CN108486176A

CN108486176A - 一种产乳酸乙酯的酿酒酵母及其构建方法与应用

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Publication number: CN108486176A
Application number: CN201810477700.8A
Authority: CN
Inventors: 陈叶福; 刘港; 李洁; 任津莹; 肖冬光; 郭学武
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108486176B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种提高酿酒酵母乳酸乙酯产量的方法及其应用。通过在出发菌株中过表达乳酸脱氢酶基因ldhL1，以获得一定产L‑乳酸和乳酸乙酯能力的酵母菌株，该菌株乳酸乙酯的产量，较以出发菌株为生产菌株，外源添加ldhL1催化产生的等量乳酸后，生产的乳酸乙酯的产量提高40％以上，取得了预料不到的技术效果，与出发菌株相比异戊醇降低了约57.7％，苯乙醇降低了约52.11％；同时选用PGK1_P对南极假丝酵母脂肪酶B进行过表达，乳酸乙酯的产量达210.25mg/L。为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景。

Description

一种产乳酸乙酯的酿酒酵母及其构建方法与应用

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种产乳酸乙酯酿酒酵母及其构建方法与应用。

背景技术：

酯香物质是白酒中主要的风味物质，较高的酯含量不仅赋予其重要的酯香，同时能有效地扩张、松弛神经，可减少喝酒引起的副作用。乳酸乙酯则是所有香型中国白酒的重要呈香物质，适宜的乳酸乙酯含量对中国白酒的风味质量至关重要。清香型白酒酯类化合物中乳酸乙酯仅次于乙酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量和比例对白酒的风味影响很大。而对于老白干香型白酒和米香型白酒来说，乳酸乙酯含量要多于乙酸乙酯，其中老白干香型的比例为1.5-2.2:1，米香型白酒的乳酸乙酯含量≥0.3g/L，依据GB/T20825规定，老白干香型白酒乳酸乙酯/乙酸乙酯≥0.80。以茅台为代表的酱香型白酒和以汾酒为代表的浓香型白酒，其乳酸乙酯的含量分别达1.4g/L左右。因此乳酸乙酯的含量在白酒中具有重要的意义。乳酸乙酯也是醋等发酵食品的主要香气成分，产乳酸乙酯酵母的应用可以提高食醋中香气成分的含量，改善食醋香气，提高食醋质量。

大多数以纯种培养的酿酒酵母为主体微生物进行的发酵，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。而高档饮料酒中酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母以及提供产酯前体物的乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中各种酯的含量。一方面，这些天然的酵母和提供酯前体的微生物都不具备产乳酸乙酯的能力。另一方面，野生菌群的存在严重影响了原料出酒率，使酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致了我国高档白酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。

随着白酒工业的现代化发展，酿造技术的机械化越来越受到人们的关注，清洁生产和GMP(良好生产规范)理念逐步在白酒行业应用，白酒行业将迎来重大的变革。白酒生产机械化，一些传统工艺必然改变，酿酒功能菌的生长繁殖和代谢环境及条件亦会随之而变。因此，白酒机械化必须与微生物的研发同步。作为中国白酒的基础风味物质，微生物产酯尤其是对乳酸乙酯的研究更需走在前面。构建高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时生产基础酯香物质乳酸乙酯，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

白酒中酯类的生成途径有两种：一种是通过有机反应生成酯，在常温条件下极为缓慢，往往需要经几年时间才能使酯化反应达平衡；另一种就是由微生物的生化反应生成酯，这是白酒生产中产酯的主要途径。存在于酒醅中的汉逊酵母、假丝酵母等微生物，均有较强的产酯能力。近年来关于酿酒酵母产乳酸的报导非常多，这些研究或者基于存在的乳酸，或者以酿酒酵母为主体的混菌发酵，并没有纯种酵母菌株发酵酿酒原料产乳酸乙酯的研究报道，也没有在酿酒酵母产乳酸的基础上进行产乳酸乙酯改造的研究。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种乳酸脱氢酶基因的新应用，也即利用乳酸脱氢酶提高酿酒酵母乳酸乙酯产量的方法及其应用。具体是在酵母菌中通过过表达乳酸脱氢酶基因实现乳酸乙酯产量的大幅提高；进而在过表达乳酸脱氢酶基因的同时整合过表达南极假丝酵母脂肪酶B构建全新的乳酸乙酯合成途径，从而进一步提高酿酒酵母菌株发酵产乳酸乙酯的产量。

本发明还将提供一种采用上述方法或在上述方法基础上构建的产乳酸乙酯的酿酒酵母菌株及其应用。

一株产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，是以酿酒酵母为出发菌株，过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1所得；

一株产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，是以酿酒酵母为出发菌株，过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，同时异源过表达南极假丝酵母脂肪酶B 所得；

优选地，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315；

优选地，所述植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因ldhL1，其Gene ID为：1061886，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述南极假丝酵母脂肪酶B表达基因为CalB，其Gene ID为515792，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示；

本发明还提供上述高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，首先将植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1在酿酒酵母中进行异源表达，得到一定水平的产乳酸乙酯酵母菌株P；其次，用强启动子PGK1_P对南极假丝酵母脂肪酶B 在上述菌株P中进行异源整合强表达，得到产乳酸乙酯的酵母菌株P-CalB；

所述植物乳杆菌乳酸脱氢酶ldhL1基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因实现的；

所述丙酮酸脱羧酶基因为PDC1，其Gene ID为：850733；

南极假丝酵母脂肪酶B的异源过表达是通过替换转录调节因子Gal80基因实现的，Gal80基因Gene ID为：854954；

所述启动子PGK1_P其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；

所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

构建方法具体包括如下步骤：

(1)产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

1)从NCBI上获取植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因序列，合成用于异源过表达的乳酸脱氢酶基因ldhL1；

2)以出发酵母菌株作为模板，通过PCR方法分别获得同时作为启动子和丙酮酸脱羧酶基因PDC1上游同源臂的PA片段及丙酮酸脱羧酶基因PDC1下游同源臂PB；

3)以出发酵母菌株作为模板，PCR扩增得到PGK1_T终止子；

4)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；

5)使用融合PCR方法将片段KanMX与PGK1_T融合得到融合片段 PGK1_T-KanMX；

6)分别对Yep352和融合片段PGK1_T-KanMX进行酶切，酶切片段 PGK1_T-KanMX与酶切载体Yep352连接得到质粒Yep352-PK；

7)以质粒Yep352-PK为模板，PCR扩增得到带ldhL1和PB同源区的 PGK1_T-KanMX；

8)制备出发酿酒酵母菌株CICC32315的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的a型和α型单倍体，并以α型单倍体作为出发菌株进行以下操作；

9)PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：PA、ldhL1、PGK1_T-KanMX和 PB，PCR产物导入出发酵母菌株α型单倍体中，同源重组后得到重组菌株1；

10)用pGAPza质粒去除步骤9)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX 基因的重组菌株P1，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株P；

(2)过表达CalB产乳酸乙酯酵母菌株的构建

1)从NCBI上获得南极假丝酵母脂肪酶B基因，并完成酿酒酵母密码子优化，得到包含密码子优化的CalB的pUC57-CalB质粒；

2)以出发酵母菌株作为模板，通过PCR得到强启动子PGK1_P，以质粒 pUC57-CalB作为模板，通过PCR扩增得到密码子优化后的CalB片段；

3)将酿酒酵母密码子优化后的CalB与启动子PGK1_P融合，得到融合片段 PGK1_P-CalB；

4)将步骤(1)-6)得到的质粒Yep352-PK及融合片段PGK1_P-CalB分别酶切，回收后进行连接，得到质粒Yep352-PCPK；

5)分别以质粒Yep352-PCPK作为模板和出发株酿酒酵母基因组作为模板， PCR分别扩增得到含南极假丝酵母脂肪酶B的PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX和 Gal80基因的上下同源臂CGA和CGB；

6)将上述PCR得到的PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX、CGA和CGB一起对(1) -10)得到的菌株P进行醋酸锂化学转化，同源重组后得到重组菌株2；

7)用pGAPza质粒去除上一步骤获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因，传代得到相应不含pGAPza质粒的重组菌株P-CalB。

工业应用当中应对出发酵母菌株a型单倍体作上述同样的改造，获得的重组菌与α型重组菌融合后进行应用。

所述重组菌株可通过上述方法构建，所涉及具体操作方法已有很多文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

本发明还提供上述重组菌株的应用。

有益效果：

1、本发明提供的高产乳酸乙酯酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下，敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1，同时异源过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因 ldhL1，达到一定L-乳酸和乳酸乙酯生产能力，该菌株乳酸乙酯的产量，较以出发菌株为生产菌株，外源添加ldhL1催化产生相同水平的乳酸后，生产的乳酸乙酯的产量提高40％以上，属于预料不到的技术效果；将南极假丝酵母脂肪酶B 基因在产乳酸的菌株P中进行整合表达，得到一定乳酸乙酯生产能力的菌株P-CalB，达到了高产乳酸乙酯的目的，为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景。

2、玉米水解液发酵5天后，亲本α型菌株基本无乳酸乙酯的产生能力，过表达ldhL1的重组菌株P其乳酸乙酯的产量为164.14mg/L左右，亲本α型菌株添加相同水平的乳酸进行发酵，实验测得乳酸乙酯的产量达116.57mg/L；整合过表达南极假丝酵母脂肪酶B的菌株P-CalB其乳酸乙酯的产量达210.25mg/L，乳酸乙酯的产量较菌株P提高了近28％。菌株P与出发菌株相比异戊醇降低了约57.7％，苯乙醇降低了约52.11％。

3、本发明选育得到的酵母菌株通过Cre/LoxP系统完全剔除了KanMX抗性基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工业生产，有广泛的应用前景。

附图说明：

图1为Yep352-PK质粒构建过程；

图2为质粒Yep352-PK的PCR验证：

其中：M为marker；1-3为分别以质粒Yep352-PK为模板，PCR扩增得到的PGK1_T-KanMX、PGK1_T和KanMX片段。

图3为胞内整合乳酸脱氢酶基因ldhL1同源重组过程；

图4为胞内整合乳酸脱氢酶基因ldhL1重组子的PCR验证：

其中：(a)中M为marker；1为以出发菌株AY12-α的基因组为模板，2 为以重组菌株1基因组为模板，以D1-U/D1-D为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以出发菌株AY12-α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以D2-U/D2-D为引物，PCR扩增验证片段。

(c)中M为marker；1为以出发菌株AY12-α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以D3-U/D3-D为引物，PCR扩增验证片段。

图5为KanMX抗性基因的丢除及pGAPza质粒的丢失验证电泳图：

其中：(a)中M为marker；1为以菌株丢KanMX前的基因组为模板，2 为以丢KanMX后的基因组为模板，以Kr-U/Kr-D为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1、2为以传代前的重组菌株的基因组为模板，3为以传代后的重组菌株的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片段；

图6为Yep352-PCPK质粒构建过程；

图7为质粒Yep352-PCPK的验证电泳图：

其中：M为marker；1-3为分别以质粒Yep352-PCPK为模板，PCR扩增得到的PGK1_P-CalB、PGK1_T-KanMX和PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX片段；

图8为胞内整合南极假丝酵母CalB基因的同源重组过程；

图9为Gal80基因的敲除同时过表达南极假丝酵母CalB基因重组菌株2的验证：

其中：(a)中M为marker；1为以菌株P的基因组为模板，2为以重组菌株2基因组为模板，以D4-U/D4-D为引物，PCR扩增验证片段；

(b)中M为marker；1为以菌株P的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以D5-U/D5-D为引物，PCR扩增验证片段。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，以下实施例所使用的酵母菌株均为酿酒酵母CICC32315。

实施例1：高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

本实例所用的出发菌株为酿酒酵母CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自 Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。

菌株主要构建过程如下：

(1)Yep352-PK质粒的构建

以Yep352为基础质粒构建质粒Yep352-PK，构建流程如图1所示。分别以酿酒酵母CICC32315的α型单倍体基因组和pUG6质粒作为模板，使用引物 PGK1_T-U(SEQ ID NO:4)和PGK1_T-D(SEQ ID NO:5)PCR扩增得到258bp的 PGK1_T片段以及使用引物Kr-U(SEQ ID NO:6)和Kr-D(SEQ ID NO:7)扩增得到1613bp的KanMX基因，使用融合PCR方法将KanMX和PGK1_T进行融合得到片段PGK1_T-KanMX，大小为1871bp；用限制性内切酶BamHI和XbaI分别对 Yep352和融合片段PGK1_T-KanMX进行分步酶切，对质粒Yep352切胶回收， PGK1_T-KanMX酶切回收后进行连接，得到质粒Yep352-PK。

(2)产乳酸乙酯酵母菌株的构建

以CICC32315酵母α型单倍体菌株(下文称为AY12-ɑ)的基因组为模板，使用引物PA-U(SEQ ID NO:8)和PA-D(SEQ ID NO:9)PCR扩增得到1290bp 的同时作为启动子和PDC1上游同源臂的PA片段以及使用引物PB-U(SEQ ID NO:10)和PB-D(SEQ ID NO:11)扩增得到519bp的下游同源臂PB；以合成的带植物乳杆菌乳酸脱氢酶ldhL1(SEQ ID NO:1所示)的质粒作为模板，使用引物ldhL1-U(SEQ ID NO:12)和ldhL1-D(SEQ ID NO:13)PCR扩增得到998bp的乳酸脱氢酶基因ldhL1；以质粒Yep352-PK作为模板，使用引物PK-U(SEQ ID NO:14)和PK-D(SEQ ID NO:15)扩增得到1871bp的PGK1_T-KanMX片段。

图2为质粒Yep352-PK的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA Ladder Marker；泳道1以质粒Yep352-PK为模板PCR扩增到的1871bpPGK1_T-KanMX 片段。泳道2为以出发菌为模板PCR扩增到的258bp PGK1_T片段；泳道3为以质粒pUG6为模板PCR扩增到的1613bp的KanMX片段。

以上PCR得到的四个片段PA、ldhL1、PGK1_T-KanMX和PB用醋酸锂转化法同时转化入酿酒酵母CICC32315生孢分离获得的α型单倍体中，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株1。同源重组过程如图3所示。

重组酿酒酵母单倍体的验证：

根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组上、下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR 扩增，验证重组子。引物序列为：

D1-U：TGGCATCTTCACCG

D1-D：TTATTTATTTTCTAATTCAGC

D2-U：ATGCCAAATCATCAAAAAGTTG

D2-D：TAACGAACGCAGAATTTTC

D3-U：CAGCTGAAGCTTCGTACGCTGC

D3-D：TGTGCTACTACAACTGTTCAT

分别以引物D1-U/D1-D、D2-U/D2-D和D3-U/D3-D进行上中下游定点PCR 验证，其中上游引物D1-U/D1-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2800bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物D2-U/D2-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2900bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D3-U/D3-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条4000bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，出发菌α型单倍体的阴性对照无条带，说明PA-ldhL1-PGK1_T-KanMX-PB片段已成功重组到酿酒酵母CICC32315单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图4所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图4中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中(a)中，泳道1为出发菌α型单倍体的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1上游定点验证PCR产物；(b)中泳道1为出发菌α型单倍体的中游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1中游定点验证PCR产物；(c)中泳道1为出发菌α型单倍体的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1下游定点验证PCR产物。

通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1 中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在 G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株1则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图5(a)所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株P，提取酵母质粒，以Zeocin-F/Zeocin-R(SEQ ID NO:26/27)为引物进行PCR验证如图5(b)所示。

(3)脂肪酶CalB催化产乳酸乙酯酵母菌株的构建

1)Yep352-PCPK的质粒构建

以(1)步骤得到的Yep352-PK为基础质粒构建质粒Yep352-PCPK，构建流程如图6所示。在NCBI上找到南极假丝酵母CalB基因序列(Gene ID为515792)，并交由苏州金唯智公司完成酿酒酵母的密码子优化和基因合成(SEQ ID NO:2所示)。以合成的带CalB基因序列(SEQ ID NO:2所示)的质粒作为模板，设计引物CalB-U(SEQ ID NO:16)和CalB-D(SEQ IDNO:17)PCR扩增得到954bp 的CalB片段。以酵母α型单倍体菌株的基因组为模板，分别使用引物PC-U(SEQ ID NO:18)与PC-D(SEQ ID NO:19)，PCR扩增得到带CalB同源区长度为1479bp 的PGK1_P片段。使用融合PCR方法将PGK1_P片段与CalB进行融合，得到大小为2433bp的PGK1_P-CalB片段。用限制性内切酶EcoRI和SmaI分别对Yep352-PK 和融合片段PGK1_P-CalB进行双酶切，对质粒Yep352-PK切胶回收，片段酶切回收后进行连接，得到质粒Yep352-PCPK。

图7为质粒Yep352-PCPK的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA Ladder Marker；泳道1-3分别为以质粒Yep352-PCPK为模板PCR扩增得到2433bp的融合片段PGK1_P-CalB，1871bp的PGK1_T-KanMX片段及4304bp的 PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX片段。

2)过表达CalB产乳酸乙酯酵母菌株的构建

以CICC32315酵母α型单倍体菌株的基因组为模板，分别使用引物CGA-U (SEQ IDNO:20)和CGA-D(SEQ ID NO:21)PCR扩增得到Gal80基因563bp 的上游同源臂的CGA片段以及使用引物CGB-U(SEQ ID NO:22)和CGB-D(SEQ ID NO:23)扩增得到732bp的下游同源臂CGB；以质粒Yep352-PCPK作为模板，使用引物PCPK-U(SEQ ID NO:24)和PCPK-D(SEQ ID NO:25)扩增得到大小为 4455bp的PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX片段。

以上PCR得到的三个片段CGA、PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX、和CGB用醋酸锂转化法同时转化入(2)步骤得到的产乳酸菌株P，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母单倍体重组菌株2。同源重组过程如图8所示。

重组酿酒酵母单倍体的验证：

根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR 扩增，验证重组菌株。引物序列为：

分别以引物D4-U/D4-D、D3-U/D5-D进行上中下游定点PCR验证，其中上游引物D4-U/D4-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条3400bp 左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D5-U/D5-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2700bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，其大小与预期一致，改造菌P的阴性对照无条带，说明重组盒 GA-PGK1_P-CalB-PGK1_T-KanMX-GB片段已成功重组到酿酒酵母CICC32315单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图9所示，为重组酿酒酵母验证结果。

图9中(a)中M为5000bpDNA Ladder Marker，其中泳道1为菌株P的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株2上游定点验证PCR产物；(b)中M 为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为菌株P的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株2下游定点验证PCR产物。

通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株2 中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在 G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以其基因组作为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株2则能扩增得到该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每 12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株P-CalB，提取酵母质粒进行PCR验证。

整个过程所用引物的序列如表1。

表1

实施例2：外源添加乳酸发酵与产乳酸酵母合成乳酸乙酯比较

玉米液态白酒发酵实验

1)发酵工艺路线：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→过滤→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；

2)工艺条件

浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20h；

3)配料：玉米粉1500g，水4500mL，静置放置20min，耐高温α-淀粉酶 2×10⁴U/mL,0.9ml，糖化酶1×10⁵U/mL,3mL。

4)培养基配置

一级种子培养基：8°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装5mL于试管，煮沸10min以灭菌。

二级种子培养基：12°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装45mL 于150mL三角瓶，105℃灭菌15min。

发酵培养基：准备18°Brix玉米水解液，分装135mL于250mL三角瓶中， 105℃灭菌15min，晾至室温后加营养盐1mL(MgSO₄ 150g/L、KH₂PO₄ 75g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)。

(1)玉米液态白酒发酵：分别挑取出发酵母CICC32315的ɑ菌株(AY12-ɑ) 和菌株P各1环，接入5mL一级种子玉米水解液培养基中，30℃静置培养24h。将一级培养物全部转入装有45mL二级种子玉米水解液培养基中，30℃静置培养约16h，测定菌液的吸光值，取相应的体积换算成相同的菌体数量接种到配制好的135mL发酵培养基中。30℃培养箱静置发酵，每隔12h称重一次，发酵结束后分别测定CO₂总失重、酒精度、还原糖及酯类含量。结果见表2，可见菌株 P与AY12-ɑ酒精度和残糖量没有明显差别，本例中的基因敲除、过表达不会对菌株基本发酵性能产生不利影响。同时确定该发酵条件下菌株P的乳酸产量为 12.50g/L。

(2)外源添加乳酸发酵实验：以出发酵母CICC32315的ɑ菌株(AY12-ɑ) 为实验菌株，测定外源添加乳酸条件下其CO₂总失重、酒精度、还原糖及酯类含量。

其一、二级种子的培养与(1)中一致，乳酸添加量是通过测定菌株P在步骤(1)条件下所产乳酸的浓度进行确定(12.50g/L)，同时该浓度在被试菌株的耐受范围内。在菌株生长的不同阶段(稳定期、对数期和发酵初期)添加该浓度的乳酸进行发酵，30℃培养箱静置发酵，每隔12h称重一次，发酵结束后分别测定CO₂总失重、酒精度、还原糖及酯类含量。

如表2所示，出发菌株添加12.50g/L乳酸和菌株P的发酵中，酒精度和残糖量与不添加乳酸的出发菌株相比没有明显差别，本例中的基因敲除、过表达及外源添加乳酸发酵不会对菌株基本发酵性能产生不利影响。

如表3所示，菌株P其乳酸乙酯产量为164.14mg/L，乳酸到乳酸乙酯的转化率仅为0.98％，表明发酵过程只有少量的乳酸转化生成乳酸乙酯。同时，考虑到不同发酵批次中乳酸的产量并不为一个定值，其总含量都在12.50g/L左右。因此，在菌株生长不同阶段添加与菌株P相同水平的乳酸(12.50g/L)时，原菌 AY12-ɑ的乳酸乙酯产量最高为116.57mg/L，仅为菌株P的71％，可见表达乳酸脱氢酶后的菌株P较对照组添加等量乳酸条件下的乳酸乙酯含量得到提高，说明在酿酒酵母中过表达乳酸脱氢酶不仅能催化乙醇生产乳酸，而且较外源添加等量乳酸的对照组所产的乳酸乙酯浓度更高，属于预料不到的技术效果。而出发株不加乳酸进行发酵检测不到乳酸乙酯的产生。菌株P与出发菌株相比异戊醇降低了约57.7％，苯乙醇降低了约52.11％，属于预料不到的效果。

表2发酵不同阶段添加乳酸性能比较

注：AY12-ɑ(12.50g/L乳酸，初)为发酵初期，菌株AY12-ɑ添加12.50g/L乳酸发酵；AY12-ɑ(12.50g/L乳酸，对)为对数期，菌株AY12-ɑ添加12.50g/L乳酸发酵；AY12-ɑ(12.50g/L 乳酸，稳)为稳定期，菌株AY12-ɑ添加12.50g/L乳酸发酵；NF表示未检测出该物质。所示数据为三个平行试验结果的平均值。

表3加乳酸发酵对高级醇和酯的影响(mg/L)

注：AY12-ɑ(12.50g/L乳酸，初)为发酵初期，菌株AY12-ɑ添加12.50g/L乳酸发酵；AY12-ɑ (12.50g/L乳酸，对)为对数期，菌株AY12-ɑ添加12.50g/L乳酸发酵；AY12-ɑ(12.50g/L 乳酸，稳)为稳定期，菌株AY12-ɑ添加12.50g/L乳酸发酵；NF表示未检测出该物质。所示数据为三个平行试验结果的平均值。

(3)酿酒酵母玉米水解液发酵参数的测定方法

采用高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中的乙醇和葡萄糖的含量。HPLC 的检测条件：Bio-Rad HPX-87H色谱柱，流动相为5mmol/L的硫酸，流速为0.6 mL/min，柱温为65℃，检测器温度为45℃，采用示差折光检测器检测。将样品稀释一定的倍数后用0.22μm的滤膜过滤，进样量为20μL。采用外标法以色谱图的峰高进行定量。所有标准曲线R²值达到0.999以上方可使用。

发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样，测定CO₂累积排放量、酒精度和残还原糖等发酵性能指标。

(4)酯和高级醇的产量的气相色谱测定方法

气相色谱仪：Agilent 7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP-930，230℃， 50m×320μm×1μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8min，5℃/min升到120℃, 保持8min；进样口温度：200℃；进样量：1.0μL；分流方式：分流，分流比为 10：1。

实施例3：不同出发菌株合成乳酸乙酯能力比较

参考实施例1以菌株AY12-ɑ为出发菌株构建产乳酸乙酯酿酒酵母的方法，本发明还分别在黄酒酵母RY-1(保藏编号：CGMCC NO.2.1525)，啤酒酵母 W303-1A和BY-2(均来自本实验室)进行了上述乳酸脱氢酶基因ldhL1的过表达，得到不同乳酸乙酯产生能力的改造菌株，发酵条件同实施例2，改造前的菌株发酵时在对数期添加改造后菌株同水平的乳酸进行发酵，测定菌株改造前后的产乳酸和乳酸乙酯的能力，结果如表4所示：

表4

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

结果说明，在不同的酿酒酵母中过表达乳酸脱氢酶，均可实现较出发菌株添加同水平乳酸时提高乳酸乙酯产量的结果。

实施例4：高产乳酸乙酯菌株的玉米水解液发酵实验

重组菌株和出发菌株分别同时进行玉米水解液发酵实验

2)工艺条件

3)配料：玉米粉1500g，水4500mL，静置放置20min，耐高温α-淀粉酶 2×10⁴U/mL，0.9ml，糖化酶1×10⁵U/mL，3mL。

4)培养基配置

发酵培养基：准备18°Brix玉米水解液，分装135mL于250mL三角瓶中， 105℃灭菌15min，晾至室温后加营养盐1mL(MgSO4 150g/L、KH2PO4 75g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)。

挑取出发酿酒酵母菌株ɑ、重组菌株P、重组菌株菌株P-CalB酵母细胞各一环，分别接入装有5mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24h，按10％接种量接种到装有45mL二级种子培养基的150mL三角瓶中，30℃静置培养16h 至对数期的后期，按10％接种量接种到玉米水解液发酵培养基，30℃静置发酵。每隔12h称重1次，当两次失重小于1g，发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样。测定CO₂累积排放量、酒精度和残还原糖等发酵性能指标以及产酯情况。

如表5所示，发酵5天后，重组菌株的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别，可见本例中的基因敲除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能有不利影响。

表5亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

5)酿酒酵母玉米水解液发酵参数的测定

表6亲本菌株和重组菌株的酸和醇的产量(单位g/L)

注：NF表示未检测出该物质。所示数据为三个平行试验结果的平均值。

由表6可知，敲除PDC1同时过表达ldhL1的重组菌中，其获得了一定的乳酸产生能力，保证为后续乳酸乙酯的产生提供足量的乳酸；与出发株CICC32315 相比，乙醇的产量没有显著下降。以Gal80作为整合位点，过表达南极假丝酵母 CalB基因，酸和醇的产量没有明显变化，乳酸含量为12.5g/L左右，乙醇的产量为70g/L左右，表明分子改造并没有明显影响其代谢性能，保证了产酒与产酸的同步。

6)气相色谱法测定酯和醇的产量

如表7所示，对酵母菌株进行产乳酸改造，酵母获得一定的乳酸乙酯产生能力，菌株P乳酸乙酯的产量达164.14mg/L；在此基础上，过表达南极假丝酵母 CalB基因，重组菌株P-CalB的乳酸乙酯产量得到提高，达210.25mg/L，与重组菌株P相比提高了近28％；重组菌株P-CalB主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量为162.06mg/L，较出发菌株降低了约37.02％，重组菌株 P主要高级醇含量为142.2mg/L，较出发菌株降低了约44.74％。

表7亲本菌株和重组菌株的高级醇和酯产量(单位mg/L)

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种产乳酸乙酯的酿酒酵母及其构建方法与应用

<130> 1

<141> 2018-05-18

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌()

<400> 1

atgccaaatc atcaaaaagt tgtgttagtc ggcgacggcg ctgttggttc tagttacgct 60

tttgccatgg cacaacaagg aattgctgaa gaatttgtaa ttgtcgatgt tgttaaagat 120

cggacaaagg gtgacgccct tgatcttgaa gacgcccaag cattcaccgc tcccaagaag 180

atttactcag gcgaatattc agattgtaag gacgctgact tagttgttat tacagccggt 240

gcgcctcaaa agcctggtga atcacgttta gacttagtta acaagaattt aaatatccta 300

tcatccattg tcaaaccagt tgttgactcc ggctttgacg gcatcttctt agttgctgct 360

aaccctgttg acatcttaac ttacgctact tggaaattct caggtttccc aaaggatcgt 420

gtcattggtt cagggacttc cttagactct tcacgtttac gcgttgcgtt aggcaaacaa 480

ttcaatgttg atcctcgttc cgttgatgct tacatcatgg gtgaacacgg tgattctgaa 540

tttgctgctt actcaactgc aaccatcggg acacgtccag ttcgcgatgt cgctaaggaa 600

caaggcgttt ctgacgaaga tttagccaag ttagaagacg gtgttcgtaa caaagcttac 660

gacatcatca acttgaaggg tgccacgttc tacggtatcg ggactgcttt aatgcggatt 720

tccaaagcca ttttacgtga tgaaaatgcc gttttaccag taggtgccta catggacggc 780

caatacggct taaacgacat ttatatcggg actccggctg tgattggtgg aactggtttg 840

aaacaaatca tcgaatcacc actttcagct gacgaactca agaagatgca agattccgcc 900

gcaactttga aaaaagtgct taacgacggt ttagctgaat tagaaaataa ataa 954

<210> 2

<211> 954

<212> DNA

<213> 南极假丝酵母()

<400> 2

ttgccatctg gttcagatcc cgctttctct cagccaaagt ctgtcttgga cgctggtttg 60

acttgccaag gtgcttcacc atcttctgtc tcaaagccta ttttgttggt ccccggtact 120

ggtactactg gtccacaatc ttttgattca aattggattc cattgtctac tcagttgggt 180

tacactccat gctggatttc tcctccacca ttcatgttga atgatactca agttaacact 240

gaatacatgg ttaacgctat tactgcattg tatgctggtt ctggtaataa taagttgcca 300

gtcttgactt ggtcacaagg tggtttggtc gcacaatggg gattaacctt ttttccatca 360

attaggtcta aggttgatcg tttgatggct ttcgctcccg attacaaggg tacagtcttg 420

gctggtccat tggatgcatt ggctgtttct gctccatctg tctggcaaca gacaactggt 480

tctgcattga ctactgcttt gaggaacgct ggtggtttga ctcaaattgt tccaactaca 540

aatttgtact ctgctacaga tgaaattgtt caacctcaag tttcaaattc acctttagat 600

tcttcatatt tgttcaatgg taagaacgtt caagctcaag ctgtttgcgg tccattgttc 660

gtcatagatc atgctggttc tttgacttct caattttctt atgttgttgg tagatcagct 720

ttgaggtcta ctactggtca agcaagatca gctgactacg gtattacaga ctgcaaccca 780

ttgcccgcta acgacttgac acccgaacag aaagtcgctg ctgctgcttt gttggctcca 840

gctgctgctg ctattgtcgc tggtccaaag cagaactgtg agcccgattt gatgccatac 900

gctagaccat tcgctgtcgg taagaggaca tgttctggta tagttacacc ataa 954

<210> 3

<211> 1479

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCICC32315)

<400> 3

tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60

gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120

cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180

tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240

catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300

ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360

tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420

ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480

agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540

accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600

cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660

attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720

tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaac 1479

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cgcggatccc gatagatcaa tttttttc 28

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcgtacgaag cttcagctgt aacgaacgca gaattttc 38

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gaaaattctg cgttcgttac agctgaagct tcgtacgctg c 41

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ctagtctaga gcataggcca ctagtggat 29

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cgggatccct tccgctttgc catt 24

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

acacaacttt ttgatgattt ggcattttga ttgatttgac tgtgttattt 50

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tatcagatcc actagtggcc tatgcacttt cccaaacaac acct 44

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ggaattccgt tggtagcagc agtc 24

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaatgcc aaatcatcaa aaagttg 47

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gaaaaaaatt gatctatcgt tatttatttt ctaattcagc 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gctgaattag aaaataaata acgatagatc aatttttttc 40

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

taccgtaggt gttgtttggg aaagtgcata ggccactagt ggat 44

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ctacttttta caacaaatat aaaacttgcc atctggttca gatc 44

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

tccccccggg ttatggtgta actataccag 30

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ccggaattct ctaactgatc tatccaaaac tga 33

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

aagcgggatc tgaaccagat ggcaataacg aacgcagaat tttc 44

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tcaagataca gaacctcctc 20

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ttcagttttg gatagatcag ttagacatta ggcacggttg a 41

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

taactcgaaa attctgcgtt cgttaaaatg gcggttggta c 41

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

gtggagccca tcatgttac 19

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

tcttcggtct caaccgtgcc taatgtctaa ctgatctatc caaaac 46

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

ttcgtagccg taccaaccgc catttgcata ggccactagt ggat 44

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

atcgtcgacc ccacacacca tagcttca 28

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

gcggtcgaca gcttgcaaat taaagcctt 29

Claims

1.一种酿酒酵母产乳酸乙酯的方法，其特征在于，通过在酿酒酵母出发菌株中过表达乳酸脱氢酶实现。

2.如权利要求1所述的一种提高酿酒酵母乳酸乙酯产量的方法，其特征在于，同时异源表达脂肪酶。

3.一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是以酿酒酵母为出发菌株，过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1所得。

4.如权利要求3所述的一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是以酿酒酵母为出发菌株，过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，同时异源过表达南极假丝酵母脂肪酶B所得。

5.如权利要求3或4所述的一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

6.如权利要求3或4所述的一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因ldhL1，其Gene ID为：1061886，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示。

7.如权利要求4所述的一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因ldhL1，其Gene ID为：1061886，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；所述南极假丝酵母脂肪酶B的表达基因为CalB，其Gene ID为515792，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示。

8.如权利要求3所述的一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，构建方法如下：以酿酒酵母为出发菌株，异源过表达乳酸脱氢酶基因ldhL1；所述乳酸脱氢酶ldhL1基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1实现的。

9.如权利要求4所述的一株产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，构建方法如下：

(1)产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

以酿酒酵母为出发菌株，异源过表达乳酸脱氢酶基因ldh L1；

所述乳酸脱氢酶ldh基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1实现的；

(2)过表达CalB产乳酸乙酯酵母菌株的构建

用强启动子PGK1_P对南极假丝酵母脂肪酶B在上述过表达乳酸脱氢酶基因ldh L1的菌株中进行异源表达；

所述南极假丝酵母脂肪酶B的异源过表达是通过替换转录调节因子Gal80基因实现的。

10.权利要求3或4所述的产乳酸乙酯酿酒酵母基因工程菌株的应用。