CN105385615A - 一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建与应用 - Google Patents

一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在出发菌株中，完全敲除氨基酸转氨酶基因BAT2和酯水解酶基因IAH1，同时选用强启动子PGK1过表达醇乙酰基转移酶I基因ATF1，来获得该高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株。与亲本菌株相比，所构建的重组菌其它发酵性能不受影响，乙酸酯的总量显著提升，达到1303.6mg/L，其中乙酸乙酯的含量是出发菌株的52倍，乙酸异戊酯提高到73.7mg/L，主要高级醇含量为151.8mg/L，较出发菌株降低了61.4％。该酿酒酵母显著提高酯产量的同时降低高级醇产量，满足白酒相关领域对酵母的较高要求，应用前景广泛。

Description

一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建与应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。
背景技术：
白酒是中国特有的蒸馏酒，独特风味，备受喜爱。高级醇和酯类是白酒中非常重要的成分，和其它风味物质以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约，发挥各自的特点形成不同香型和不同风格的白酒。酯类物质种类较多，在白酒中大多以乙酯形式存在，具有水果样芳香和口味，是酒芳香的主要担体，使人产生喜悦感。白酒中大部分酯对酒的风味都有积极作用，提高酒中酯类物质的含量可以增进酒的风味，改善酒的品质。高级醇味道大多似酒精，持续的时间长，有后劲，含量的多少和各种醇之间的比例对白酒的风味有着重要的影响。适量的高级醇和协调的组分比可以赋予白酒特殊的香味，衬托出酯的香气，使酒的口感协调、柔和。倘若高级醇含量不足，酒味将变得稀薄单调，口感不饱满；反之，高级醇含量过高会使酒产生异杂味，影响酒的风味和品质。另外，高级醇在人体内的氧化速度比乙醇慢，停留时间较乙醇长，其对人体的毒害作用远远高于乙醇。因此，白酒中高级醇的含量必须控制在合适的范围内。
如何提高白酒中酯的含量和降低高级醇的含量，一直都是我国普通白酒企业和相关科研单位研究的重要课题。国内大部分研究都是通过优化发酵工艺、蒸馏工艺和勾兑技术使白酒中高级醇和酯的构成及量比关系达到最理想的状态，导致我国高档白酒存在耗粮高、生产周期长、效率低、成本高等问题。而构建高产酯低产高级醇酿酒酵母工程菌株，才可以从根本上解决酯含量较低而高级醇含量较高的问题，也是工业微生物育种的发展方向。
酿酒酵母在白酒发酵过程中生成酒精的同时，产生了一定量的高级醇以及少量的酯类。研究表明，ATF1基因编码的醇乙酰基转移酶是乙酸乙酯、乙酸异戊酯等乙酸酯类合成的关键酶，并存在于细胞膜上，该酶催化醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯。Lilly等人用工业菌株过表达ATF1，用葡萄汁发酵培养基进行发酵，葡萄酒中的乙酸乙酯浓度提高了3-10倍，乙酸异戊酯浓度提高了4-12倍。IAH1基因编码乙酸异戊酯水解酶，对清酒的研究发现，IAH1基因缺失的清酒酵母菌株所产乙酸异戊酯的浓度远高于野生清酒酵母菌株，乙酸异丁酯的产量较野生清酒酵母菌株也有增加。采用分子育种技术提高调控酯合成的酶活性，减弱或抑制调控酯分解的酶活性，是提高酯生成量有效的措施。在生成高级醇的氨基酸分解代谢途径中，由BAT2基因编码的氨基酸转氨酶的缺失可以阻断或减弱氨基酸转变成α-酮酸的量，进而可以减少缬氨酸生成异丁醇和亮氨酸生成异戊醇的量。采用分子育种技术减弱或抑制调控高级醇合成的酶活性，从而切断了或减弱了高级醇代谢途径，是降低高级醇生成量有效的措施。
在高级醇和酯的代谢途径中，醇类与酰基辅酶A可以缩合生成酯，而酵母产生的酯水解酶催化酯水解生成醇类。BAT2基因的缺失通过降低异丁醇、异戊醇等高级醇前体物的量降低高级醇的产量；而ATF1基因的过表达通过提高醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯的量，提高酯类含量的同时进一步的降低了高级醇的含量；IAH1基因的缺失通过降低相关乙酸酯的分解又进一步提高乙酸酯的含量。已有研究通过在啤酒酵母中敲除BAT2基因同时过表达ATF1基因，高级醇总量降低了27.3％，乙酸酯提高了6.96倍。
公布号为201110094875.9的中国发明专利通过在黄酒酵母中敲除IAH1基因同时过表达ATF1基因，乙酸乙酯产量提高了20.9倍，乙酸异戊酯和乙酸异丁酯也有提高，同时异戊醇降低了49％。在白酒和黄酒高产酯低产高级醇酵母菌株选育的相关研究中，尚没有同时调控高级醇代谢和酯代谢相关关键基因的报道。
因此，本发明通过完全敲除氨基酸转氨酶编码基因BAT2的和乙酸异戊酯水解酶编码基因IAH1，同时两次过表达醇乙酰基转移酶编码基因ATF1，选育高产酯低产高级醇酿酒酵母工业菌株，满足酿酒酵母应用相关领域对酵母的较高要求，为白酒行业带来显著的经济效益。
发明内容：
本发明解决的技术问题之一是提供一株高产酯低产高级醇酿酒酵母。
所述高产酯低产高级醇酿酒酵母是在出发酵母菌株中完全敲除编码氨基酸转氨酶的BAT2基因和编码乙酸异戊酯水解酶的IAH1基因，同时两次强启动子PGK1过表达编码醇乙酰基转移酶的ATF1基因所得。
所述BAT2基因其GeneID为：853613，核苷酸序列如序列表中SEQNO:1所示；
所述IAH1基因其GeneID为：854293，核苷酸序列如序列表中SEQNO:2所示；
所述ATF1基因其GeneID为：854559，核苷酸序列如序列表中SEQNO:3所示；
所述启动子PGK1其GeneID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示；
优选的，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。
本发明解决的另一个技术问题是提供一种高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)过表达ATF1基因的重组片段的构建
①用限制性内切酶HindIII，分别对质粒pPGK1和载体质粒pUC19进行酶切，切胶回收质粒pPGK1的酶切产物强启动子PGK1，连接强启动子PGK1和载体pUC19，构建质粒pUC-P；
②以出发酵母菌株基因组为模板，PCR扩增ATF1基因，用限制性内切酶XhoI对质粒pUC-P和ATF1基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PA；
③以质粒pUG6为模板，PCR扩增KanMX基因，用限制性内切酶KpnI对质粒pUC-PA和KanMX基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PAK；
(2)敲除BAT2基因同时过表达ATF1基因
①以质粒pUC-PAK为模板，PCR扩增获得含有BAT2上游同源臂、PGK1强启动子、ATF1基因、KanMX基因和BAT2下游同源臂的基因片段(BAT2上游同源臂-PGKp-ATF1-PGKt-KanMX-BAT2下游同源臂)；
②制备出发酿酒酵母菌株CICC32315的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的a型和α型单倍体分别作为出发菌株，以下步骤操作以a型为例；
③将步骤(2)-①得到的PCR产物导入出发酵母菌株a型单倍体中，获得BAT2基因的敲除同时ATF1的过表达的重组菌株1；
④用pGAP质粒去除步骤(2)-③获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株2-1，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株2；
(3)IAH1基因的敲除同时过表达ATF1基因
①以质粒pUC-PAK为模板，PCR扩增获得含有IAH1上游同源臂、PGK1强启动子、ATF1基因、KanMX基因和IAH1下游同源臂的基因片段(IAH1上游同源臂-PGKp-ATF1-PGKt-KanMX-IAH1下游同源臂)；
②将步骤(3)-①得到的PCR产物导入不含pGAP质粒的重组菌株2中，获得BAT2基因敲除，IAH1基因敲除，同时ATF1两次过表达的重组菌株3；
③用pGAP质粒去除步骤(3)-②获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因，IAH1敲除、BAT2敲除同时ATF1两次过表达的重组菌株4-1，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株4；
④以a型单倍体作出发菌株重复上述步骤，将a型和α型单倍体分别作为出发菌株得到的重组菌株4进行融合，得到双倍体重组菌株5，即本发明所述的高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株。
所述重组菌株可通过上述方法构建，所涉及具体操作方法已有很多文献报道，如JosephSambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。
有益效果：
1、本发明提供了一种高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株，既克服了普通酿酒酵母由于酯产量低导致的风味不协调，同时降低了对人体有不良影响的高级醇的产量。
2、本发明提供的高产酯低产高级醇酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下，完全敲除氨基酸转氨酶编码基因BAT2和乙酸异戊酯水解酶编码基因IAH1，同时醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的表达量显著提高，达到了高产酯低产高级醇的目的，本发明所述的酿酒酵母重组菌株，在其它发酵性能不受影响的情况下，玉米浓醪发酵4天，主要酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯)含量达到1303.6mg/L，乙酸乙酯的含量是出发菌株的52倍，主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量为151.8mg/L，较出发菌株降低了61.4％。为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景，同时为研究相关基因对白酒风味协调性的影响奠定了基础。
3、本发明在菌株构建过程中创造性的两次过表达ATF1基因，较常规技术中的一次过表达取得了预料不到的技术效果-高级醇含量有效降低。重组菌株的主要高级醇含量，相比BAT2基因敲除同时ATF1基因过表达的重组菌、IAH1基因敲除同时ATF1基因过表达的重组菌、BAT2基因敲除IAH1基因敲除同时ATF1基因过表达的重组菌分别降低了12.1％、34.8％、9.9％。
4、本发明选育得到的酵母菌株通过Cre/LoxP系统完全剔除了KanMX抗性基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工业生产，有广泛的应用前景。
附图说明：
图1为pUC-PAK质粒构建过程；
图2为质粒pUC-PAK的PCR验证：
其中：(a)中M为marker；1为以pUC-PAK为模板，PGK-F/PGK-R为引物PCR扩增PGKp-ATF1-PGKt片段；
(b)中M为marker；1为以pUC-PAK为模板，BAT2-F/BAT2-R为引物PCR扩增BAT2上游同源臂-PGKp-ATF1-PGKt-KanMX-BAT2下游同源臂基因片段；
图3为BAT2基因的敲除同时ATF1基因的过表达重组菌株的验证：
其中：(a)中M为marker；1、2、3为以重组菌株1的基因组为模板，4为以出发菌株基因组为模板，以PB-F和PB-R为引物，PCR扩增验证片段；
(b)中M为marker；1为以重组菌株1的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以KanMX-F/KanMX-R为引物，PCR扩增验证片段；
(c)中M为marker；1、2为以传代前的重组菌株2的基因组为模板，3为以传代后的重组菌株2的基因组为模板，以Zeocin-F/Zeocin-R为引物，PCR扩增验证片段；
图4为IAH1基因敲除、BAT2基因敲除同时ATF1基因两次过表达的重组菌株的验证：
其中：(a)中M为marker；1为以重组菌株4的基因组为模板，2为以重组菌株3基因组为模板，以IP-F/IP-R为引物，PCR扩增验证片段；
(b)中M为marker；1为以重组菌株4的基因组为模板，2为以重组菌株3的基因组为模板，以KI-F/KI-R为引物，PCR扩增验证片段。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明的一种高产酯低产高级醇酿酒酵母及其选育方法。下述实施例中所用的技术手段，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1：高产酯低产高级醇酿酒酵母的构建
本实例所用的出发菌株CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。
根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述引物。
表1本实施例中所用到的引物
注：下划线部分为酶切位点。
表2本实施例中所用的PCR扩增体系
(1)重组质粒pUC-PAK的构建
重组质粒pUC-PAK的构建流程如图1所示；
用限制性内切酶HindIII，分别对质粒pPGK1和载体质粒pUC19进行酶切，切胶回收质粒pPGK1的酶切产物强启动子PGK1，连接强启动子PGK1和载体pUC19，构建质粒pUC-P。
以出发酵母菌株基因组为模板，ATF1-F和ATF1-R为引物，PCR扩增ATF1基因，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，54℃1min，72℃100s，30个循环；72℃10min。用限制性内切酶XhoI对质粒pUC-P和ATF1基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PA。
以质粒pUG6为模板，KanMX-F和KanMX-R为引物，PCR扩增KanMX基因，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃1min，72℃100s，30个循环；72℃10min。用限制性内切酶KpnI对质粒pUC-PA和KanMX基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PAK。
PCR验证结果如图2所示，其中：(a)中M为marker；1为以pUC-PAK为模板，PGK-F/PGK-R为引物PCR扩增PGKp-ATF1-PGKt片段；(b)中M为marker；1为以pUC-PAK为模板，BAT2-F/BAT2-R为引物PCR扩增BAT2上游同源臂-PGKp-ATF1-PGKt-KanMX-BAT2下游同源臂基因片段。
(2)BAT2基因的敲除同时ATF1基因的过表达
以质粒pUC-PAK为模板，BAT2-F和BAT2-R为引物，PCR扩增获得BAT2上游同源臂-PGKp-ATF1-PGKt-KanMX-BAT2下游同源臂基因，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，50℃1min，72℃320s，30个循环；72℃10min。
本实施例通过适当的条件诱导酿酒酵母形成子囊孢子，采用Zymolyase酶酶解子囊胞壁获得子囊孢子，杀死二倍体细胞后经适当稀释涂布于YEPD平板上，培养后形成的小菌落即可能为单倍体，进一步验证单倍体并确定其接合型。通过杜氏管测定产酒精能力以及其它发酵性能的筛选，得到综合性能最优的a型和α型单倍体作为出发菌株。
以下步骤的操作以a型单倍体为例，通过醋酸锂转化的方法将步骤(2)PCR产物导入酿酒酵母出发菌株得到重组菌株1，通过G418抗性筛选重组子进行PCR验证，在PGK1序列内部设计引物PB-F,BAT2基因下游外部设计引物PB-R，用于验证BAT2基因敲除同时ATF1基因过表达。以PB-F和PB-R为引物，可扩增出大小为2295bp的片段，而出发菌株则不能扩增得到该片段，PCR验证结果如图3(a)所示。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1中获得重组菌株2-1；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，即以重组菌株2-1的基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株1则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图3(b)所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAP质粒的重组菌株2，提取酵母质粒，以Zeocin-F/Zeocin-R为引物进行PCR验证如图3(c)所示。
(3)IAH1基因的敲除同时ATF1基因的过表达
以质粒pUC-PAK为模板，IAH1-F和IAH1-R为引物，PCR扩增IAH1上游同源臂-PGKp-ATF1-PGKt-KanMX-IAH1下游同源臂基因，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，50℃1min，72℃320s，30个循环；72℃10min。
通过醋酸锂转化的方法将步骤(3)PCR产物导入不含pGAPza质粒的重组菌株2中得到重组菌株3，通过G418抗性筛选重组子进行PCR验证，在IAH1基因上游外部设计引物IP-F，PGK1序列内部设计引物IP-R；在KanMX序列内部设计引物KI-F,IAH1基因下游外部设计引物KI-R，用于验证IAH1基因敲除同时ATF1基因过表达。以IP-F和IP-R为引物，可扩增出大小为974bp的片段；以KI-F和KI-R为引物，可扩增出大小为1133bp的片段，且PCR扩增出的片段与预期的目的产物大小一致，而出发菌株则不能扩增得到该片段，PCR验证结果如图4所示。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株3中获得重组菌株4-1；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，即以重组菌株4的基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株3则能扩增得到该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAP质粒的重组菌株4，提取酵母质粒进行PCR验证。
将a型单倍体换做α型单倍体，重复上述重组菌构建过程。
将获得的a型和α型单倍体重组菌株4分别接种于含有5ml的YEPD培养基中，30℃静置培养24h。分别取0.5ml菌液于另外一支含有5ml的YEPD的试管中，30℃静置培养4-6h，使两种单倍体结合成为双倍体，显微镜下观察是否有哑铃状形成。稀释单倍体结合的菌液，涂布于YEPD平板上，培养两天。挑取单菌落于YEPD平板上，然后再将YEPD平板上的菌落对应转接于生孢平板上，25℃静置培养6天，镜检是否有生孢子情况。若有三个或四个子囊孢子形成则证明单倍体杂交成功，若无则单倍体没有结合成功。最后获得双倍体重组菌5。
结果表明，在酵母细胞中实现了完全敲除IAH1基因、完全敲除BAT2基因同时两次强启动子PGK1过表达ATF1基因全序列。
实施例2：高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株发酵实验
(1)重组菌株与出发菌株的玉米浓醪发酵实验
将重组菌株和出发菌株分别同时进行玉米浓醪发酵实验，发酵工艺路线图：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；
工艺条件：
浸泡条件：60670℃，浸渍20min；液化条件：85690℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55660℃，加入糖化酶，糖化20min；
配料：玉米粉60g，水130mL，耐高温α-淀粉酶2×104U/mL，30μL，糖化酶1×105U/mL，90μL，7.5×102U/mL酸性蛋白酶1.2mL；营养盐1mL(MgSO4150g/L、KH2PO475g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)；
挑取一环酵母细胞，接入装有5mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24h，按10％接种量接种到装有45mL二级种子培养基的150mL三角瓶中，30℃静置培养16h至对数期的后期，按10％接种量接种到玉米浓醪发酵培养基，30℃静置发酵。每隔12h称重1次，当两次失重小于1g，发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样。测定CO2累积排放量、酒精度和残还原糖等发酵性能指标，结果如表3，重组菌株5发酵后的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别，本例中的基因敲除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能有不利影响。
表3亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
(2)气相色谱法测定酯和醇的产量
气相色谱仪：Agilent7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP-930，230℃，50m×320μm×1μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8min，5℃/min升到120℃,保持8min；进样口温度：200℃；进样量：1.0μL；分流方式：分流，分流比为10：1；结果如表4。结果显示，重组菌株5主要酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯)含量达到1303.6mg/L，其中乙酸乙酯的含量是出发菌株的52倍，主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量为151.8mg/L，较出发菌株降低了61.4％。
表4亲本菌株和重组菌株的高级醇和酯产量(单位mg/L)
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
实施例3效果实验
重复实施例1中的部分步骤，分别获得以下菌株：
菌株1：敲除IAH1过表达ATF1的重组菌；
菌株2：敲除BAT2过表达ATF1的重组菌；
菌株3：敲除IAH1、敲除BAT2同时一次过表达ATF1的重组菌；
将上述三株重组菌与本发明所述的敲除IAH1、敲除BAT2同时两次次过表达ATF1的重组菌以及出发菌株分别进行实施例2所描述的发酵实验，结果如表5；
由表5可知，敲除IAH1、敲除BAT2同时两次次过表达ATF1的重组菌的主要高级醇含量，相比BAT2基因敲除同时ATF1基因过表达的重组菌、IAH1基因敲除同时ATF1基因过表达的重组菌、BAT2基因敲除IAH1基因敲除同时ATF1基因过表达的重组菌分别降低了12.1％、34.8％、9.9％。
表5亲本菌株和几株重组菌株的高级醇和酯产量(单位mg/L)
菌株 正丙醇 乙酸乙酯 异丁醇 乙酸异丁酯 异戊醇 乙酸异戊酯 苯乙醇
菌株1 39.8 928.8 68.8 9.7 95.5 74.5 28.8
菌株2 43.4 1194.5 39.5 5.4 62.3 66.8 27.4
菌株3 38.8 1218.5 36.8 8.5 65.4 75.6 27.5
重组菌株5 34.9 1221.6 31.9 8.3 62.1 73.7 22.9
CICC32315 37.8 23.4 87.1 0 225.5 0 43.3

Claims (9)

1.一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株，其特征在于，是在出发酵母菌株中完全敲除编码氨基酸转氨酶的BAT2基因和编码乙酸异戊酯水解酶的IAH1基因，同时两次强启动子PGK1过表达编码醇乙酰基转移酶的ATF1基因所得。
2.如权利要求1所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315。
3.如权利要求1所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株，其特征在于，
所述BAT2基因其GeneID为：853613，核苷酸序列如序列表中SEQNO:1所示；
所述IAH1基因其GeneID为：854293，核苷酸序列如序列表中SEQNO:2所示；
所述ATF1基因其GeneID为：854559，核苷酸序列如序列表中SEQNO:3所示；
所述启动子PGK1其GeneID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示。
4.如权利要求1所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的制备方法，包括以下步骤：
(1)过表达ATF1基因的重组片段的构建
①连接强启动子PGK1和载体pUC19，构建质粒pUC-P；
②以出发酵母菌株基因组为模板，PCR扩增ATF1基因，将pUC-P和ATF1基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PA；
③将KanMX基因连接至质粒pUC-PA，构建质粒pUC-PAK；
(2)BAT2基因敲除同时ATF1基因过表达；
①以质粒pUC-PAK为模板，PCR扩增获得含有BAT2上游同源臂、PGK1强启动子、ATF1基因、KanMX基因和BAT2下游同源臂的基因片段；
②制备出发酿酒酵母菌株的a型和α型单倍体分别作为出发菌株，以下步骤操作以a型为例；
③将步骤(2)-①得到的PCR产物导入出发酵母菌株a型单倍体中，获得BAT2基因的敲除同时ATF1过表达的重组菌株1；
④用pGAP质粒去除步骤(2)-③获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株2，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株2；
(3)IAH1基因的敲除同时ATF1基因过表达；
①以质粒pUC-PAK为模板，PCR扩增获得含有IAH1上游同源臂、PGK1强启动子、ATF1基因、KanMX基因和IAH1下游同源臂的基因片段；
②将步骤(3)-①得到的PCR产物导入重组菌株2中，获得BAT2基因的敲除，IAH1基因的敲除同时ATF1两次过表达的重组菌株3；
③用pGAP质粒去除步骤(3)-②获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因，IAH1敲除、BAT2敲除同时ATF1两次过表达的重组菌株，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株4；
④将a型和α型单倍体分别作为出发菌株得到的重组菌株4进行融合，得到双倍体重组菌株5。
5.如权利要求4所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315。
6.如权利要求4所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述含有PGK1强启动子的质粒为pUC质粒。
7.如权利要求4所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述带有KanMX抗性的载体为Yep352载体。
8.如权利要求4所述的一株高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，所述基因片段导入酵母菌株的方法为醋酸锂转化法。
9.如权利要求1所述的高产酯低产高级醇酿酒酵母菌在白酒生产中的应用。
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Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119142A (zh) * 2016-01-12 2016-11-16 天津科技大学 一株通过敲除car1过表达dur3低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法
CN106929438A (zh) * 2016-11-18 2017-07-07 天津科技大学 一株高产四甲基吡嗪的酿酒酵母及其构建方法
CN107177623A (zh) * 2017-05-24 2017-09-19 梁恒宇 一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法
CN108070496A (zh) * 2018-02-27 2018-05-25 山东兰陵美酒股份有限公司 一种低含杂醇油的保健型红曲黍米黄酒的制备方法
CN108485996A (zh) * 2018-05-18 2018-09-04 天津科技大学 一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及构建方法
CN108913807A (zh) * 2018-08-16 2018-11-30 青岛啤酒股份有限公司 用于筛选低蛋白酶a基因表达的酵母菌株的多重引物、试剂盒及筛选方法
CN109136254A (zh) * 2018-07-10 2019-01-04 天津科技大学 一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用
CN109439557A (zh) * 2018-12-14 2019-03-08 武汉轻工大学 高产酸、低产杂醇油酿酒酵母菌及其组合物和应用
CN110205257A (zh) * 2019-06-26 2019-09-06 贵州大学 一株低产高级醇的酿酒酵母及其在小曲米酒酿造中的应用
CN110343652A (zh) * 2019-07-24 2019-10-18 天津科技大学 一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法
CN110373341A (zh) * 2019-07-24 2019-10-25 天津科技大学 一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法
CN110551643A (zh) * 2019-07-19 2019-12-10 天津科技大学 通过调控脯氨酸代谢途径构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
CN110819547A (zh) * 2019-11-28 2020-02-21 天津科技大学 一种过表达羟酸还原异构酶的葡萄汁酵母菌株及其应用
CN110846238A (zh) * 2019-11-28 2020-02-28 天津科技大学 一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用
CN110951633A (zh) * 2019-11-28 2020-04-03 天津科技大学 一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用
CN112011473A (zh) * 2020-09-08 2020-12-01 天津科技大学 一种低产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用
CN112625931A (zh) * 2020-11-18 2021-04-09 江南大学 一种促进酵母艾利希途径提高黄酒酪醇、色醇含量的方法
CN112980868A (zh) * 2021-02-07 2021-06-18 浙江工业大学绍兴研究院 一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法
US20210198679A1 (en) * 2019-12-27 2021-07-01 Tianjin University Of Science And Technology Saccharomyces cerevisiae strain with high yield of ethyl butyrate and construction method and application of saccharomyces cerevisiae strain
CN113773977A (zh) * 2021-10-16 2021-12-10 贵州医科大学 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用
CN117757650A (zh) * 2024-01-03 2024-03-26 泰山学院 一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用
CN117757650B (zh) * 2024-01-03 2024-06-04 泰山学院 一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914461A (zh) * 2010-07-16 2010-12-15 天津科技大学 低产高级醇酿酒酵母工程菌及其构建方法
CN102199556A (zh) * 2011-04-15 2011-09-28 天津科技大学 一种高产酯酿酒酵母基因工程菌及其构建方法
CN102604847A (zh) * 2012-03-23 2012-07-25 天津科技大学 一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914461A (zh) * 2010-07-16 2010-12-15 天津科技大学 低产高级醇酿酒酵母工程菌及其构建方法
CN102199556A (zh) * 2011-04-15 2011-09-28 天津科技大学 一种高产酯酿酒酵母基因工程菌及其构建方法
CN102604847A (zh) * 2012-03-23 2012-07-25 天津科技大学 一株含有Lg-ATF1基因的酿酒酵母工程菌

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘玉兰 等: "ATF1过表达和BAT2 敲除酿酒酵母发酵性能的研究", 《中国酿造》 *
张艳英 等: "BAT2 缺失酿酒酵母基因工程安全菌株的构建及其杂交育种", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106119142A (zh) * 2016-01-12 2016-11-16 天津科技大学 一株通过敲除car1过表达dur3低产氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法
CN106929438A (zh) * 2016-11-18 2017-07-07 天津科技大学 一株高产四甲基吡嗪的酿酒酵母及其构建方法
CN107177623B (zh) * 2017-05-24 2020-01-07 梁恒宇 一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法
CN107177623A (zh) * 2017-05-24 2017-09-19 梁恒宇 一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法
CN108070496A (zh) * 2018-02-27 2018-05-25 山东兰陵美酒股份有限公司 一种低含杂醇油的保健型红曲黍米黄酒的制备方法
CN108485996A (zh) * 2018-05-18 2018-09-04 天津科技大学 一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及构建方法
CN109136254A (zh) * 2018-07-10 2019-01-04 天津科技大学 一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用
CN109136254B (zh) * 2018-07-10 2021-06-04 天津科技大学 一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用
CN108913807A (zh) * 2018-08-16 2018-11-30 青岛啤酒股份有限公司 用于筛选低蛋白酶a基因表达的酵母菌株的多重引物、试剂盒及筛选方法
CN108913807B (zh) * 2018-08-16 2021-04-20 青岛啤酒股份有限公司 用于筛选低蛋白酶a基因表达的酵母菌株的多重引物、试剂盒及筛选方法
CN109439557A (zh) * 2018-12-14 2019-03-08 武汉轻工大学 高产酸、低产杂醇油酿酒酵母菌及其组合物和应用
CN110205257A (zh) * 2019-06-26 2019-09-06 贵州大学 一株低产高级醇的酿酒酵母及其在小曲米酒酿造中的应用
CN110551643A (zh) * 2019-07-19 2019-12-10 天津科技大学 通过调控脯氨酸代谢途径构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
CN110343652A (zh) * 2019-07-24 2019-10-18 天津科技大学 一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法
CN110373341A (zh) * 2019-07-24 2019-10-25 天津科技大学 一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法
CN110373341B (zh) * 2019-07-24 2021-09-07 天津科技大学 一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法
CN110846238A (zh) * 2019-11-28 2020-02-28 天津科技大学 一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用
CN110951633A (zh) * 2019-11-28 2020-04-03 天津科技大学 一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用
CN110819547A (zh) * 2019-11-28 2020-02-21 天津科技大学 一种过表达羟酸还原异构酶的葡萄汁酵母菌株及其应用
US11746353B2 (en) * 2019-12-27 2023-09-05 Tianjin University Of Science And Technology Saccharomyces cerevisiae strain with high yield of ethyl butyrate and construction method and application of Saccharomyces cerevisiae strain
US20210198679A1 (en) * 2019-12-27 2021-07-01 Tianjin University Of Science And Technology Saccharomyces cerevisiae strain with high yield of ethyl butyrate and construction method and application of saccharomyces cerevisiae strain
CN112011473A (zh) * 2020-09-08 2020-12-01 天津科技大学 一种低产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用
CN112011473B (zh) * 2020-09-08 2023-03-03 天津科技大学 一种低产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用
CN112625931A (zh) * 2020-11-18 2021-04-09 江南大学 一种促进酵母艾利希途径提高黄酒酪醇、色醇含量的方法
CN112625931B (zh) * 2020-11-18 2023-09-12 江南大学 一种促进酵母艾利希途径提高黄酒酪醇、色醇含量的方法
CN112980868A (zh) * 2021-02-07 2021-06-18 浙江工业大学绍兴研究院 一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法
CN113773977A (zh) * 2021-10-16 2021-12-10 贵州医科大学 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用
CN113773977B (zh) * 2021-10-16 2023-09-15 贵州医科大学 一种低产乙醇高产香的酵母菌株及其应用
CN117757650A (zh) * 2024-01-03 2024-03-26 泰山学院 一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用
CN117757650B (zh) * 2024-01-03 2024-06-04 泰山学院 一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用

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