度约为5.0cm，培养温度为30℃，通过通风系统控制曲的发酵温度，控制在40℃以下，发酵38-40h。培养期间以喷淋式补水一次。培养发酵结束后，烘干至水分含量约为14％。
强化麦曲的制备：称取10kg轧碎的小麦，加入1000mL的水，混合均匀堆积1h充分吸水，然后均匀摊平在托盘上，厚度约为5.0cm，按照10％的接种量接入假单胞菌Y-5的种子液，培养温度为30℃，通过通风系统控制曲的发酵温度，控制在40℃以下，发酵38-40h。培养期间以喷淋式补水一次。培养发酵结束后，烘干至水分含量约为14％。
强化麦曲应用于黄酒的酿造：将强化麦曲按照15％的量(占原料糯米质量的百分比)加入到黄酒的酿造中，同时以等量传统麦曲的发酵样品作为对照实验，其他发酵参数和工艺相同；发酵结束测定两种麦曲发酵后黄酒的理化指标及黄酒中阿魏酸的含量。测定结果表明强化麦曲所酿黄酒的酒精度、pH值和还原糖含量与传统麦曲黄酒的指标相差不大，强化麦曲黄酒中阿魏酸含量约为传统麦曲黄酒的2.6倍。说明强化麦曲中的假单胞菌发挥了其功能，在不影响黄酒的酒精度、pH值和还原糖含量的同时，能够增加黄酒中阿魏酸的含量。与真菌阿魏酸强化麦曲相比较，假单胞菌强化麦曲具有操作简便、生产周期短和菌体繁殖快的优势。
表2强化麦曲和传统麦曲酿造黄酒的理化指标及阿魏酸含量的测定结果
Figure BDA0002031971740000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> Pseudomonas oryzihabitans
<400> 1
agattgcacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga gcggatgaga ggagcttgct 60
cctcgattca gcggcggacg ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctagta gtgggggaca 120
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ccatgggagt gggttgctcc agaagtagct agtctaacct tcggggggac ggttaccacg 1440
gagtgattca tgatctggga 1460

Claims (10)

1.一株产阿魏酸酯酶的假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)，其特征在于，所述假单胞菌已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018480，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.一种生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1所述的假单胞菌进行发酵生产。
3.一种生产阿魏酸的方法，其特征在于，所述方法是以阿魏酸乙酯为底物，利用权利要求1所述的假单胞菌进行发酵生产。
4.一种从植物中得到游离型阿魏酸的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1所述的假单胞菌发酵产生的阿魏酸酯酶使植物中束缚型阿魏酸释放出来。
5.一种提高发酵食品中阿魏酸含量的方法，其特征在于，是将权利要求1所述假单胞菌接种到发酵食品的生产过程中，通过假单胞菌将交联状态的阿魏酸酯类转化为阿魏酸，进而提高发酵食品中的阿魏酸含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵食品为黄酒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述的假单胞菌种子液接种到麦曲中，得到强化麦曲，再利用强化麦曲进行黄酒酿造。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌种子液为将假单胞菌接种到培养基中，于28±2℃培养24～32h后得到。
9.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的假单胞菌。
10.权利要求1所述的假单胞菌或权利要求9所述的微生物菌剂在食品技术领域的应用。
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