CN107475012B - 一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属白酒酿制工艺技术领域，为解决传统清香型白酒固态发酵过程中夏季出酒率低、乙/乳比低的问题，提供一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法。利用汾酒新鲜酒醅筛选高产酯酿酒酵母、产淀粉酶的米根霉、耐酸耐酒精的烟色红曲霉和耐高温且具蛋白酶淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌，制成酿酒酵母生产用酒母、米根霉生产用麸曲、烟色红曲霉生产用米曲、枯草芽孢杆菌生产用菌液，然后以一定比例与生产用大曲加到糁料中，入缸发酵获得清香型白酒。成本降低，所得酒乙/乳比高、总酸含量高、出酒率高、酯香浓郁，具清香、糟香、带酱感，落口酸爽，醇厚，绵柔，解决了清香型白酒乙/乳比低，酸低导致酒香小、香气不协调、欠醇厚、后味短的难题。
Description
技术领域
本发明属于白酒酿造工艺技术领域，具体涉及一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，所酿造的清香型白酒具有高乙酸乙酯、低乳酸乙酯，且出酒率和优质率提高。
背景技术
杏花村汾酒是清香型白酒的典范，素有入口绵、落口甜、饮后余香、回味悠长的特点。杏花村汾酒是通过网罗自然环境中的微生物，经过几千年驯化，形成具有独特微生物菌群，且利用大曲并采用固态地缸发酵，甑桶蒸馏而成的白酒，具有6000年的发展史和1500年的成名史。其中的微生物菌群是杏花村白酒发酵的“灵魂”。
清香型白酒的主体香味成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，占总酯的95%以上，其中乙酸乙酯占总酯的55%以上，它的含量高低直接影响清香型白酒的质量和风格。传统发酵白酒中酯香成分的含量波动较大，特别是夏季发酵生产时，由于环境温度高、湿度大，酒醅中乳酸菌含量高，易导致原料出酒率低，白酒中乳酸乙酯浓度相对偏高，而主体香乙酸乙酯含量相对较低，使酒体香味失去平衡，产生白酒生产上的“掉排”现象。为此，提高清香型白酒中乙酸乙酯含量、降低乳酸乙酯相对含量（“增乙降乳”），提高出酒率，预防白酒生产的“掉排”，成为夏季清香型白酒生产中需要解决的问题。
为了提高白酒中乙酸乙酯含量、降低乳酸乙酯相对含量，白酒生产企业通常采用强化外来生香酵母或延长二楂发酵周期的方式进行，这两种方法在一定程度上可以提高乙酸乙酯含量，但是这些生产方式或成本高、不能兼顾出酒率，另外引入外来微生物菌种来提高白酒中的乙酸乙酯含量，但是外来微生物破坏传统白酒发酵环境中经长期驯化而建立起来的微生物菌群结构，导致清香大曲白酒的清香出格，这是不利于白酒风格的保持。为此，亟待开发和利用土著功能性微生物强化清香型白酒发酵生产，改善其发酵工艺，提高清香型白酒的原料出酒率、白酒的乙酸乙酯含量，降低白酒乳酸乙酯相对含量、降低白酒生产成本。
发明内容
本发明为了解决传统清香型白酒固态发酵过程中夏季出酒率低、乙酸乙酯含量低、乳酸乙酯含量相对高的问题，避免白酒生产“掉排”现象的发生，提供了一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，利用汾酒新鲜酒醅分离筛选出高产酯酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、产淀粉酶的米根霉（Rhizopus oryzae）、耐酸耐酒精的烟色红曲霉（Monascus fuliginosus）和耐高温且具蛋白酶淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），制备成酿酒酵母生产用酒母、米根霉生产用麸曲、烟色红曲霉生产用米曲、枯草芽孢杆菌生产用菌液，然后以糁料重量为计算基准，接种1%-2%的酿酒酵母生产用酒母、5%-7%米根霉生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲进行大楂发酵，接种0.5%-1%的烟色红曲霉生产用米曲、1%-2%的枯草芽孢杆菌生产用菌液进行堆积发酵，然后向堆积发酵好的酒醅中再接种1%-2%的酿酒酵母生产用酒母、5%-7%米根霉生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲进行入缸二楂发酵。
所述酿酒酵母生产用酒母的制备方法为：（1）高产酯酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的分离培养：采集汾酒新鲜酒醅10g溶解于无菌生理盐水中，制备成原液，再通过10倍倍比稀释法稀释原液，取倍比稀释液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在酵母膏培养基上进一步划线纯化培养2-3次，纯化后转入酵母膏固体斜面培养基，4℃保存，备用；所得到的酵母菌通过发酵培养检测香气，菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26s rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯高耐受性土著酿酒酵母Yfen.2；(2)酿酒酵母生产用酒母的制备：将斜面培养的酿酒酵母Yfen.2接种于酵母膏液体培养基，28℃，200r/min摇床培养24h-48h, 培养至含菌量≥2.0×108CFU/ml，以发酵糖液的体积为计算基准，接种量为3% V/V接种于发酵糖液中，28℃, 200r/min，培养24h-48h，培养至发酵液中菌体含量≥2.0×108CFU/ml后, 28℃,再静止培养5-28d即可；
所述米根霉生产用麸曲的制备方法为：（1）土著米根霉（Rhizopus oryzae）的分离：采集汾酒新鲜酒醅10g溶解于无菌生理盐水中，制备成原液，再通过10倍倍比稀释法稀释样品，取倍比稀释液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h-72h，选择菌落特征明显的单菌落在PDA培养基上进一步划线纯化培养2-3次，纯化后转入PDA固体培养基，4℃保存，备用；所得到的米根霉通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、ITS1-5.8SrDNA-ITS2 基因区域检测鉴定，以及淀粉酶活力和淀粉酶环境耐受性检测，获得产淀粉酶且具有环境耐受性的土著米根霉Mfen.2；（2）米根霉生产用麸曲的制备：取淀粉含量≥11%的麸皮50份，水50份，接种含孢子数为107～108/ ml米根霉Mfen.2 溶液10份，40℃培养84h，糖化力达到700 U/g～818 U/g，液化力0.7 U/g～1.1 U/g即可；
所述烟色红曲霉生产用米曲的制备方法为：（1）耐酸、耐酒精烟色红曲霉（Monascus fuliginosus）Mfen.jia的分离：采集发酵24天的汾酒新鲜酒醅10g溶于100ml水中，制备成原液，再通过10倍倍比稀释法稀释样品，取梯度稀释液各100ul涂布于麦芽汁培养基的平板上，28℃倒置培养72h，选择菌落特征明显的单菌落在麦芽汁培养基上进一步划线纯化培养2-3次，4℃保存，所得到红曲霉接种于麦芽汁培养基或PDA培养基，35℃培养5-7d，通过菌落特征及菌体形态观察、镜检、理化特征检测、ITS1-5.8SrDNA-ITS2 基因区域检测鉴定，获得耐酸、耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia；(2)烟色红曲霉生产用米曲的制备：用10份体积浓度为0.5%的无菌乳酸水冲洗红曲霉斜面试管，制备成含有孢子数为107～108/ ml的菌悬液，将菌悬液接种于100份的大米培养基中，35℃-42 ℃培养5-7d，培养基颜色发红即可；
所述枯草芽孢杆菌生产用菌液的制备方法为：(1)耐高温并产蛋白酶、淀粉酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Bfen.JIA的分离：采集10g汾酒新鲜酒醅于牛肉膏液体培养基中，于37℃，45℃、50℃温度条件下各培养2h，通过10倍倍比稀释法分离枯草芽孢杆菌，取倍比稀释样品液各100ul涂布于牛肉膏固体平板上，45℃、50℃、55℃分别培养，获得耐50℃的菌体，菌株通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、16s rDNA基因区域检测鉴定以及蛋白酶活性及淀粉酶活性的检测，获得耐高温且具有蛋白酶和淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌Bfen.jia；（2）耐高温并产蛋白酶、淀粉酶枯草芽孢杆菌Bfen.jia生产用菌液的制备：将斜面培养的枯草芽孢杆菌Bfen.jia接种于牛肉膏培养液，37℃-45℃培养24h-48h；以牛肉膏培养液体积为计算基准，接种量为3% V/V接种于牛肉膏培养液中，37℃-45℃恒温培养48h即可。
具体酿造清香型白酒的方法为：
（1）主粮处理：高粱作为发酵用主粮，将高粱进行常规润糁、蒸糁，冷却后红糁含水量为58%-65%；
（2）接种曲种：以红糁重量为计算基准，添加1%-2%的高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、5%-7%的米根霉Mfen.2生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲，混匀；
（3）大楂发酵：起始温度为22℃-25℃，培养1天，然后每天升温1℃，至30℃后，恒温发酵5-7天，然后逐天降温1℃至27℃，恒温发酵至28天，甑桶蒸馏酒醅，蒸馏温度95℃-105℃、蒸汽压力0.1-0.2Mpa、流酒温度28℃-32℃，获得白酒，做普通基酒用；
（4）堆积发酵：蒸馏后的酒醅降温至室温，以红糁重量为计算基准，添加0.5%-1%m/m的耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia生产用米曲和1%-2% V/m耐高温并产蛋白酶和淀粉酶的枯草芽孢杆菌Bfen.jia菌液，混匀后35-42℃堆积发酵24h；
（5）入缸二楂发酵：以红糁重量为计算基准，向堆积发酵好的醅中，再添加1%-2%V/m的高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、5%-7% m/m的米根霉Mfen.2生产用麸曲、3%-5% m/m的生产用大曲，混匀发酵，发酵起始温度为22℃-25℃，培养1天，然后每天升温1℃，至30℃后，恒温发酵5-7天，然后逐天降温1℃至27℃，恒温发酵至40天-55天，甑桶蒸馏酒醅，蒸馏温度95℃-105℃、蒸汽压力0.1-0.2Mpa、流酒温度28℃-32℃，获得清香型白酒。
高产酯酿酒酵母生产用酒母的制备方法为：（1）高产酯酿酒酵母的分离培养：采集汾酒新鲜酒醅，称取10g溶解于无菌生理盐水中，进行10倍倍比稀释，取梯度稀释样品液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在酵母膏培养基上进一步划线纯化培养2-3次，纯化后转入酵母膏固体斜面培养基，4℃保存，备用；所得到的酵母菌通过发酵培养闻香气，菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26srRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯高耐受性土著酿酒酵母Yfen.2；(2) 酿酒酵母Yfen.2生产用酒母的制备：将斜面培养的酿酒酵母Yfen.2，接种于酵母膏液体培养基，28℃，200r/min摇床培养24h-48h,培养至含菌量≥2.0×108CFU/ml，以发酵糖液的体积为计算基准，接种量为3% V/V接种于发酵糖液中，28℃,200r/min恒温摇床培养24h-48h后,再静止培养7-30d即可，发酵液中菌体含量≥2.0×108CFU/ml即可。
所述酵母膏培养基为：葡萄糖2份、胰蛋白胨2份、酵母提取物1份、蒸馏水100份、pH5.0-5.5，121℃、0.1MPa灭菌20min； 所述发酵糖液为：蒸馏水稀释含糖量为67.88%的糖浆至起始糖度为22°Bx，0.1MPa，121℃灭菌20min；所述PDA培养基为常规PDA培养基，所述麦芽汁培养基为：糖度为22°Bx的新鲜麦芽汁中添加乳酸至乳酸浓度为3% V/V，121℃灭菌20min；大米培养基的制备：用体积浓度为0.5%乳酸水浸泡大米8h-10h，控干，纱布包裹，0.1MPa，121℃灭菌20min，打撒米，加水10-20ml，0.1MPa，121℃灭菌20min，大米湿而不粘即可；所述牛肉膏培养基为：牛肉膏5份，蛋白胨10份，酵母膏5份，NaCl 5份，可溶性淀粉5份，蒸馏水1000份，琼脂18份，Ph07.2，121℃灭菌20min。
所述高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2在酵母膏培养基上：菌落为乳白色，表面光滑，中间厚，边缘薄，呈奶酪状，边缘与中央颜色一致，边缘整齐；菌体为椭圆形，单向产生子细胞，不产生假菌丝，菌体培养2-7天，产生果香；
所述米根霉Mfen.2在PDA培养基上：菌落圆形，边缘整齐，致密绒毛状；菌丝发达，生长快，初疏松、白色，匍匐菌丝透明发达，后稠密，颜色变为灰色；菌丝无隔，菌体产黑色孢子囊，孢子较小，呈椭圆形或圆形，颜色为黑色；孢囊梗由生假根处的匍匐菌丝长出，多数成丛生、少数单生，囊轴呈圆形，无囊基、囊领，菌丝体无横隔；
所述烟色红曲霉Mfen.Jia在PDA培养基或麦芽汁培养基上：菌丝发达,具横隔多核,有初生次生小梗，分生孢子呈杆状，具有大量闭囊壳，菌落呈圆形，生长初期表面白色菌丝，生长后期在麦芽汁琼脂培养基上老熟后菌落表面呈烟灰色,易粘，菌落背面呈黑红褐色；在PDA培养基上呈疮疤状，有浓郁的复合酯香香气；
所述枯草芽孢杆菌Bfen.jia在牛肉膏培养基上：菌落中央无色透明，周边呈白色，粘稠，菌体呈杆状，革兰氏阳性，产芽孢，芽孢不鼓起。
所获得的白酒陶坛贮存1年以上即可使用。
采用本发明所述方法酿制的白酒乙酸乙酯高、乳酸乙酯低，总酸含量高，生产成本低，出酒率高，酒香，带酱感，有酸爽感。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明采用多菌种强化大曲发酵生产的清香型二楂白酒乙酯含量高，经检测，酒精度为61%的高酯白酒乙酸乙酯含量为10.88g/L、总酯含量为11.22 g/L，乙酸乙酯含量占到了总酯类含量的96.97%，乙酸乙酯比传统清香型白酒中乙酸乙酯含量提高了约252%，总酯含量提高了105%，乙酸乙酯/乳酸乙酯提高至14.70，乙酸乙酯香味浓郁。该白酒可作为高酯白酒用于乙酸乙酯偏低、乳酸乙酯偏高，乙酸乙酯/乳酸乙酯比例不协调、总酸含量低的基酒的勾调。尤其适合于用来勾调夏季乙酸乙酯偏低或乳酸乙酯偏高基酒。该酒对香气淡、酸低、冲、辣的白酒，能起到缓冲的作用。
（2）利用该工艺生产的二楂白酒乳酸乙酯含量低：酒精度为61%的高酯白酒乳酸乙酯含量约0.74 g/L，比同期发酵的传统清香型大曲白酒中乳酸酸乙酯含量低了约2.5g/l，可用于乳酸乙酯含量高的基酒的勾兑。
（3）利用该工艺生产的白酒总酸含量高，比传统清香型大曲白酒中总酸高了约2倍，可用于总酸低的基酒勾兑。可用于总酸低的基酒勾兑。该工艺生产白酒主要的酸性物质是乙酸，可以给白酒带来酸爽感。
（4）利用该工艺生产的白酒原料出酒率为48%，比传统清香型大曲白酒出酒率提高了约4%。
（5）菌种强化发酵白酒感官品评结果：品酒师对该调节酒进行感官品评，认为该菌种强化发酵白酒大楂酒清香、醇厚；二楂酒（高酯白酒）具有清香，糟香，酯香明显，带酱感，落口酸爽，醇厚，绵柔的特点。
（6）利用该发酵工艺，保持白酒清香风格，降低了清香型大曲白酒的用曲量，降低了由大曲接种带入的乳酸菌的数量，预防了由于夏季温度高，乳酸菌大量繁殖，导致出酒率低，生产提前“掉排”现象的发生。
（7）本发明采用多菌种加大曲生产清香型白酒，比传统的清香型大曲白酒出酒率高，大曲用量降低5%，降低了酿酒成本。
（8）利用从杏花村汾酒生产环境分离出来的土著酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Yfen.2、米根霉（Rhizopus oryzae strain） Mfen.2、土著烟色红曲霉（Monascus fuliginosus ）Mfen.jia、土著枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）Bfen.jia强化发酵生产清香型白酒，不具有破坏传统清香型白酒发酵环境中经长期驯化而建立起来的微生物菌群结构，改变清香型白酒风格的风险。
（9）利用该工艺发酵二楂酒醅总酸度（2.7 -2.8度）比传统清香型白酒工艺发酵的二楂酒醅总酸含量（3.0-4.0度）略低，但挥发性乙酸含量相差较大（表7），非挥发性乳酸含量相对低，表明利用该工艺可以有效抑制乳酸菌对固态酒二楂发酵的影响。
从该菌群中分离优势的功能性菌株，可为清香型白酒生产由自然发酵向必然发酵提供土著菌种资源，避免生产中为了提高白酒产量或质量强化外来菌株而破坏杏花村汾酒生产环境中独特微生物菌群结构的危险。
附图说明
图1是本发明酿酒酵母Yfen.2的菌落特征图和菌体显微特征图，显微放大倍数为10×40倍；图2是本发明酿酒酵母Yfen.2遗传发育树；图3是不同酵母发酵液乙酸乙酯含量比较结果图；图4是本发明米根霉Mfen.2培养2天的菌落特征图和培养4天的菌落特征图；图5是本发明米根霉Mfen.2菌体特征图，放大倍数为10×40倍；图6是本发明米根霉Mfen.2的遗传发育树；图7是本发明米根霉Mfen.2产糖化酶的温度耐受性；图8是本发明米根霉Mfen.2产液化酶的温度耐受性；图9是本发明米根霉Mfen.2产糖化酶的pH耐受性；图10是本发明米根霉Mfen.2产液化酶的pH耐受性；图11是本发明烟色红曲霉Mfen.jia在麦芽汁培养基和PDA培养基上正面和反面的菌落特征图；图12是本发明烟色红曲霉Mfen.jia的菌丝体和子囊果显微镜检图，放大倍数为10×40倍；图13是本发明烟色红曲霉Mfen.jia遗传发育树；图14是本发明枯草芽孢杆菌Bfen.jia的菌落特征和菌体显微镜检图，显微放大倍数为10×100倍；图15是本发明枯草芽孢杆菌Bfen.jia的产淀粉酶试验结果；图16是本发明枯草芽孢杆菌Bfen.jia的产蛋白酶试验结果；图17是本发明枯草芽孢杆菌Bfen.jia遗传发育树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明
一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，利用汾酒新鲜酒醅分离筛选出高产酯酿酒酵母、产淀粉酶的米根霉、耐酸耐酒精的烟色红曲霉和耐高温且具产蛋白酶和淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，制备成酿酒酵母生产用酒母、米根霉生产用麸曲、烟色红曲霉生产用米曲、枯草芽孢杆菌生产用菌液，然后以糁料重量为计算基准，接种1%-2%的酿酒酵母生产用酒母、5%-7%米根霉生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲进行大楂发酵，接种0.5%-1%的烟色红曲霉生产用米曲、1%-2%的枯草芽孢杆菌生产用菌液进行堆积发酵，然后向堆积发酵好的酒醅中再接种1%-2%的酿酒酵母生产用酒母、5%-7%米根霉生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲进行入缸再发酵（二楂发酵）。
例1：高产酯耐受性土著酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Yfen.2菌株的分离：
采集汾酒新鲜酒醅，称取10g溶解于无菌生理盐水中，进行10倍倍比稀释，取倍比稀释液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在酵母膏培养基上进一步划线纯化培养2-3次，纯化后转入酵母膏固体斜面培养基，4℃保存，备用；所得到的酵母菌通过发酵培养闻香气，菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26s rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯高耐受性土著酿酒酵母Yfen.2；于2017.8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14563，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
酵母膏培养基为：葡萄糖2份、胰蛋白胨2份、酵母提取物1份、蒸馏水100份、pH5.0-5.5，0.1MPa，121℃灭菌20min。
获得高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2在酵母膏培养基上：菌落为乳白色，表面光滑，中间厚，边缘薄，呈奶酪状，边缘与中央颜色一致，边缘整齐（图1）。菌体为椭圆形，单向产生子细胞，不产生假菌丝。液体培养时，有浓郁的乙酸乙酯香气，产酒精。
将提取所得酿酒酵母Yfen.2的26S rDNA近5’端的D1/D2序列输入GenBank数据库中，与已知菌株26S rDNA的基因序列进行同源性序列比对，可知酿酒酵母Yfen.2与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 26 S rDNA序列相似度为100%。比对结果见表1。
表1：酿酒酵母Yfen.2 26S rDNA近5’端的D1/D2序列同源性序列比对结果
图2为菌株Yfen.2 26S rDNA 序列的系统发育分析结果。从26S rDNA序列的系统进化树显示,菌株Yfen.2的遗传进化距离与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae最近，表明亲缘关系最近。
结合菌株菌落及菌体特征及分子生物学特征，确定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），将其命名为酿酒酵母Yfen.2。
1.酿酒酵母Yfen.2产酒精、乙酸乙酯以及乳酸乙酯的检测：
将酿酒酵母Yfen.2接种于酵母膏培养基培养24h后，以3%的量接种于发酵液，28℃恒温培养7d，出酒率达到10.5%（V/V），发酵液有浓郁的乙酸乙酯香气。将发酵液12 000rpm离心20min，取上清发酵液，采用气相色谱技术测定发酵液中挥发性成分，结果显示酿酒酵母Yfen.2可产生653mg/L的乙酸乙酯、2.23mg/L乳酸乙酯。发酵液中乙酸乙酯/乳酸乙酯比约为293，高乙酸乙酯/乳酸乙酯比。显然，分离到的酿酒酵母Yfen.2高产酒精，高产乙酸乙酯，乙酸乙酯/乳酸乙酯比高。与分离自汾酒酒醅中的其他酿酒酵母Y2、…、Y16和安琪酿酒酵母(YO)发酵液的挥发性成分含量相比，其产乙酸乙酯的能力也最高（表2,图3）。其中发酵液的配制为：将含糖量为67.88%的甜高粱秸秆浓缩糖浆用蒸馏水稀释，使发酵液起始糖度为22°Bx，121℃蒸馏20min，备用。
表2 酿酒酵母Yfen.2发酵液中挥发性物质
| 安琪酿酒酵母（mg/l） | Yfen.2（mg/l） | |
| 乙醛 | 10.64 | 180.07 |
| 乙酸乙酯 | 2.94 | 653.45 |
| 乙缩醛 | 0.52 | 0.16 |
| 甲醇 | 2.30 | 2.26 |
| 正丙醇 | 22.48 | 14.87 |
| 异丁醇 | 87.81 | 56.60 |
| 乙酸异戊酯 | 0.34 | 0.51 |
| 戊酸乙酯 | 0.05 | 4.11 |
| 正丁醇 | 0.15 | 4.11 |
| 2-甲基—1-丁醇 | 35.90 | 44.47 |
| 3-甲基—1-丁醇 | 182.94 | 166.70 |
| 正戊醇 | 6.34 | 10.43 |
| 醋翁 | 8.47 | 34.03 |
| 庚酸乙酯 | 0.74 | 0.45 |
| 乳酸乙酯 | 0.06 | 2.26 |
| 正已醇 | 4.48 | 1.41 |
| 乙酸 | 1069.30 | 1276.4 |
| 丙酸 | 219.16 | 170.16 |
| 2,3—丁二醇(左旋) | 131.20 | 368.51 |
| 异丁酸 | 115.33 | 132.41 |
| 2,3—丁二醇(内消旋) | 0.11 | 4.81 |
| 丁酸 | 46.87 | 58.30 |
| 糠醇 | 0.06 | 0.07 |
| 异戊酸 | 2.81 | 6.81 |
| 戊酸 | 0.12 | 0.44 |
| 已酸 | 2.79 | 6.12 |
| β—苯乙醇 | 200.14 | 169.71 |
| 棕榈酸乙酯 | 5.42 | 6.22 |
| 油酸乙酯 | 0.88 | 1.04 |
| 亚油酸乙酯 | 0.13 | 0.29 |
2.酿酒酵母Yfen.2酒精耐受性检测：
将3%新鲜发酵的酿酒酵母Yfen.2酒母接种于含酒精分别为 0%、6%、8%、10%、12%、14%的活化培养基（酵母膏培养基，配方为葡萄糖2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、蒸馏水100mL、pH5.0-5.5、0.1MPa，121℃灭菌20min，备用），28℃培养，每隔12h观察发酵液的混浊程度及有无白色沉淀的产生，检测结果见表3，结果显示酿酒酵母Yfen.2在酒精度为14%的培养基中仍能生产，其最高耐受酒精度为14%。说明酿酒酵母Yfen.2具有较好的酒精耐受性，该特点决定其在较高酒精度的发酵培养基中仍能发挥功能。
表3﹕酿酒酵母Yfen.2的酒精耐受性
注：＋表示液体浑浊，大量气泡产生，底部有白色沉淀；±表示液体浑浊，有微量气泡产生；－表示液体清亮，几乎没有气泡产生。
3.酿酒酵母Yfen.2的温度耐受性的检测：
将3%新鲜发酵的酿酒酵母Yfen.2酒母接种于活化培养基（酵母膏培养基，配方为葡萄糖2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、蒸馏水100mL、pH5.0-5.5、0.1MPa，121℃灭菌20min，备用）中，分别置于28℃，30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃下恒温培养，每隔12h观察发酵液的混浊程度及有无白色沉淀的产生，结果见表4，结果显示酿酒酵母Yfen.2在39℃的条件下仍能生长，其最高耐受酒精度为39%。说明酿酒酵母Yfen.2具有较好的温度耐受性，该特点决定其在较高的温度下仍能发挥功能。
表4：酿酒酵母Yfen.2的温度耐受性
注：＋表示液体浑浊，大量气泡产生，底部有白色沉淀；±表示液体浑浊，有微量气泡产生；－表示液体清亮，几乎没有气泡产生。
4.酿酒酵母Yfen.2酸耐受性的检测：
将3%新鲜发酵的酿酒酵母Yfen.2酒母接种于pH为1.5、2.0、2.5、3.0。接入3%活化培养基（酵母膏培养基，配方为葡萄糖2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、蒸馏水100mL、pH5.0-5.5、0.1MPa，121℃灭菌20min，备用）中，28℃恒温培养，每隔12h，观察发酵液的混浊程度及有无白色沉淀的产生，结果见表5，结果显示酿酒酵母Yfen.2在pH2的培养基中仍能生长，其最高耐受pH为2，具有良好的酸耐受性。该特点决定其在较高的pH发酵培养基中仍能发挥功能。
表5酿酒酵母Yfen.2 的pH耐受性
注：＋表示液体浑浊，大量气泡产生，底部有白色沉淀；±表示液体浑浊，有微量气泡产生；－表示液体清亮，几乎没有气泡产生。
5.酿酒酵母Yfen.2糖耐受性的检测：
将3%新鲜发酵的酿酒酵母Yfen.2酒母接种于含葡萄糖分别为 18%、20%、22%、 24%的活化培养基（活化培养基为酵母膏培养基，配方为葡萄糖2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、蒸馏水100mL、pH5.0-5.5、0.1MPa，121℃灭菌20min，备用）中，28℃恒温培养，结果见表6，结果显示酿酒酵母Yfen.2在糖度为22%的培养基中仍能生长，其最高耐受糖度为22%。说明酿酒酵母Yfen.2具有较好的糖耐受性，该特点决定其在较高糖度的发酵培养基中仍能发挥功能。
表6酿酒酵母Yfen.2的糖耐受性
注：＋表示液体浑浊，大量气泡产生，底部有白色沉淀；±表示液体浑浊，有微量气泡产生；－表示液体清亮，几乎没有气泡产生。
例2：米根霉（Rhizopus oryzae）Mfen.2的分离：
采集汾酒新鲜酒醅，称取10g溶解于无菌生理盐水中，进行10倍倍比稀释，取倍比稀释液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h-72h，选择菌落特征明显的单菌落在PDA培养基上进一步划线纯化培养2-3次，纯化后转入PDA固体培养基，4℃保存，备用；所得到的米根霉通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、ITS1-5.8SrDNA-ITS2 基因区域检测鉴定，以及淀粉酶活力和淀粉酶环境耐受性检测，获得产淀粉酶且具有环境耐受性的土著米根霉（Rhizopus oryzae）；于2017.8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14149, 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所属的米根霉Mfen.2在PDA培养基（所述PDA培养基：马铃薯 200份， 葡萄糖 20份，蒸馏水100份、0.1MPa，121℃灭菌20min）上：菌落圆形，边缘整齐，致密绒毛状；菌丝发达，生长快，初疏松、白色，匍匐菌丝透明发达，后稠密，颜色变为灰色（图4）；菌丝无隔，菌体产黑色孢子囊，孢子较小，呈椭圆形或圆形，颜色为黑色。孢囊梗由生假根处的匍匐菌丝长出，多数成丛生、少数单生，囊轴呈圆形，无囊基、囊领，菌丝体无横隔（图5）。初步鉴定为米根霉。
通过对米根霉Mfen.2 ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域序列进行测序，与GenBank DNA序列库同源性序列比对发现，米根霉Mfen.2与米根霉（Rhizopus oryzae），序列相似性为相似性为100%（表7）。
表7：米根霉Mfen.2 ITS1-5.8SrDNA-ITS2同源性序列比对结果
从ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列的系统进化树显示（见图6）, 米根霉Mfen.2的遗传进化距离与米根霉（Rhizopus oryzae ）最近，表明亲缘关系最近。
综合菌落菌体特性和分子生物学鉴定，确定米根霉Mfen.2为米根霉，将其命名为米根霉（Rhizopus oryzae ）Mfen.2。
1．米根霉Mfen.2产淀粉酶的温度耐受性：
米根霉Mfen.2麸曲的制备：在250 ml的洁净三角瓶中加入麸皮15 g、水15 ml后，进行搅拌，待搅拌均匀后将其包好，置于121 ℃下灭菌20 min后，冷却至室温，接种米根霉Mfen.2 3 ml（孢子数107～108/mL），混匀，置于35 ℃的恒温培养箱中培养72 h（每隔24 h无菌搅拌一次），40℃烘干，备用；米根霉Mfen.2麸曲酶液制备：称取绝干重样品10 g，置于250ml烧杯中，加入20 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，补水170 ml，搅拌均匀；置于35 ℃恒温水浴锅保温浸渍1 h，过滤，收集酶液，备用；米根霉Mfen.2产淀粉酶的温度耐受性：将酶液置于20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃温度下进行糖化酶活力、液化酶活力的测定。结果显示，当温度在20 ℃-40℃之间，糖化力随着温度的升高而升高， 40℃时糖化力达到最大，为820U/g,在温度高于45℃以上时，糖化酶活力又逐渐降低（图7）；当温度在20 ℃-50℃之间，液化力随着温度的升高而升高，50℃时液化力达到最大，为1.2U/g,当温度高于50℃以上时，液化酶活力又逐渐降低（图8）。
2米根霉Mfen.2产淀粉酶的pH耐受性
米根霉Mfen.2麸曲的制备：在250 ml的洁净三角瓶中加入麸皮15 g、水15 ml后，进行搅拌，待搅拌均匀后将其包好，置于121 ℃下灭菌20 min后，冷却至室温，接种米根霉Mfen.2 3 ml（孢子数107～108/mL），混匀，置于35 ℃的恒温培养箱中培养72 h（每隔24 h无菌搅拌一次），40℃烘干，备用；米根霉Mfen.2麸曲酶液制备：称取绝干重样品10 g，置于250ml烧杯中，加入20 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，补水170 ml，搅拌均匀；置于35 ℃恒温水浴锅保温浸渍1 h，过滤，收集酶液，备用；米根霉Mfen.2产淀粉酶的pH耐受性：调整酶液pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，进行糖化酶活力、液化酶活力的测定。结果显示，pH3以下时，米根霉Mfen.2糖化酶淀粉酶活力为0；pH在3-4.5之间时糖化力和液化力均随着pH的升高而升高，当pH为最4.5时，糖化力和液化力可达到最大，分别为800U/g、1.2U/g，当pH在4.5-5之间时，糖化力和液化力均随着pH的升高而降低（图9、10）。
例3：耐酸、耐酒精烟色红曲霉（Monascus fuliginosus）Mfen.jia的分离：
称取发酵第24天的新鲜酒醅10g溶于100mL水中，通过10倍倍比稀释法分离红曲霉。分别取样品液100ul涂布于麦芽汁培养基的平板上，28℃倒置培养72h，选择菌落特征明显的单菌落在麦芽汁培养基上进一步划线纯化培养2-3次，4℃保存，备用；经过了两批次的分离纯化实验，获得耐酸、耐酒精烟色红曲（Monascus fuliginosus）Mfen.jia；于2017.8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14154，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述烟色红曲霉Mfen.Jia在麦芽汁琼脂培养基（所述麦芽汁培养基为：新鲜麦芽汁（糖度为22°Bx）中添加3%乳酸，0.1MPa，121℃蒸馏20min）上，菌落呈圆形，生长初期表面白色菌丝，后期形成同心轮及气生菌丝,整个菌落致密为绒毡，生长后期菌落表面呈烟灰色，生长后期菌落正面呈烟色，背面呈黑红褐色，用手摸菌落有油腻感。在PDA培养基（所述PDA培养基：马铃薯 200份， 葡萄糖 20份，蒸馏水100份、121℃.0.1MPa灭菌20min）上呈疮疤状（图11），有浓郁的复合酯香香气。菌丝发达, 具横隔多核, 有初生次生小梗，分生孢子呈杆状，具有大量子囊果（图12）。初步鉴定为烟色红曲霉。
通过对烟色红曲霉Mfen.jia的ITS1-5.8s rDNA-ITS2序列进行测序，与GenBankDNA 序列库同源性序列比对发现，烟色红曲霉与烟色红曲霉（Monascus fuliginosus）序列相似性为相似性为100%（表8）。
表8：烟色红曲霉Mfen.jia ITS1-5.8s rDNA-ITS2同源性序列比对结果
| Description | Max score | Totalscore | Querycover | E value | Ident | Accession |
| Monascusfuliginosus 18SribosomalRNA gene,partialsequence;internaltranscribed spacer1, 5.8SribosomalRNA gene,andinternaltranscribed spacer2,completesequence;and 28SribosomalRNA gene,partialsequence | 935 | 935 | 100% | 0.0 | 100% | JF776162.1 |
| Monascuskaolianggenes forITS1,5.8SrRNA,ITS2, 28SrRNA,partialandcompletesequence,strain:ATCC46598 | 924 | 924 | 100% | 0.0 | 99% | AB477252.1 |
| MonascusfuliginosusisolateN1 18SribosomalRNAgene,internaltranscribed spacer1, 5.8SribosomalRNA gene,internaltranscribed spacer2, and28SribosomalRNA gene,completesequence | 926 | 926 | 99% | 0.0 | 100% | FJ974048.1 |
| MonascusfuliginosusisolateN2 18SribosomalRNAgene,internaltranscribed spacer1, 5.8SribosomalRNA gene,internaltranscribed spacer2, and28SribosomalRNA gene,completesequence） | 926 | 926 | 99% | 0.0 | 100% | FJ974049.1 |
从ITS1-5.8s rDNA-ITS2序列的系统进化树显示（见图13）, 烟色红曲霉Mfen.jia与烟色红曲霉（Monascus fuliginosus）的遗传进化距离最近，表明亲缘关系最近。
综合菌落菌体特性和分子生物学鉴定，确定烟色红曲霉Mfen.jia为烟色红曲霉（Monascus fuliginosus），命名为烟色红曲霉Mfen.jia。
例4：耐高温并产蛋白酶、淀粉酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Bfen.JIA的分离：
采集10g汾酒新鲜酒醅于牛肉膏液体培养基（牛肉膏5份，蛋白胨10份，酵母膏5份，NaCl 5份，可溶性淀粉5份，蒸馏水1000份，琼脂18份，pH7.2，121℃蒸馏20min）中，于37℃，45℃、50℃温度条件下梯度培养样品2h后，将发酵液 10倍倍比稀释，分别取100uL涂布于平板上，45℃、50℃、55℃分别培养，筛选出1株耐50℃的细菌。所得到的菌株通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、16s rDNA区域基因测序以及蛋白酶及淀粉酶活性的检测，获得耐高温产蛋白酶和淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Bfen.jia。于2017.8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14584，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述枯草芽孢杆菌Bfen.jia在牛肉膏培养基上：菌落中央无色透明，周边呈白色，粘稠，菌体呈杆状，革兰氏阳性,有芽孢，芽孢不鼓起（图14）。理化性质见表9。
表9：枯草芽孢杆菌Bfen.jia的理化特性
| 特性 | Bfen.jia |
| 接触酶 | ＋ |
| 需氧性 | ＋ |
| pH 4.0-8.5 | ＋ |
| pH 9.0 | ＋ |
| 5℃ | － |
| 20-45℃ | ＋ |
| 50℃ | ＋ |
| 5%NaCl | ＋ |
| 7%NaCl | － |
| 0.001%溶菌酶 | － |
| V．P | ＋ |
| 淀粉水解 | ＋ |
| M．R | － |
| 柠檬酸盐生长 | － |
| 石蕊牛奶 | ＋ （产酸、胨化） |
注：“ － ”表示阴性；“ + ”表示阳性
所述枯草芽孢杆菌Bfen.jia具有淀粉水解能力（图15）和酪素水解能力（图16），表明枯草芽孢杆菌Bfen.jia具有产淀粉酶和蛋白酶能力。
通过对枯草芽孢杆菌Bfen.jia的16s rDNA基因区域进行测序，与GenBank DNA 序列库同源性序列比对发现，枯草芽孢杆菌Bfen.jia与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），序列相似性为相似性为99%（表10）。
表10：枯草芽孢杆菌Bfen.jia16s rDNA基因区域同源性序列比对结果
从16S rDNA序列的系统进化树显示（见图17）,枯草芽孢杆菌Bfen.jia的遗传进化距离与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）最近，表明亲缘关系最近。
综合菌落菌体特性和分子生物学鉴定，确定枯草芽孢杆菌Bfen.jia为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌Bfen.jia。
例5：高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、米根霉Mfen.2生产用麸曲、烟色红曲霉Mfen.jia米曲和枯草芽孢杆菌Bfen.jia菌液的制备：
1.高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母的制备：将斜面培养的酿酒酵母Yfen.2，接种于酵母膏液体培养基，28℃培养24h-48h；以3%的量分别接种于发酵糖液中，28℃恒温培养7-30d；
所述酵母膏培养基为：葡萄糖2份、胰蛋白胨2份、酵母提取物1份、蒸馏水100份、pH5.0-5.5，0.1MPa，121℃灭菌20min；所述发酵糖液为：蒸馏水稀释含糖量为67.88%的糖浆至起始糖度为22°Bx，0.1MPa，121℃蒸馏20min。
2.米根霉Mfen.2生产用麸曲的制备：取淀粉含量≥11%的麸皮50份，水分添加量为50份，含孢子数为107～108/ ml米根霉Mfen.2 溶液10份，40 ℃培养84 h，糖化力达到700U/g～818 U/g，液化力0.7 U/g～1.1 U/g即可；
3.耐酸、耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia生产用米曲的制备：用0.5% V/V乳酸水对原料大米进行浸泡8h-10h，控干，白纱布包起，用灭菌锅于0.1MPa下，处理20min，打撒米，再小喷壶加水10-20ml，0.1MPa，121℃再处理20min，达到湿而不粘。将10份 0.5% V/V 的无菌乳酸水倒入红曲霉斜面试管中，用接种环或接种钩处理，制备成含有孢子数为107～108/ ml的菌悬液接种于100份的大米培养基中，35℃-42 ℃培养5-7d，培养基发红，培养完毕。
4.耐高温并产蛋白酶、淀粉酶枯草芽孢杆菌Xfen.jia生产用菌液的制备：将斜面培将斜面培养的酿酒酵母Yfen.2，接种于牛肉膏培养液， 37℃-45℃培养24h-48h；以3%的量分别接种于牛肉膏培养液中， 37℃-45℃恒温培养48h。
例6：利用上述高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、米根霉Mfen.2生产用麸曲和耐酸、耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia生产用米曲、耐高温并产蛋白酶和淀粉酶的枯草芽孢杆菌Bfen.jia生产用菌液具体酿造清香型白酒的方法为：
（1）主粮处理：高粱作为发酵用主粮，将高粱进行常规润糁、蒸糁，蒸熟并冷却的红糁含水量为58%-65%；
（2）接种曲种：以红糁重量为计算基准，添加1%-2%的高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、5%-7%的米根霉Mfen.2生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲，混匀；
（3）大楂发酵：起始温度为22℃-25℃，培养1天，然后每天升温1℃，至30℃后，恒温发酵5-7天，然后逐天降温1℃至27℃，恒温发酵至28天，甑桶蒸馏酒醅，蒸馏温度95℃-105℃、蒸汽压力0.1-0.2Mpa、流酒温度28℃-32℃，获得白酒，做普通基酒用；
（4）堆积发酵：蒸馏后的酒醅降温至室温，以红糁重量为计算基准，再添加0.5%-1%的耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia生产用米曲和1%-2%耐高温并产蛋白酶和淀粉酶的枯草芽孢杆菌Bfen.jia菌液，混匀堆积发酵24h，温度保持在35℃-42℃。
（5）入缸再发酵（二楂）：以红糁重量为计算基准，向堆积发酵好的醅中，再添加1%-2%的高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、5%-7%的米根霉Mfen.2生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲，混匀发酵，发酵起始温度为22℃-25℃，培养1天，然后每天升温1℃，至30℃后，恒温发酵5-7天，然后逐天降温1℃至27℃，恒温发酵至40天-55天，甑桶蒸馏酒醅，蒸馏温度95℃-105℃、蒸汽压力0.1-0.2Mpa、流酒温度28℃-32℃，获得高乙酸乙酯、低乳酸乙酯的白酒。
所获得的白酒原酒陶坛贮存1年以上即可使用。
获得的高乙酸乙酯调香高酯白酒的检测：理化指标及主要风味物质检测结果见表10，结合检测结果可知：
（1）本发明采用多菌种强化发酵生产的清香型二楂白酒乙酯含量高，经检测，酒精度为61%的高酯白酒乙酸乙酯含量为10.88g/L、总酯含量为11.22 g/L，乙酸乙酯含量占到了总酯类含量的96.97%，乙酸乙酯比传统清香型白酒中乙酸乙酯含量提高了约252%，总酯含量提高了105%，乙酸乙酯/乳酸乙酯提高至14.70，乙酸乙酯香味浓郁。该白酒可作为高酯白酒用于乙酸乙酯偏低、乳酸乙酯偏高，乙酸乙酯/乳酸乙酯比例不协调、总酸含量低的基酒的勾调。尤其适合于用来勾调夏季乙酸乙酯偏低或乳酸乙酯偏高基酒。该酒对香气淡、酸低、冲、辣的白酒，能起到缓冲的作用。
（2）利用该工艺生产的二楂白酒乳酸乙酯含量低：酒精度为61%的高酯白酒乳酸乙酯含量约0.74 g/L，比同期发酵的传统清香型大曲白酒中乳酸酸乙酯含量低了约2.5g/l，可用于乳酸乙酯含量高的基酒的勾兑。
（3）利用该工艺生产的高酯白酒总酸含量高，比传统清香型大曲白酒中总酸高了约2倍，可用于总酸低的基酒勾兑。可用于总酸低的基酒勾兑。该工艺生产白酒主要的酸性物质是乙酸，可以给白酒带来酸爽感。
（4）利用该工艺生产的白酒原料出酒率为48%，比传统清香型大曲白酒出酒率提高了约4%。
（5）菌种强化发酵白酒感官品评结果：品酒师对该调节酒进行感官品评，认为该菌种强化发酵白酒大楂酒清香、醇厚；二楂酒（高酯白酒）具有清香，糟香，酯香明显，带酱感，落口酸爽，醇厚，绵柔的特点。
（6）利用该发酵工艺，保持白酒清香风格，降低了清香型大曲白酒的用曲量，降低了由大曲接种带入的乳酸菌的数量，预防了由于夏季温度高，乳酸菌大量繁殖，导致出酒率低，生产提前“掉排”现象的发生。
（7）本发明采用多菌种加大曲生产清香型白酒，比传统的清香型大曲白酒出酒率高，大曲用量降低5%，降低了酿酒成本。
（8）利用从杏花村汾酒生产环境分离出来的土著酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Yfen.2、米根霉（Rhizopus oryzae strain） Mfen.2、土著烟色红曲霉（Monascus fuliginosus ）Mfen.jia、土著枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）Bfen.jia强化发酵生产清香型白酒，不具有破坏传统清香型白酒发酵环境中经长期驯化而建立起来的微生物菌群结构，改变清香型白酒风格的风险。
（9）利用该工艺发酵二楂酒醅总酸度（2.7 -2.8度）比传统清香型白酒工艺发酵的二楂酒醅总酸度（3.0-4.0度）略低，但挥发性乙酸含量相差较大（表7），非挥发性乳酸含量相对低，表明利用该工艺可以有效抑制乳酸菌对固态酒二楂发酵的影响。
表11：菌种强化发酵白酒理化指标及主要风味物质
Claims (4)
1.一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，其特征在于：利用汾酒新鲜酒醅分离筛选出高产酯酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）、产淀粉酶的米根霉 （Rhizopus oryz ae ）、耐酸耐酒精的烟色红曲霉（ Monascus fuliginosus ）和耐高温且具蛋 白酶淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ），制备成酿酒酵母生产用酒母、米根霉生产用麸曲、烟色红曲霉生产用米曲、枯草芽孢杆菌生产用菌液，然后以糁料重量为计算基准，接种1%-2%的酿酒酵母生产用酒母、5%-7%米根霉生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲进行大楂发酵，接种0.5%-1%的烟色红曲霉生产用米曲、1%-2%的枯草芽孢杆菌生产用菌液进行堆积发酵，然后向堆积发酵好的酒醅中再接种1%-2%的酿酒酵母生产用酒母、5%-7%米根 霉生产用麸曲、3%-5%的生产用大曲进行入缸二楂发酵；
所述酿酒酵母生产用酒母的制备方法为：
（1）高产酯酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）的分离培养：采集汾酒新鲜酒醅10g溶解于无菌生理盐水中，制备成原液；通过 10倍倍比稀释法稀释原液，取倍比稀释液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28 ℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在酵母膏培养基上进一步划线纯化培养2-3 次，纯化后转入酵母膏固体斜面培养基，4℃保存，备用；所得到的酵母菌通过发酵培养检测 香气，菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26s rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、 产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯高耐受性土著酿酒酵母Yfen.2；
(2)酿酒酵母生产用酒母的制备：将斜面培养的酿酒酵母Yfen.2接种于酵母膏液体培养基，28℃，200r/min摇 床培养24h-48h,培养至含菌量≥2.0×108CFU/ml，以发酵糖液的体积为计算基准，接种量 为3% V/V接种于发酵糖液中，28℃,200r/min，培养24h-48h，培养至发酵液中菌体含量≥ 2.0×108CFU/ml后,28℃,再静止培养5-28d即可；
所述米根霉生产用麸曲的制备方法为：（1）土著米根霉（ Rhizopus oryzae ）的分离：采 集汾酒新鲜酒醅10g溶解于无菌生理盐水中，制备成原液；通过10倍倍比稀释法稀释原液， 取倍比稀释液各100ul涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h-72h，选择 菌落特征明显的单菌落在PDA培养基上进一步划线纯化培养2-3次，纯化后转入PDA固体培 养基，4℃保存，备用；所得到的米根霉通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、ITS15.8SrDNA-ITS2 基因区域检测鉴定，以及淀粉酶活力和淀粉酶环境耐受性检测，获得具有 环境耐受性且产淀粉酶的土著米根霉Mfen.2；（2）米根霉生产用麸曲的制备：取淀粉含量≥ 11%的麸皮50份，水50份，接种入含孢子数为107～108/ ml米根霉Mfen.2 溶液10份，40℃培 养84h，糖化力达到700 U/g～818 U/g，液化力0.7 U/g～1.1 U/g即可；
所述烟色红曲霉生产用米曲的制备方法为：（1）耐酸、耐酒精烟色红曲霉（ Monascusfuliginosus ）Mfen.jia的分离：采集发酵24天的汾酒新鲜酒醅10g溶于100ml水中，制备成原液；通过10倍倍比稀释法稀释原液，取倍比稀释液100ul涂布于麦芽汁培养基的平板上，28℃倒置培养72h，选择菌落特征明显的单菌落在麦芽汁培养基上进一步划线纯化培养2-3次，4℃保存，所得到红曲霉接种于麦芽汁培养基或PDA培养基，35℃培养5-7d，通过菌落特征及菌体形态观察、镜检、理化特征检测、18s rDNA基因区域测序鉴定，获得耐酸、耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia；(2)烟色红曲霉生产用米曲的制备：用10份体积浓度为0.5%的无菌乳酸水冲洗红曲霉斜面试管，制备成含有孢子数为107～108/ ml的菌悬液，将菌悬液接种于100份的大米培养基中，35-42 ℃培养5-7d，培养基颜色发红即可；
所述枯草芽孢杆菌生产用菌液的制备方法为：(1)耐高温并产蛋白酶、淀粉酶枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）Bfen.JIA的分离：采集10g汾酒新鲜酒醅于牛肉膏液体培养基中，于37℃，45℃、50℃温度梯度条件下分别培养2h，通过10倍倍比稀释法稀释培养液，取倍比稀释液各100ul涂布于牛肉膏固体平板上，45℃、50℃、55℃分别培养，获得耐50℃的细菌，菌株通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、16s rDNA基因区域检测鉴定以蛋白酶活性及淀粉酶活性的检测，获得耐高温且具有蛋白酶和淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌Bfen.jia；（2）耐高温并产蛋白酶、淀粉酶枯草芽孢杆菌Bfen.jia生产用菌液的制备：将斜面培养的酿酒酵母Yfen.2，接种于牛肉膏培养液，37℃-45℃培养24h-48h；以牛肉膏培养液体积为计算基准，接种量为3% V/V接种于牛肉膏培养液中，37℃-45℃恒温培养48h即可。
2.根据权利要求1所述的一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，其特征在于：具体酿造清香型白酒的方法为：
（1）主粮处理：高粱作为发酵用主粮，将高粱进行常规润糁、蒸糁，冷却后红糁含水量为58%-65%；
（2）接种曲种：以红糁重量为计算基准，添加1%-2% V/m的高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、5%-7% m/m的米根霉Mfen.2生产用麸曲、3%-5% m/m的生产用大曲，混匀；
（3）大楂发酵：起始温度为22℃-25℃，培养1天，然后每天升温1℃，至30℃后，恒温发酵5-7天，然后逐天降温1℃至27℃，恒温发酵至28天，甑桶蒸馏酒醅，蒸馏温度95℃-105℃、蒸汽压力0.1-0.2Mpa、流酒温度28℃-32℃，获得白酒，做普通基酒用；
（4）堆积发酵：蒸馏后的酒醅降温至室温，以红糁重量为计算基准，添加0.5%-1% m/m的耐酒精烟色红曲霉Mfen.jia生产用米曲和1%-2% V/m耐高温并产蛋白酶和淀粉酶的枯草芽孢杆菌Bfen.jia菌液，混匀后35-42℃堆积发酵24h；
（5）入缸二楂发酵：以红糁重量为计算基准，向堆积发酵好的醅中，再添加1%-2% V/m的高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2生产用酒母、5%-7% m/m的米根霉Mfen.2生产用麸曲、3%5%m/m的生产用大曲，混匀发酵，发酵起始温度为22℃-25℃，培养1天，然后每天升温1℃， 至30℃后，恒温发酵5-7天，然后逐天降温1℃至27℃，恒温发酵至40天-55天，甑桶蒸馏酒 醅，蒸馏温度95℃-105℃、蒸汽压力0.1-0.2Mpa、流酒温度28℃-32℃，获得清香型白酒。
3.根据权利要求1所述的一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，其特征在于：所述酵母膏培养基为：葡萄糖2份、胰蛋白胨2份、酵母提取物1份、蒸馏水100份、pH5.0-5.5，121℃、0.1MPa灭菌20min；所述发酵糖液为：蒸馏水稀释含糖量为67.88%的糖浆至起始糖度为22°Bx，121℃灭菌20min；所述PDA培养基为常规PDA培养基，所述麦芽汁培养基为：糖度为22°Bx的新鲜麦芽汁中添加乳酸至乳酸浓度为3% V/V，121℃灭菌20min；大米培养基的制备：用体积浓度为0.5%乳酸水浸泡大米8h-10h，控干，纱布包裹，0.1MPa，121℃灭菌20min，打撒米，加水10-20ml，0.1MPa，121℃灭菌20min，大米湿而不粘即可；所述牛肉膏培养基为：牛肉膏5份，蛋白胨10份，酵母膏5份，NaCl 5份，可溶性淀粉5份，蒸馏水1000份，琼脂18份，pH 7.2，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法，其特征在于：所述高产酯高耐受性酿酒酵母Yfen.2在酵母膏培养基上：菌落为乳白色，表面光滑，中间厚，边缘薄，呈奶酪状，边缘与中央颜色一致，边缘整齐；菌体为椭圆形，单向产生子细胞，不产生假菌丝，菌体培养2-7天，产生果香； 所述米根霉Mfen.2在PDA培养基上：菌落圆形，边缘整齐，致密绒毛状；菌丝发达，生长 快，初疏松、白色，匍匐菌丝透明发达，后稠密，颜色变为灰色；菌丝无隔，菌体产黑色孢子 囊，孢子较小，呈椭圆形或圆形，颜色为黑色；孢囊梗由生假根处的匍匐菌丝长出，多数成丛 生、少数单生，囊轴呈圆形，无囊基、囊领，菌丝体无横隔； 所述烟色红曲霉Mfen.Jia在PDA培养基或麦芽汁培养基上：菌丝发达,具横隔多核,有 初生次生小梗，分生孢子呈杆状，具有大量闭囊壳，菌落呈圆形，生长初期表面白色菌丝，生 长后期在麦芽汁琼脂培养基上老熟后菌落表面呈烟灰色,易粘，菌落背面呈黑红褐色；在 PDA培养基上呈疮疤状，有浓郁的复合酯香香气； 所述枯草芽孢杆菌Bfen.jia在牛肉膏培养基上：菌落中央无色透明，周边呈白色，粘 稠，菌体呈杆状，革兰氏阳性，产芽孢，芽孢不鼓起。
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