CN108795800A - 一株产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌 - Google Patents

一株产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株从青贮饲料分离得到的可以产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌，保藏号为CGMCC12955，具有产阿魏酸酯酶的能力，最适pH 6.4，最适温度37℃，在pH 5‑7，温度25‑50℃条件下可以保持较好的稳定性。本发明菌株可应用于青贮饲料添加剂的制备以及保健食品和药品的制备。

Description

一株产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及乳酸菌开发与应用领域，特别是一株产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌。
背景技术
阿魏酸(ferulic acid，C10H10O4)，化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是在植物界中存在最广泛的轻基肉桂酸成分之一，因其具有去除活氧自由基、吸收紫外线、抑制色素生成及抗炎等作用，被广泛的应用于医药、化妆品及化工等行业。另外，在植物的细胞壁中，阿魏酸单体和多种二聚体与半纤维素、木质素通过酯键交联，加强了三维的多糖网状结构，并且限制了纤维素的利用和微生物对于植物纤维类材料的降解。
阿魏酸酯酶(ferulic acid/feruloly esterase，EC 3.1.1.73)又称为肉桂酰酯酶或肉桂酸酯酶，从属于碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase，CE)亚家族，属胞外酶，是半纤维素降解酶系的组成部分之一。它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键；可以打断半纤维素之间、半纤维素与木质素之间交联的酯键，一方面促进半纤维素、木质素与纤维素的分离，有利于纤维素的进一步利用，另一方面促进阿魏酸等酚酸类物质的分离。真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶。
阿魏酸酯酶在生物乙醇生产、制浆造纸、动物饲料生产中具有广泛的应用价值。在食品工业中，利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原材料通过阿魏酸酯酶的处理细胞壁变的疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用。乳酸菌生物制剂已广泛应用于青贮饲料生产中，并对提高青贮饲料发酵品，改善青贮饲料适口性，提高家畜采食量具有重要作用。由于大多数商业乳酸菌缺乏降解纤维素的酶，所以新型的产纤维分解酶乳酸菌的研究和利用已成为目前国内外研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有产阿魏酸酯酶能力的植物乳杆菌，以期在青贮饲料发酵生产中得到进一步开发利用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。
一种产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌FE1，保藏编号为CGMCC12955。
所述阿魏酸酯酶酶活性的最适pH为6.4，最适酶活性温度为37℃。
将所述菌株FE1的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE1的序列号：MF 093219。
所述产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌在发酵饲料中的应用。
所述产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌，按下述工艺步骤制备获得。
(1)出发菌株：以本实验室从青贮饲料中分离获得并且保藏的乳酸菌菌株为起始菌株，主要包括植物乳杆菌，短乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌等。
(2)筛选试验：将上述乳酸菌接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板培养基，适宜条件下培养，产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶。
(3)液体培养产酶：将(2)中初筛得到的菌株接种到含阿魏酸甲酯的培养基中进行发酵产酶。
(4)将(3)中培养后的酶液进行酶活测定，选出1株产酶活性高的菌株植物乳杆菌-FE1(拉丁文命名为Lactobacillus plantarum)。
(5)对产酶活性高的FE1菌株的生理生化特性和酶学性质进行分析测定。
(6)将菌株FE1的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE1的序列号：MF 093219。
本发明所述具有产阿魏酸酯酶能力的植物乳杆菌已于2016年9月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC12955，拉丁文命名为Lactobacillusplantarum。
本发明所获得的植物乳杆菌FE1，可应用于发酵工业生产当中，特别是应用于青贮饲料的发酵中。阿魏酸酯酶在生物乙醇生产、制浆造纸、动物饲料生产中具有广泛的应用价值。在青贮饲料生产中，使用产阿魏酸酯酶乳酸菌不仅可以提高青贮饲料发酵品质，同时又能降解青贮饲料中的纤维，提高动物对青贮饲料的消化率。
在食品工业中，利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原材料通过阿魏酸酯酶的处理细胞壁变的疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用，因此，筛选具有产阿魏酸酯酶的乳酸菌菌株具有重要的开发和应用价值。
附图说明
图1为本发明植物乳杆菌FE1粗酶液的最适反应pH。
图2为本发明植物乳杆菌FE1粗酶液的最适反应pH稳定性。
图3为本发明植物乳杆菌FE1粗酶液的最适反应温度。
图4为本发明植物乳杆菌FE1粗酶液的最适反应温度稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
培养基配方。
乳酸细菌培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。
实施例1：产阿魏酸酯酶菌株的筛选实验。
1.将乳酸菌活化2-3次，在MRS固体培养基上进行划线，37℃条件下培养2天。
2.挑取单菌落于不加葡萄糖，以阿魏酸乙酯为唯一碳源的MRS固体培养基上，每个板子加入0.3ml的阿魏酸乙酯溶液(将阿魏酸乙酯溶于二甲基甲酰胺，制成质量体积比为10％的溶液)，30℃下培养72h，观察平板上是否出现透明菌圈。
3.产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶。供试的一株植物乳杆菌FE1产生透明圈。
实施例2：液体培养产酶粗酶液及酶活分析测定。
1.初筛后植物乳杆菌FE1菌株在MRS液体培养基中，37℃，过夜培养，3000rpm离心5min，收集菌体。
2.用0.85％生理盐水洗涤菌体3次，重悬于去离子水中。
3.取菌悬液(定菌数1×109cfu/ml)接种到含阿魏酸甲酯的培养基中，100ml培养基中加5ml阿魏酸甲酯(1％W/V二甲基甲酰胺)，菌种接种量为2％(V/V)，进行发酵。发酵条件为37℃，48h，振荡频率为120rpm。
4.吸取9ml发酵液于10ml离心管中，10000rpm离心10min，上清液即为阿魏酸酯酶粗酶液，用于酶活测定。
5.取2ml粗酶液，50℃水浴10min。
6.加入2ml pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制成的0.5mg/ml阿魏酸甲酯溶液，50℃水浴20min。
7.沸水浴10min终止反应。
8.10000rpm离心20min，得到酶解液。
9.高效液相测酶活：色谱条件：C18色谱柱，Synergi 4um Hydro-RP 80；250*4.6mm4micro 393548-11；流动相：A甲醇—B 1％冰乙酸(28:72)；柱温40℃，检测波长320nm；进样量10μl，流速0.6ml/min。
10.酶活定义为：在50℃反应条件下，每分钟降解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。
表1本发明乳酸菌阿魏酸酯酶酶活。
实施例3：产FAE的植物乳杆菌FE1理化性质分析测定。
1.糖发酵、精氨酸产氨、硝酸盐还原和葡萄糖产气。
采用细菌微量生化反应管。
菌株活化2-3次，划线培养2-3d，用接种环挑取单菌落于生化管中，用灭菌的甘油封口，37℃培养2-3d观察其变色情况。
表2本发明乳酸菌对糖源的利用能力。
注：“+”表示利用该糖；“—”表示不利用该糖。CGMCC,中国微生物保藏中心。C-LP，植物乳杆菌标准菌株。LP,植物乳杆菌。
2.不同温度条件下菌株生长特性。
乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1*108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。分别放在温度为4、10、15、25、35、45、50℃的恒温培养箱中培养，其中4、10、15℃培养7d，25、35℃培养2d，45、50℃培养4d。分光光度计600nm处测定其OD值。
表3本发明乳酸菌不同温度下生长特性。
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。CGMCC,中国微生物保藏中心。C-LP，植物乳杆菌标准菌株。LP,植物乳杆菌。
3.不同pH条件下菌株生长特性。
乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。MRS液体培养基用盐酸或氢氧化钠调pH值至所需酸碱度，即pH值分别为：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0。于37℃恒温培养箱中培养7d，测其OD值，观察菌株的耐酸碱能力。
表4本发明乳酸菌不同pH下生长特性。
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。CGMCC,中国微生物保藏中心。C-LP，植物乳杆菌标准菌株。LP,植物乳杆菌。
4.菌株的耐盐特性。
乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。MRS液体培养基加入NaCl，使其盐浓度分别为：3％、4％、6.5％、8％、12％、18％。于37℃恒温培养箱中培养7d，测其OD值，观察菌株的耐盐能力。
表5本发明乳酸菌耐盐特性。
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
CGMCC,中国微生物保藏中心。C-LP，植物乳杆菌标准菌株。LP,植物乳杆菌。
实施例4：植物乳杆菌阿魏酸酯酶粗酶液的酶学性质分析。
1.最适pH及pH稳定性。
(1)最适pH值的测定：将加入阿魏酸甲酯的0.5mL酶液分别与0.5mL的不同pH缓冲液混合，在50℃下放置0.5h，测定残留酶活，以所测的最高酶活为100％，计算相对酶活。
(2)pH值稳定性的测定：将酶液置于pH 3.6-8的缓冲液中，在4℃放置0、0.5、1、2、3、4、6、8、20h，测定残留酶活(MFA为底物，50℃)，以各pH值的初始酶活为100％，计算相对酶活。
缓冲液是pH3.6、pH4.0、pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.0、pH5.6、pH6.0、pH6.4、pH7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
在低pH条件下，随着pH的增加，阿魏酸酯酶酶活升高，当pH超过6.4时，阿魏酸酯酶酶活开始下降，其最适pH为6.4，如图1所示。而且，在pH 5.0～7.0之间，该粗酶液均保持了较高的稳定性，如图2所示。
2.最适温度及温度稳定性。
(1)最适反应温度的测定：将加入阿魏酸甲酯的酶液0.5mL与0.5mL的pH 6.4的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液混合，在25～65℃(25、30、37、40、45、50、55、65℃)保温0.5h后，测定残留酶活。以所测的最高酶活为100％，计算相对酶活。
(2)温度稳定性的测定：在pH 6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中，分别将酶液置于25～65℃保温0、0.5、1、2、3、4、6、8、20h，测定残留酶活，以初始酶活为100％，计算相对酶活。
不同温度下，阿魏酸酯酶的活力会有很大的变化，其最适温度为37℃，如图3所示，在低温下呈上升趋势，但超过37℃时酶活下降。当在55℃和65℃时，2h后酶活就下降到了20％左右，如图4所示，而在25～50℃下有良好的稳定性。
实施例5：产阿魏酸酯酶植物乳杆菌在青贮饲料中的应用。
(1)青贮饲料的制备：以初花期刈割紫花苜蓿为青贮原料，将苜蓿萎蔫至水分含量为65％左右时，剪成2～3cm的片段，将活化好的产阿魏酸酯酶的菌株FE1按照1×106cfu/g鲜草的添加量均匀喷洒到草样中，对照组用等量蒸馏水代替。混匀后用聚氯乙烯塑料袋(30cm×23cm)装500g左右草样，真空包装机抽真空并封口后室温下进行青贮发酵60d，每个处理3个重复。
(2)化学成分测定：取适量60d青贮样品或原样，于65℃鼓风干燥48h烘干，微型粉碎机粉碎后过40目筛后备用。粗蛋白采用凯氏定氮法测定；非蛋白氮采用TCA(三氯乙酸)沉淀后凯氏定氮法测定；中性洗涤纤维、酸性洗纤维及酸性洗涤木质素含量用范氏洗涤法测定。干物质含量用105℃烘干法测定。
(3)发酵品质测定：称取20g青贮原样和样品，同时量取180ml蒸馏水按草水重量1：9的比例榨汁后用四层纱布过滤制备浸提液，于-20℃保存部分浸提液用于pH值，可溶性碳水化合物和氨态氮的测定；同时用50％(V/V)硫酸溶液酸化剩余浸提液使其pH值降低至2.0后于-20℃保存，用于乳酸、乙酸、丙酸、丁酸的测定。用pH计测定青贮料浸出液的pH值；可溶性碳水化合物用蒽铜-硫酸比色法测定；取上述滤液与25％(W/V)的TCA(三氯乙酸)按4:1的比例混合在4℃过夜以沉淀滤液当中的真蛋白，之后将此溶液在10000rpm、4℃条件下离心15min，取上清液用于氨态氮的测定(苯酚-次氯酸钠比色法)。乳酸、乙酸、丙酸、丁酸用高效液相色谱法测定，制备并酸化的滤液用0.22μm的滤头过滤后，用高效液相色谱仪测定分析，色谱条件：色谱柱型号：KC-811，检测器型号：SPD-M10AVP，流动相：3mmol/L的高氯酸，样品测定条件：进样量：5μl，柱温箱温度：50℃，流速：1mL/min，检测波长：210nm。
表6苜蓿添加乳酸菌和纤维素酶青贮60d后的化学组分、干物质损失。
注：同行数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。SEM，标准误。
紫花苜蓿青贮饲料的化学成分分析结果见表6。植物乳杆菌FE1处理组的可溶性碳水化合物含量显著低于对照组(P＜0.001)，粗蛋白含量均显著高于对照组(P＝0.026)。产阿魏酸酯酶植物乳杆菌FE1处理显著降低了青贮饲料的中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量(P＜0.001)。植物乳杆菌FE1处理组非蛋白氮及氨态氮的含量显著低于对照组(P＜0.001)，表明植物乳杆菌FE1处理能够抑制苜蓿青贮中蛋白的降解，从而可提高家畜对苜蓿青贮饲料蛋白的利用率。
青贮60d后，紫花苜蓿青贮饲料的发酵品质分析结果见表4。对照组的pH值显著高于植物乳杆菌FE1处理组(P＜0.001)。植物乳杆菌FE1处理组乳酸含量显著高于对照组；乙酸含量处理组显著高于对照组(P＜0.001)，丙酸含量没有显著性差异(P＝0.254)。对照组乳酸菌的数量高于植物乳杆菌FE1处理组(P＝0.002)，酵母菌和霉菌数量两个处理组之间没有差异。
以上测定结果表明，在青贮时接种产阿魏酸酯酶植物乳杆菌FE1，可显著提高青贮饲料发酵品质，降低青贮饲料纤维素的含量和蛋白降解程度，从而可提高家畜对青贮饲料的消化率。
表7苜蓿添加乳酸菌和纤维素酶青贮60d后的发酵品质、微生物数量。
注：同行数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。SEM，标准误。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州大学
<120> 一株具有产阿魏酸酯酶能力的植物乳杆菌
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1276
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）
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catggtccga gtttgaaaga tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt 120
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actctggtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1080
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc 1140
gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc 1200
tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1260
ggccttgtac acaccg 1276

Claims (4)

1.一种产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌FE1，保藏编号为CGMCC12955。
2.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌FE1，其特征在于所述阿魏酸酯酶酶活性的最适pH为6.4，最适酶活性温度为37℃。
3.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌在发酵饲料中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种产阿魏酸酯酶的植物乳杆菌FE1，其特征在于所述植物乳杆菌FE1按下述工艺步骤制备获得：
（1）出发菌株：以本实验室从青贮饲料中分离获得的乳酸菌菌株为起始菌株，主要包括植物乳杆菌，短乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌等；
（2）筛选试验：将上述乳酸菌接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板培养基培养，产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶；
（3）液体培养产酶：将（2）中初筛得到的菌株接种到含阿魏酸甲酯的培养基中进行发酵产酶；
（4）将（3）中培养后的酶液进行酶活测定，选出产酶活性高的1株菌株植物乳杆菌-FE1，拉丁文命名为Lactobacillus plantarum；
（5）对产酶活性高的FE1菌株的生理生化特性和酶学性质进行分析测定；
（6）将菌株FE1的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE1的序列号：MF 093219。
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