CN105802896A - 一种产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡萄糖醋杆菌 - Google Patents

一种产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡萄糖醋杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产葡萄糖二酸‑1,4‑内酯的葡萄糖醋杆菌，属于发酵技术领域。本发明提供了一株新的能产葡萄糖二酸‑1,4‑内酯的葡糖醋杆菌，该菌株从红茶菌中筛选分离到，能够以葡萄糖或淀粉质食品原料水解的可发酵性糖类为底物发酵生产葡萄糖二酸‑1,4‑内酯或功能性发酵饮料，本发明的葡糖醋杆菌具有较高的葡萄糖二酸‑1,4‑内酯的生产能力，产量可达3～5g/L，且该发酵工艺简单、成本低廉、反应稳定，为微生物法生产葡萄糖二酸‑1,4‑内酯和功能性发酵饮料的生产奠定了基础。

Description

一种产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡萄糖醋杆菌
技术领域
本发明涉及一种产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡萄糖醋杆菌，属于发酵技术领域。
背景技术
葡萄糖二酸-1,4-内酯能够有效抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，具有很强的解毒和抗氧化性能，通过参与人体代谢活动调节体内激素环境发挥化学防癌作用，预防和有效抑制如食道癌、结肠癌、激素依赖性癌症乳腺癌、肝癌、皮肤癌和膀胱癌等病症。
目前，国内外研究者在世界不同地区的红茶菌饮料中均检测到葡萄糖二酸-1,4-内酯的存在，但均为混合菌群发酵。目前研究并公开的产葡萄糖二酸-1,4-内酯的单一菌株有名称为JlabA4的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactesp.)。利用单一微生物菌种发酵产葡萄糖二酸-1,4-内酯仍处在研究阶段。
发明内容
本发明提供了一株产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡糖醋杆菌(Komagataeibacterrhaeticus)WM407-1，已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2016213。
所述葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1，菌落呈圆形，细胞呈杆状，革兰氏阴性，无鞭毛，不产生水溶性色素，可以氧化乙酸或乳酸产生CO2和H2O，可以生成2-酮基-D-葡萄糖酸盐和5-酮基-D-葡萄糖酸盐，但不生成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐，且该菌株发酵产大量细菌纤维素膜。
所述葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1，能够以葡萄糖或淀粉质食品原料水解的可发酵性糖类为底物发酵产生葡萄糖二酸-1,4-内酯，且所得葡萄糖二酸-1,4-内酯游离在发酵上清液中。
所述葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1，是从红茶菌中分离得到的醋酸菌中筛选得到。将混合菌中分离出的不同醋酸菌分别以2％的接种量于醋酸菌培养基中30℃下、150rpm摇床培养4d，取菌液经0.22μm微孔滤头过滤后，通过SB-Aq高效液相色谱柱定量检测物质含量，筛选出可以产葡萄糖二酸-1,4-内酯的菌株。
本发明提供了一些培养所述葡萄糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1产葡萄糖二酸-1,4-内酯的方法：将菌株活化后，在醋酸菌培养基、糖茶水或淀粉质食品原料水解液中，以105～107CFU/ml的接种量，1/4～1/3的装液量于150ml三角瓶中培养，28～30℃下150～200rpm摇床培养4～7d或者静止培养7～12d。
所述醋酸菌培养基：葡萄糖20～100g/L，酵母提取物10g/L，乙醇35mL/L，纤维素酶10000～15000U/L。
所述糖茶水是将茶叶浸提液、糖源、水混合，茶叶包括绿茶、红茶、乌龙茶等的一种或任意组合，糖源包括葡萄糖、果糖、甘露醇等至少一种。
所述淀粉质食品原料水解液是将淀粉质食品原料以一定比例与水混合打浆，经酶解处理使淀粉水解为浓度为5～10g/100mL的可发酵性糖类，再通过离心过滤得到水解培养液，供菌株生长发酵；所述淀粉质食品原料包括红薯、山药、银杏、土豆、莲子等。
本发明利用葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1将廉价底物葡萄糖或淀粉质食品原料水解的可发酵性糖类转化成附加价值较高的葡萄糖二酸-1,4-内酯，具有解毒抗癌功效，提高机体免疫功能，具有很大的市场潜力。此外，用微生物法生产葡萄糖二酸-1,4-内酯，与化学法相比具有发酵工艺简单、成本低廉、反应稳定、原料利用率高、产品收率高、纯度高等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
生物材料保藏
一株KomagataeibacterrhaeticusWM407-1，已于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2016213。
附图说明
图1是葡萄糖二酸-1,4-内酯标准样品的高效液相色谱图。
图2是葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1在醋酸菌培养基中代谢产物葡萄糖二酸-1,4-内酯的高效液相色谱图；1是葡萄糖二酸-1,4-内酯。
图3是葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1在糖茶水中代谢产物葡萄糖二酸-1,4-内酯的高效液相色谱图；1是葡萄糖二酸-1,4-内酯。
图4是葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1在淀粉质食品原料水解液中代谢产物葡萄糖二酸-1,4-内酯的高效液相色谱图；1是葡萄糖二酸-1,4-内酯。
具体实施方式
实施例1菌株的筛选
(1)醋酸菌的分离
取少量红茶菌菌膜及菌液在醋酸菌培养基A1(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，乙醇35‰，纤维素酶15000U/L)中富集，30℃下，150rpm摇床培养2d，依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-75个梯度，分别取稀释后的样品各100μL涂布于含100mg/mL制菌霉素的醋酸菌固体培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，乙醇35‰，琼脂20g/L)中30℃下培养3～4d，每个稀释梯度重复2次。挑选有透明圈且呈革兰氏阴性的单菌落接种于醋酸菌培养基A1，30℃下150rpm摇床培养至对数期取样保藏，收集培养4d发酵液，离心取上清液以备检测。
(2)葡萄糖二酸-1,4-内酯的定性定量检测
取不同单菌落的发酵液各500μL，分别置于3K超滤管中离心超滤，去除菌体、蛋白等大分子物质，收集滤液置于2mL离心管中。
采用AgilentSB-Aq色谱柱，色谱条件：流动相为0.025mol/LKH2PO4(pH2.5)，流速0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。测定不同浓度的葡萄糖二酸-1,4-内酯的标样，如图1，得到标准曲线为y＝1.0×106x-81382。再将处理好的发酵液上清上样，得到不同发酵液上清的SB-Aq色谱图，分别与标样色谱图进行对照。筛选出可以产葡萄糖二酸-1,4-内酯的醋酸菌进行下一步鉴定。由图2可以看到，该菌液中代谢产物葡萄糖二酸-1,4-内酯的产量为1.68g/L。
(3)菌株的鉴定
提取筛选出的产葡萄糖二酸-1,4-内酯的醋酸菌的基因组DNA，并使用通用引物27F、1492R对不同基因组进行PCR，收集PCR产物进行核酸电泳验证后，由上海华大科技有限公司完成16SrDNA测序，将测序结果在NCBI中与已有序列进行B1ast比对分析。鉴定结果为葡萄糖醋杆菌(Komagataeibacterrhaeticus)WM407-1。
实施例2
HPLC法定量检测葡糖醋杆菌(Komagataeibacterrhaeticus)WM407-1在糖茶水中葡萄糖二酸-1,4-内酯的产量，实施步骤如下：
糖茶水制备：红茶5g，葡萄糖60g，置于1L煮沸的水中于80℃浸提30min，过滤去渣，分装灭菌。
菌株培养：107CFU/mL的接种量，1/3装液量将葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1接种于150mL三角瓶中，4层纱布封住，30℃下静止培养12d。
HPLC定量检测：取菌液500μL，分别置于3K超滤管中离心超滤，去除菌体、蛋白等大分子物质，收集滤液置于2mL离心管中，采用AgilentSB-Aq色谱柱进行检测，检测结果如图3，该菌液中代谢产物葡萄糖二酸-1,4-内酯的产量为2.70g/L。
实施例3
HPLC法定量检测葡萄糖醋杆菌(Komagataeibacterrhaeticus)WM407-1在淀粉质食品原料水解液中葡萄糖二酸-1,4-内酯的产量，实施步骤如下：
(1)淀粉质食品原料水解液制备：红薯粉与水以一定比例溶解，经淀粉酶、糖化酶等酶解处理，离心过滤取上清液，煮沸灭菌30min。
(2)菌株培养：107CFU/mL的接种量，1/3装液量将葡糖醋杆菌K.rhaeticusWM407-1接种于250mL三角瓶中，4层纱布封住，30℃下200rpm摇床培养7d。
HPLC定量检测：取菌液500μL，分别置于3K超滤管中离心超滤，去除菌体、蛋白等大分子物质，收集滤液置于2mL离心管中，采用AgilentSB-Aq色谱柱进行检测，检测结果如图4，该菌液中代谢产物葡萄糖二酸-1,4-内酯的产量为4.52g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株葡萄糖醋杆菌(Komagataeibacterrhaeticus)WM407-1，于2016年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2016213。
2.一种应用权利要求1所述K.rhaeticusWM407-1产葡萄糖二酸-1,4-内酯的方法其特征在于，以醋酸菌培养基、糖茶水或淀粉质食品原料水解液为原料，培养K.rhaeticusWM407-1产葡萄糖二酸-1,4-内酯。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述醋酸菌培养基含有：葡萄糖20～100g/L，酵母提取物10g/L，乙醇35mL/L，纤维素酶10000～15000U/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖茶水是将茶叶浸提液、糖源、水混合得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，茶叶包括绿茶、红茶、乌龙茶等的一种或任意组合，糖源包括葡萄糖、果糖、甘露醇中至少一种。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述淀粉质食品原料水解液是将淀粉质食品原料以一定比例与水混合打浆，经酶解处理使淀粉水解为浓度为5～10g/100mL的可发酵性糖类，再通过离心过滤得到水解培养液，作为原料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述淀粉质食品原料包括红薯、山药、银杏、土豆、莲子等。
8.根据权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，将菌株活化后，在醋酸菌培养基、糖茶水或淀粉质食品原料水解液中，以105～107CFU/ml的接种量，1/4～1/3的装液量于150ml三角瓶中培养，28～30℃下150～200rpm摇床培养4～7d或者静止培养7～12d。
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