CN113773977A

CN113773977A - 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用

Info

Publication number: CN113773977A
Application number: CN202111206144.9A
Authority: CN
Inventors: 周艳; 周绍琴; 周清丽; 陈兰
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2021-10-16
Filing date: 2021-10-16
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-10-16
Also published as: CN113773977B

Abstract

本发明提供了一种低产乙醇高产香的酵母菌株，命名为Saccharomyces cerevisiae GMUm‑1，保藏编号为CCTCC NO：M 2021763，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，还提供了应用，用于生产低醇猕猴桃果酒。本发明的低产乙醇高产香的酵母菌株既能低产乙醇又能高产香气物质的酵母菌种，并提供其在猕猴桃果酒中的应用，该酵母具有易于培养和生产，在猕猴桃果浆发酵中低产酒精，增加果酒的香气成分。

Description

一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用

技术领域

本发明属于酵母菌技术领域，具体涉及一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用。

背景技术

猕猴桃，又称奇异果，是一种浆果类水果，其营养素含量丰富，有极高的商用及食用价值。20世纪，世界范围的猕猴桃产业兴起，2006-2014年间，猕猴桃的种植面积急速增长，在最近30年来世界奇异果产业呈现持续增长状态。目前，全球的猕猴桃种植面积已经超过26万公顷，中国是种植猕猴桃主要国家之一，我们的种植面积已经超过世界猕猴桃种植面积的二分之一，截至2020年，我国猕猴桃种植面积达到436万亩，总产量达300万吨，种植面积位居世界第一。

猕猴桃果酒作为一种新兴果酒饮品，因其富含抗氧化活性物质、有机酸等多种营养物质而受消费者的喜爱。但随着生活水平及健康意识的不断提高，人们越来越关注酒精对健康造成的危害。低醇猕猴桃果酒因其酒精度≤7vol％，满足了国家相关部门对低度酒取代高度酒，果酒取代粮食酒的健康饮酒的呼吁。低醇果酒也保留了水果里原有的养分和保健功效，富含多种维生素、微量元素以及人体必需的氨基酸和有机酸。它没有过于刺激的酒精味，感官体验和对保健作用都有良好的效果。和其他酒类相比，低醇果酒的营养价值更高，适用人群范围也更广。由于低醇果酒的酒精度数低，对于水果的糖度要求不高，所以可以用于低醇果酒加工的水果种类也更多。低醇果酒的发展可以给一些原味不易被人们接受的水果提供新的市场，增加了这些水果的价值，扩大这些水果的产业链，以利于更加有效的利用自然资源，增加收益。猕猴桃低醇果酒作为一种低度保健酒，无论在国内还是在国际上，均具有广阔的市场前景和巨大的开发空间。

目前，生产猕猴桃果酒的菌种多为产酒精能力强的酿酒酵母菌，对于低产醇酵母菌的研究处于空白；另一方面，低醇果酒酒的生产方法目前主要是利用膜过滤或蒸馏对葡萄酒进行脱醇处理，这些技术不仅成本较高，而且会影响终产品的风味品质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用，该酵母菌株具有易于培养和生产，在猕猴桃果浆发酵中低产酒精，增加果酒的香气成分。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种低产乙醇高产香的酵母菌株，所述低产乙醇高产香酵母菌株命名为Saccharomyces cerevisiae GMUm-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2021763，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年6月24日。

优选地，所述低产乙醇高产香酵母菌株的26S rDNA ITS1/ITS4区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种上述的低产乙醇高产香的酵母菌株的应用，所述低产乙醇高产香的酵母菌株用于生产低醇猕猴桃果酒。

优选地，所述低醇猕猴桃果酒中酒精度为2.9％(V/V)。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明中的低产乙醇高产香的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株既能低产乙醇又能高产香气物质的酵母菌种，并提供其在猕猴桃果酒中的应用，该酵母具有易于培养和生产，在猕猴桃果浆发酵中低产酒精，增加果酒的香气成分，本发明应用价值高，具有极高的社会和经济效益。

2、利用本发明的低产乙醇高产香的酵母菌株生产低醇猕猴桃果酒有以下优势：

1)该菌株产酒精度远低于商业酵母，酒精度为2.9％(V/V)；

2)跟商品化的菌相比，芳香物质种类多，含量丰富，芳香成分以乙酸乙酯为主；

3)生产的果酒低级杂醇含量少。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例1种含有0.5％红四氮唑溶液的PDA培养基上生长不同颜色的菌落(A类菌表白色或浅色菌落；B类菌表示深红色菌落)。

图2是本发明实施例1的Saccharomyces cerevisiae GMUm-1的菌落形态。

图3是本发明实施例1的Saccharomyces cerevisiae GMUm-1的菌体形态。

图4表示本发明实施例1的Saccharomyces cerevisiae GMUm-1在NCBI上blast比对的结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例的低产乙醇高产香的酵母菌株，所述低产乙醇高产香酵母菌株命名为Saccharomyces cerevisiae GMUm-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2021763，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年6月24日；

所述低产乙醇高产香酵母菌株的26S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本实施例从以贵州修文猕猴桃作为发酵原料自然酿制猕猴桃果酒中分离筛选得到低产乙醇高产香的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae GMUm-1，具体的筛选步骤为：

S1、初筛：将猕猴桃剥皮打浆装罐，得到猕猴桃浆料，加入果胶酶，在温度为35℃的条件下酶解4h，用白砂糖调整糖度至22°Brix，然后在温度为28℃的恒温箱中自然发酵，分别取发酵0天、3天、6天、9天的样品(依次命名为样品a、样品b、样品c和样品d)分别用蒸馏水稀释后制成菌悬液(分别命名为菌悬液a、菌悬液b、菌悬液c和菌悬液d)，分别涂布于含有0.5％红四氮唑溶液的PDA培养基中，置于28℃恒温箱恒温培养48h，待菌落长出后，挑取白色或淡红色单菌落(图1种A类菌为白色或淡红色单菌落，B类菌为深红色菌落)进行反复纯化，并接种于YPD斜面培养基保种备用，得到初筛获的酵母菌株；所述菌悬液a中样品a的质量分数为1％、所述菌悬液b中样品b的质量分数为1％、所述菌悬液c中样品c的质量分数为1％、所述菌悬液d中样品d的质量分数为1％；

所述猕猴桃浆料和果胶酶的质量比为1000：1；

所述含有0.5％红四氮唑溶液的PDA培养基由以下质量分数的原料组成：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、0.5％红四氮唑溶液1％，余量为蒸馏水；

所述YPD斜面培养基由以下质量分数的原料组成：酵母浸粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂2％，余量为蒸馏水；

S2、将S1种得到的初筛获的酵母菌株进行产酒精能力试验、产香性能评价及发酵应用试验，获得一株低醇增香酵母；

S201、所述产酒精能力试验的具体过程为：

采用贵长猕猴桃为原料，去皮，打浆，得到猕猴桃浆料，加入果胶酶，分装于发酵罐中，用保鲜膜密封好，放于35℃水浴锅中酶解4h，调整糖度至22°Brix，接入S1中得到的初筛获的酵母菌株，于28℃恒温发酵下培养5天后，选择酒精度低于7％(V/V)、香气浓郁的菌株；

S202、所述产香性能评价的具体过程为：

采用贵长猕猴桃为原料，去皮，打浆，得到猕猴桃浆料，加入果胶酶，分装于发酵罐中，用保鲜膜密封好，放于35℃水浴锅中酶解4h，调整糖度至22°Brix，接入S1中得到的初筛获的酵母菌株，于28℃恒温发酵下培养5天后，采用嗅闻的方法对其进行感官评价。评定小组由10人组成，其中男性4人，女性6人，年龄在18-40岁之间，分别对酵母菌产香性能进行独立感官评定。评定前须提前1h将猕猴桃发酵液从冰箱取出，将发酵液进行随机3位数编码，封好保鲜膜后在25～30℃下恒温保存；评定不同样品时需要间隔10min，以避免感官疲劳影响结果。样品在改变随机编号后至少进行3次重复，全部结束后，得到最终评分，从而获得感官最佳的酵母菌株；

S203、所述发酵应用试验的具体过程为：

采用贵长猕猴桃为原料，去皮，打浆，得到猕猴桃浆料，加入果胶酶，分装于发酵罐中，用保鲜膜密封好，放于35℃水浴锅中酶解4h，调整糖度至22°Brix，接入S1中得到的初筛获的酵母菌株，于28℃恒温发酵下培养5天后，取样离心即得到待测样品，采用GC-MS测定待测样品香气物质，并进行感官品评；

S3、通过菌落及菌体形态观察及26S rDNA ITS1/ITS4区域序列鉴定体系鉴定该菌种，该菌种的26S rDNA ITS1/ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

S301、形态学观察：

菌落形态：低醇增香酵母菌种在YPD培养基上生长48小时后，观察其菌落为圆形、菌落直径为4-5mm、乳白色或淡红色、中间突起、有光泽，边缘整齐，菌体粘稠，易挑起(图2)；

菌体形态：挑取经过48小时固体YPD培养基上生长的菌落进行涂片、美兰染色、镜检(图3)；

S302、26S rDNA ITS1/ITS4区域序列分析方法和结果：

S30201、酵母菌基因组DNA的提取：

挑选单菌落，加入100μL 0.2M LioAC和1％SDS的混合溶液，混匀，70℃下培育15min，加入30μL 96％的乙醇溶液，经14000rp，5min处理后，弃上清液，置于烘干箱中，70℃开盖烘干乙醇，烘干后加入30μL的EB溶液，重悬后得到模板酵母菌基因组DNA；

S30202、将S30201得到的模板酵母菌基因组DNA放入基因扩增仪，按照以下序列进行处理：加入Mix 12.5μL在95℃下处理5min；加入引物ITS1F1 μl，94℃处理30s；加入1μL引物ITS4，30℃处理30s；加入4μL模板酵母菌基因组DNA，72℃处理1min；加入6.5μL ddH₂O，72℃处理8min；得到PCR产物；

所述引物ITS1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

得到的PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，送上海生物工程技术服务有限公司进行测序，所述26SrDNA ITS1/ITS4区域序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；根据测序结果，在NCBI上进行BLAST比对,结果如图4所示,根据目前酵母菌分子系统学研究领域的观点：即具有相同或相似ITS序列(序列同源性≥99％)的菌株属于同一物种，根据序列分析结果确定与基因库参考菌株的序列同源性≥99％的菌株为酿酒酵母，命名为Saccharomycescerevisiae GMUm-1。

实施例2

本实施例提供了实施例1所述低产乙醇高产香的酵母菌株的应用，所述低产乙醇高产香的酵母菌株用于生产低醇猕猴桃果酒；所述低醇猕猴桃果酒中酒精度为2.9％(V/V)。

具体的酵母菌株用于生产低醇猕猴桃果酒的方法为：

S1、低醇增香酵母活化扩培：将实施例1中的Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株接种于pH值为6.0的种子液液体培养基，28℃，扩培时间24h，然后转接于酶解的猕猴桃果浆中，28℃，摇床150r/min，扩培时间24h，得到酵母扩培液；所述种子液液体培养基由以下质量分数的原料经121℃灭菌20min而成：酵母浸粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％，余量为蒸馏水；

S2、在250mL发酵罐里装110mL酶解的猕猴桃果浆；酶解的猕猴桃果浆的理化指标为：糖度22°Brix，pH 4.80，添加总SO₂约60mg/L；

S3、将S1种得到的酵母扩培液加入至S2中的所述酶解的猕猴桃果浆中，按照果酒的标准工艺进行生产，发酵至酵母终浓度达到1×10⁸cfu/mL时止，发酵结束后取澄清的猕猴桃果酒酒样；所述酵母扩培液和酶解的猕猴桃果浆的用量比为1mL：50g；发酵的条件为：密封，28℃恒温发酵；并以工业化普遍应用的商业酿酒酵母安琪酵母(商业酵母RW1)作为对照对S2中的所述酶解的猕猴桃果浆进行发酵；

S4、采用SPEM-GC-MS(固相微萃取-气相-质谱联用法)对S3中得到的猕猴桃果酒酒样的香气物质组分及其含量进行检测，并组织具有国家级品酒师资质的感官人员对其进行感官品评，结果如表1-3所示。

表1两种酵母菌株生产猕猴桃果酒的理化指标

酒样编号	糖度(°Brix)	酒精度(％)	总酸mmol/100mL
				GMUm-1	13.8	2.9	16.53
商业酵母RW1	8.3	8.3	28.67

表2两种酵母菌株生产猕猴桃果酒部分风味成分

注：表中“-”表示未检测出。

表3两种酵母菌株生产低醇猕猴桃果酒的感官品评

感官品评	商业酵母RW1	GMUm-1
			外观	84	86
香气	82	88
			口感	75	81

由表1-3可知，Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株产酒精度远低于商业酵母，酒精度为2.9％(V/V)；Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株跟商品化的菌相比，芳香物质种类多，含量丰富，芳香成分以乙酸乙酯为主；Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株生产的果酒低级杂醇含量少。因此本发明菌株既能低产乙醇又能高产香气物质，本发明应用价值高，具有极高的社会和经济效益。

本实施例中的低产乙醇高产香的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株在恒温环境下发酵猕猴桃果浆，使其香气物质及酒精度达到一定数值后，利用微孔过滤除去发酵菌种从而终止发酵。发酵过程中不需要添加任物质，对猕猴桃果浆的感官及主要质量的不利影响较小。

本实施例中的低产乙醇高产香的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae GMUm-1菌株适用于低醇果酒酿造特别是低醇猕猴桃果酒酿造的优良酵母菌种，取代自然酿造，达到人工控酵，从而提升产品稳定性及风味品质。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 贵州医科大学

<120> 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用

<130> 2021.9.10

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

aaaaaaattt aataattttg aaatggattt ttttgttttg gcaagagcat gagagctttt 60

actgggcaag aagacaagag atggagagtc cagccgggcc tgcgcttaag tgcgcggtct 120

tgctaggctt gtaagtttct ttcttgctat tccaaacggt gagagatttc tgtgcttttg 180

ttataggaca attaaaaccg tttcaataca acacactgtg gagttttcat atctttgcaa 240

ctttttcttt gggcattcga gcaatcgggg cccagaggta acaaacacaa acaattttat 300

ctattcatta aatttttgtc aaaaacaaga attttcgtaa ctggaaattt taaaatatta 360

aaaactttca acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 420

tacgtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc 480

cttggtattc cagggggcat gcctgtttga gcgtcatttc cttctcaaac attctgtttg 540

gtagtgagtg atactctttg gagttaactt gaaattgctg gccttttcat tggatgtttt 600

ttttccaaag agaggtttct ctgcgtgctt gaggtataat gcaagtacgg tcgttttagg 660

ttttaccaac tgcggctaat ctttttttat actgagcgta ttggaacgtt atcgataaga 720

agagagcgtc taggcgaaca atgttcttaa agtttgacct caaatcaggt aggagtaccc 780

gctgaactta agcatatcat taagcggagg aaagcg 816

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

cttggtcatt tagaggaagt aa 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种低产乙醇高产香的酵母菌株，其特征在于，所述低产乙醇高产香酵母菌株命名为Saccharomyces cerevisiae GMUm-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2021763，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年6月24日。

2.根据权利要求1所述的一种低产乙醇高产香的酵母菌株，其特征在于，所述低产乙醇高产香酵母菌株的26S rDNAITS1/ITS4区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种如权利要求1或2所述的低产乙醇高产香的酵母菌株的应用，其特征在于，所述低产乙醇高产香的酵母菌株用于生产低醇猕猴桃果酒。

4.根据权利要求3所述的低产乙醇高产香的酵母菌株的应用，其特征在于，所述低醇猕猴桃果酒中酒精度为2.9％V/V。