CN111073823B - 一种高产丁酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法与用途 - Google Patents

一种高产丁酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是构建一种高产丁酸乙酯酿酒酵母菌株的方法及其应用。通过在出发菌株中过表达乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10、3‑羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因Hbd、3‑羟基丁酰辅酶A脱水酶基因Crt、反式‑2‑烯酰辅酶A还原酶基因Ter、以及醇酰基转移酶基因AAT，以获得一株具有产丁酸乙酯能力的酵母菌株EST，与出发菌不产丁酸乙酯相比，其丁酸乙酯产量达到了77.33±3.79mg/L。在对Ter基因和AAT基因进行二拷贝表达后获得菌株EDST，丁酸乙酯的产量达到了99.65±7.32mg/L，与EST菌株相比产量提高了28.9％，同时还产生了40.93±3.18mg/L的巴豆酸乙酯，取得了预料不到的技术效果，为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景。

Description

一种高产丁酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法与用途
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高产丁酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法与用途。
背景技术：
中国白酒的主要成分是水和乙醇，二者在白酒中的比重高达97％-98％，其余的风味物质仅占2％-3％，然而随着风味化学的不断发展，人们发现正是这些含量极少的风味物质决定了白酒的香型与特征。在众多的微量成分中，酯是最重要的一类化合物，具有令人愉悦的果香味，适量的酯能够增加酒的风味。对于中国白酒而言,乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯是我国白酒的四大主要香气成分,直接决定了白酒产品质量。丁酸乙酯作为白酒的四大香气成分之一，具有类似猕猴桃、菠萝果香气味，是浓香型白酒中老窖香气成分之一，此外，丁酸乙酯还广泛应用于日化香精、食用香精配方中，可调配多种果香型及其他香型的香精。
酿酒酵母虽具有极强的酒精发酵效率，但由于其自身缺乏相应的酰基辅酶A，以及缺乏特异性强的醇酰基转移酶，因而产酯能力低。虽然从20世纪60年代开始，许多企业采用添加产酯酵母使其与酿酒酵母共发酵或者延长发酵期和窖藏时间等方式以改进白酒香气不足和后味较淡的缺点。然而这些方法在提高酯产量的同时，增加了人力和物力的消耗，延长发酵期还带来了糠嗅味、涩味、酸味等异味物质。另外，酿酒酵母是酿酒工业的核心，其性能好坏直接关系到酒的质量和生产成本。
在发酵过程中，丁酸乙酯主要由丁酸菌产生的丁酸和酿酒酵母产生的乙醇在酯化酶的作用下生成，而酿酒酵母自身几乎不产丁酸乙酯，同时也不具有生产丁酸乙酯的代谢途径，因此无法直接利用酿酒酵母生产丁酸乙酯。
发明内容
本发明的目的是解决酿酒酵母在酒类生产中不合成丁酸乙酯的问题，提供一种产丁酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法。具体是在酵母菌中构建一条丁酰辅酶A生成途径使酿酒酵母产生丁酰辅酶A；进而在此基础上向酿酒酵母中引入一种高效的醇酰基转移酶，从而构建完整的丁酸乙酯途径，实现丁酸乙酯的产生。进一步地，对丁酸乙酯生产途径中的关键酶基因进行二拷贝表达，使得丁酸乙酯产量获得大幅提升。
为了解决上述问题，本发明的第一个目的提供一种高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，所述菌株以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，同时过表达3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因Hbd、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因Crt、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter，同时过表达醇酰基转移酶基因AAT构建而成。
优选地，所述基因Ter为单拷贝表达或双拷贝表达；所述基因AAT为单拷贝表达或双拷贝表达。
优选地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase)Erg10基因来源于酿酒酵母。
更优选地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，其Gene ID为：856079，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase)基因Hbd来源于丙酮丁醇梭菌。
更优选地，所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因Hbd，其Gene ID为：1118891，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(3-hydroxybutyryl-CoAdehydratase)Crt来源于丙酮丁醇梭菌。
更优选地，所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因Crt，其Gene ID为：1118895，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因(trans-2-enoyl-CoA reductase)Ter来源于密螺旋体。
更优选地，所述反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter，其Gene ID为：2741560，所述基因Ter经过酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述醇乙酰基转移酶基因(alcohol acyltransferase)AAT来源于草莓(NCBI公开的名称为Fragaria x ananassa)。
更优选地，所述醇乙酰基转移酶基因AAT，其protein_ID为AAG13130.1，所述基因AAT经酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:5所示。
优选地，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315；
所述过表达乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，目的是由乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。
所述异源过表达3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因Hbd，目的是由乙酰乙酰辅酶A合成3-羟基丁酰辅酶A。
所述异源过表达3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因Crt，目的是由3-羟基丁酰辅酶A合成巴豆酰辅酶A。
所述异源过表达反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter，目的是由巴豆酰辅酶A合成丁酰辅酶A。
所述异源过表达醇酰基转移酶基因AAT的目的是为了引入醇酰基转移酶，从而构建完整的丁酸乙酯途径，实现丁酸乙酯的产生。
所述对途径中基因Ter或基因AAT中至少一个基因为双拷贝表达，是由于在丁酰辅酶A合成途径中Ter活性远低于该途径中其他酶活性，且AAT催化丁酸乙酯合成的关键最后一步，也有可能会限制丁酸乙酯的产生，故而对Ter和AAT基因进行二拷贝，从而显著提高酿酒酵母的丁酸乙酯的产量。
本发明的第二个目的是提供上述高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，通过强启动子过表达所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，同时所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因Hbd和3-羟基丁酰辅酶A脱水酶编码基因Crt通过串联共同替换基因GAL80，并通过强启动子分别进行异源过表达基因Hbd和基因Crt；同时所述反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter和所述醇乙酰基转移酶基因AAT通过串联共同替换基因HXT16，并通过强启动子分别进行异源过表达基因Ter和基因AAT。
优选地，所述基因Ter或基因AAT中至少一个基因为双拷贝表达。
更优选地，所述密螺旋体反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter的二拷贝异源表达是通过替换基因LPP1，并通过强启动子异源过表达实现。
更优选地，所述醇乙酰基转移酶基因AAT的二拷贝异源表达是通过替换基因KU70，并通过强启动子异源过表达实现。
优选地，所述强启动子为PGK1P。
所述强启动子PGK1P其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述基因GAL80，其Gene ID为：854954，来源于酿酒酵母。
所述基因HXT16，其Gene ID为：853623，来源于酿酒酵母。
所述基因KU70，其Gene ID为：855328，来源于酿酒酵母。
所述基因LPP1，其Gene ID为：852114，来源于酿酒酵母。
优选地，高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，如下步骤：
(1)以酿酒酵母菌株的单倍体作为出发菌株，以Erg10为整合位点，将基因Erg10的上游同源臂FA、PGK1p-Erg10-PGK1t片段、KanMX基因、基因Erg10的下游同源臂FB按顺序依次连接并插入到整合位点上，同源重组后再用pGAP质粒去除基因KanMX，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株；
(2)同时以基因GAL80为整合位点，将基因GAL80的上游同源臂FA、PGK1p-Hbd-PGK1t片段、KanMX基因、PGK1p-Crt-PGK1t片段、基因GAL80的下游同源臂FB，按顺序依次连接并插入到整合位点上，同源重组后再用pGAP质粒去除基因KanMX，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株；
(3)同时以基因HXT16为整合位点，将基因HXT16的上游同源臂FA、PGK1p-Ter-PGK1t片段、KanMX基因、PGK1p-AAT-PGK1t片段以及基因HXT16的下游同源臂FB按顺序依次连接并插入到整合位点上，同源重组后再用pGAP质粒去除基因KanMX，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株。
优选地，所述步骤(1)中，酿酒酵母菌株的单倍体为α型单倍体。
更优选地，对所述构建方法获得的重组菌株进行基因Ter和基因AAT中至少一个基因的二拷贝构建。
更优选地，所述基因Ter的二拷贝构建步骤如下：
以所述步骤(3)获得的重组菌株为出发菌株，以LPP1基因为整合位点，将基因LPP1的上游同源臂FA、PGK1p-Ter-PGK1t片段、KanMX基因、基因LPP1的下游同源臂FB按照顺序依次连接并插入到整合位点上，同源重组后，用pGAP质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株。
更优选地，所述基因AAT的二拷贝构建步骤如下：
以所述步骤(3)获得的重组菌株为出发菌株，以KU70基因为插入位点，将KU70基因的上游同源臂FA、PGK1p-AAT-PGK1t片段、KanMX基因以及KU70基因的下游同源臂FB按照顺序依次连接并插入到整合位点上，同源重组后用pGAP质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株。
本发明的第三个目的是提供所述高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株的用途。
优选地，所述酿酒酵母基因工程菌株在发酵酿造、发酵食品、香精香料领域中高产丁酸乙酯中的用途。
优选地，所述酿酒酵母基因工程菌株的发酵步骤如下：
将酿酒酵母基因工程菌经过两级活化后，将种子液按接种量8-12％接种于发酵培养基，28-30℃静置发酵80-86h。
所述在发酵后期，每隔12h称重1次，当两次失重小于1g，即确定发酵结束。
优选地，所述发酵培养基组成为：玉米粉300-320g/L，耐高温α-淀粉酶为(3-4)×104U/L，糖化酶90-100U/L，酸性蛋白酶10-20U/L，营养盐溶液5.5-5.6mL/L，余量为水；所述营养盐溶液组成为：MgSO4 140-160g/L，KH2PO4 70-80g/L，尿素80-85g/L，余量为水。
优选地，所述酿酒酵母的两级活化条件为：首先将酿酒酵母基因工程菌接入一级种子培养基中，28-30℃静置培养24h，得到一种种子液，将所述一种种子液按照接种量8-12％接种于二级种子培养基中，28-30℃静置培养至对数期的后期，即15-18h，得到二级种子液。
更优选地，所述一级种子培养基组成为：玉米粉80-85g/L，耐高温α-淀粉酶添加量约为(0.5-1.0)×104U/L，糖化酶酶活约为30-35U/L，余量为水，糖度为8°BX。
更优选地，所述二级种子培养基组成为：玉米粉约120-130g/L，耐高温α-淀粉酶添加量约为(1.0-2.0)×104U/L，糖化酶酶活约为45-55U/L，余量为水，糖度为12°BX。
有益效果：
1、本发明所述技术内容为调控酒类产品中风味物质提供了新的途径，通过引入外源丁酰辅酶A合成途径以及引入一种能将酰基辅酶A与乙醇合成相应乙基酯的高效醇酰基转移酶，构建出一株高产丁酸乙酯的酿酒酵母菌株，克服了普通酿酒酵母不能生成丁酸乙酯而导致风味物质不协调的缺点，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时高产丁酸乙酯。相较于不能产丁酸乙酯的野生型酿酒酵母菌，该菌株的丁酸乙酯产量达到了99.65±7.32mg/L，达到了高产丁酸乙酯的目的，且有40.93±3.18mg/L的巴豆酸乙酯生成(巴豆酰辅酶A为丁酰辅酶A前体物)，为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景，对于白酒产品风味特征的维持与强化，对于质量的提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都将具有重要意义。
2、本发明提供的产丁酸乙酯的酿酒酵母菌株是在保持优良发酵性能的前提下，为解决白酒生产中酯类不协调提供了解决思路，而且具有重要的市场价值。
附图说明
图1为在酿酒酵母构建的丁酸乙酯合成途径代谢图；
图2为重组质粒Yep352-PE/PH/PC/PT/PA的构建流程示意图；
图3为构建重组质粒Yep352-PE/PH/PC/PT/PA的验证电泳图；
(a)图中泳道1为Yep352-P质粒；泳道2为Yep352-PE；泳道3为Erg10基因片段；泳道4为10000bp DNA Ladder Marker；(b)图中泳道1为Yep352-P质粒；泳道2为Yep352-PA；泳道3为AAT基因片段；泳道4为10000bp DNA Ladder Marker；(c)图中泳道1为Yep352-P质粒；泳道2为Yep352-PT；泳道3为Ter基因片段；泳道4为10000bp DNA Ladder Marker；(d)图中泳道1为Yep352-P质粒；泳道2为Yep352-PH；泳道3为Hbd基因片段；泳道4为10000bp DNALadder Marker；(e)图中泳道1为Yep352-P质粒；泳道2为Yep352-PC；泳道3为Crt基因片段；泳道4为10000bp DNA Ladder Marker；
图4为在Erg10处过表达Erg10基因的重组酿酒酵母菌株构建示意图；
图5为在GAL80处过表达Hbd基因和Crt基因的重组酿酒酵母菌株构建示意图；
图6为在HXT16处过表达Ter基因和AAT基因的重组酿酒酵母菌株构建示意图；
图7为在LPP1处二拷贝Ter基因的重组酿酒酵母菌株构建示意图；
图8为在KU70处二拷贝AAT基因的重组酿酒酵母菌株构建示意图；
图9为各菌株构建的验证电泳图
(a)泳道1为5000bp DNA Ladder Marker；泳道2为以重组菌株基因组为模板，Erg10-FA-U/Erg10-D为引物的验证片段；泳道3为以重组菌株基因组为模板，Erg10-U/KAN-D为引物的验证片段；泳道4为以重组菌株基因组为模板，KAN-U/Erg10-FB-D为引物的验证片段；(b)泳道1为5000bp DNA Ladder Marker；泳道2为以重组菌株基因组为模板，HXT16-FA-U/Ter-D为引物的验证片段；泳道3为以重组菌株基因组为模板，Ter-U/KAN-D为引物的验证片段；泳道4为以重组菌株基因组为模板，KAN-U/AAT-D为引物的验证片段；泳道5为以重组菌株基因组为模板，AAT-U/HXT16-FB-D为引物的验证片段；(c)泳道1为5000bp DNALadder Marker；泳道2为以重组菌株基因组为模板，GAL80-FA-U/Hbd-D为引物的验证片段；泳道3为以重组菌株基因组为模板，Hbd-U/KAN-D为引物的验证片段；泳道4为以重组菌株基因组为模板，KAN-U/Crt-D为引物的验证片段；泳道5为以重组菌株基因组为模板，Crt-U/GAL80-FB-D为引物的验证片段；(d)泳道1为5000bp DNA Ladder Marker；泳道2为以重组菌株基因组为模板，LPP1-FA-U/Ter-D为引物的验证片段；泳道3为以重组菌株基因组为模板，Ter-U/KAN-D为引物的验证片段；泳道4为以重组菌株基因组为模板，KAN-U/LPP1-FB-D为引物的验证片段；(e)泳道1为5000bp DNA Ladder Marker；泳道2为以重组菌株基因组为模板，KU70-FA-U/AAT-D为引物的验证片段；泳道3为以重组菌株基因组为模板，AAT-U/KAN-D为引物的验证片段；泳道4为以重组菌株基因组为模板，KAN-U/KU70-FB-D为引物的验证片段；(f)泳道1为5000bpDNA Ladder Marker；泳道2为以重组菌株为模板，KU70-FA-U/AAT-D为引物的验证片段；泳道3为以重组菌株基因组为模板，AAT-U/KAN-D为引物的验证片段；泳道4为以重组菌株基因组为模板，KAN-U/KU70-FB-D为引物的验证片段。
图10为亲本菌株与各阶段酿酒酵母改造菌株的丁酸乙酯及巴豆酸乙酯产量实验结果图。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，以下实施例所使用的酵母菌株均为酿酒酵母CICC32315的α单倍体(AY14-α)。
首先将酵母本身Erg10基因进行过表达(参照图1)，并将来自丙酮丁醇梭菌的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(Hbd)和3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(Crt)以及来自密螺旋体的反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因(Ter)在酿酒酵母中进行异源过表达，构建具有丁酰辅酶A生成途径的酵母菌株ET；其次，将草莓醇酰基转移酶基因AAT在上述菌株ET中进行异源整合强表达，得到产丁酸乙酯的酵母菌株EST；之后，在EST菌株基础上分别对Ter基因和AAT基因进行二拷贝表达，获得单独二拷贝基因Ter的菌株EDT和单独二拷贝AAT的菌株EDS。最后，在单独二拷贝基因Ter的菌株EDT基础上二拷贝AAT，获得同时二拷贝基因Ter和AAT的菌株EDST。
实施例1：产丁酸乙酯酿酒酵母菌株的构建
本实例所用的出发菌株CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％(质量百分比)进口琼脂粉。
根据NCBI Genebank中的各基因序列和整合质粒序列，设计了下述引物，如表1。
表1引物
Figure BDA0002341298200000071
Figure BDA0002341298200000081
本实施例中所用的PCR扩增体系如表2所示。
表2的PCR扩增体系
Figure BDA0002341298200000091
菌株主要构建过程如下：
(1)Yep352-PE/PH/PC/PT/PA质粒的构建
以Yep352-P为基础质粒，构建携带有基因Erg10、Hbd、Crt、Ter、AAT的重组质粒，简称为重组质粒Yep352-PE、Yep352-PH、Yep352-PC、Yep352-PT、Yep352-PA(简称为Yep352-PE/PH/PC/PT/PA)，构建流程如图2所示，验证电泳图如图3所示。以酿酒酵母CICC32315的α型单倍体基因组为模板，使用引物对P-Erg10-U(SEQ ID NO:7)和P-Erg10-D(SEQ ID NO:8)PCR扩增获得1197bp的Erg10片段；使用引物对P-Hbd-U(SEQ ID NO:9)和P-Hbd-D(SEQ IDNO:10)PCR扩增获得849bp的Hbd片段；使用引物对P-Crt-U(SEQ ID NO:11)和P-Crt-D(SEQID NO:12)PCR扩增获得786bp的Crt片段；使用引物对P-Ter-U(SEQ ID NO:13)和P-Ter-D(SEQ ID NO:14)PCR扩增获得1194bp的Ter片段；使用引物对P-AAT-U(SEQ ID NO:15)和P-AAT-D(SEQ ID NO:16)PCR扩增获得1359bp的AAT片段；用限制性内切酶XhoⅠ对Yep352-P进行酶切，用Lightening Cloning Kit将酶切后质粒分别与上述PCR得到的五个基因片段进行重组连接，分别得到重组质粒Yep352-PE、Yep352-PH、Yep352-PC、Yep352-PT、Yep352-PA。
其中，质粒Yep352-P及其构建方法来源于公开号为CN105586282A专利《一种高产风味乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法》，Yep352-P是以质粒pPGK1为模板，扩增其上的强启动子片段PGK1p-PGK1t，并连接到表达载体上Yep352上，得到质粒Yep352-P。
(2)产丁酸乙酯酵母菌株的构建
①以CICC32315酵母α型单倍体菌株(下文简称为AY14-ɑ)的基因组为模板，使用引物对Erg10-FA-U(SEQ ID NO:17)和Erg10-FA-D(SEQ ID NO:18)PCR扩增得到Erg10位点的上同源臂Erg10-FA；使用引物对Erg10-FB-U(SEQ ID NO:19)和Erg10-FB-D(SEQ ID NO:20)PCR扩增得到Erg10位点的下同源臂Erg10-FB；以重组质粒Yep352-PE为模板，使用引物对PGK1p-U(SEQ ID NO:49)和PGK1t-D(SEQ ID NO:50)PCR扩增获得带有强启动子和终止子的PGK1p-Erg10-PGK1t片段；以pUG6质粒为模板，使用引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KAN-D(SEQ ID NO:24)PCR扩增获得筛选标记KanMX。
以酿酒酵母菌株AY14-ɑ作为出发菌株，以Erg10为整合位点，将以上PCR获得的四个片段Erg10-FA、Erg10-FB、PGK1p-Erg10-PGK1t、KanMX用醋酸锂转化法同时转化入酿酒酵母CICC32315生孢分离获得的α型单倍体中，并按顺序依次连接并插入到整合位点上，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株1。同源重组过程图如图4。
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组上、下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。以引物对Erg10-FA-U(SEQ ID NO:17)和Erg10-D(SEQ ID NO:22)为上游验证引物；以引物对Erg10-U(SEQ ID NO:21)和KAN-D(SEQ ID NO:24)为中游验证引物；以引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和Erg10-FB-D(SEQ ID NO:20)为下游验证引物。转化子验证琼脂凝胶电泳图如图9(a)所示，泳道2为上游验证条带，条带大小3100bp左右，与预期一致；泳道3为中游验证条带，条带大小3300bp左右，与预期大小一致；泳道4为下游验证条带，条带大小2100bp左右，与预期大小一致。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以重组菌株1的基因组为对照扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株1则能扩增得到该片段，则获得丢掉筛选标记KanMX的重组菌株2。将重组菌株2接到YPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株3。
②以AY14-ɑ的基因组为模板，使用引物对GAL80-FA-U(SEQ ID NO:25)和GAL80-FA-D(SEQ ID NO:26)PCR扩增得到GAL80位点的上同源臂GAL80-FA；使用引物对GAL80-FB-U(SEQ ID NO:27)和GAL80-FB-D(SEQ ID NO:28)PCR扩增得到GAL80位点的下同源臂GAL80-FB；以重组质粒Yep352-PH和Yep352-PC为模板，使用引物对PGK1p-U(SEQ ID NO:49)和PGK1t-D(SEQ ID NO:50)分别PCR扩增获得带有强启动子和终止子的PGK1p-Hbd-PGK1t和PGK1p-Crt-PGK1t片段；以pUG6质粒为模板，使用引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KAN-D(SEQID NO:24)PCR扩增获得筛选标记KanMX。
以基因GAL80为整合位点，将以上PCR获得的五个片段GAL80-FA、PGK1p-Hbd-PGK1t和PGK1p-Crt-PGK1t、KanMX、GAL80-FB用醋酸锂转化法同时转化入重组菌株3中，按顺序依次连接并插入到整合位点上，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株4。同源重组过程图如图5。
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计四组验证，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。以引物对GAL80-FA-U(SEQ ID NO:25)和Hbd-D(SEQ ID NO:30)为上游验证引物；以引物对Hbd-U(SEQ ID NO:29)和KAN-D(SEQ ID NO:24)为中游验证引物；以引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和Crt-D(SEQ ID NO:32)为中游验证引物；以引物对Crt-U(SEQ ID NO:31)和GAL80-FB-D(SEQ ID NO:28)为下游验证引物。转化子验证琼脂凝胶电泳图如图9(c)所示，泳道2为上游验证条带，条带大小2700bp左右，与预期一致；泳道3为中游验证条带，条带大小3000bp左右，与预期大小一致；泳道4为中游验证条带，条带大小5000bp左右，与预期大小一致；泳道5为下游验证条带，条带大小1500bp左右，与预期大小一致。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株4中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以重组菌株4的基因组为对照扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株4则能扩增得到该片段，则获得丢掉筛选标记KanMX的重组菌株5。将重组菌株5接到YPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株6。
③以AY14-ɑ的基因组为模板，使用引物对HXT16-FA-U(SEQ ID NO:33)和HXT16-FA-D(SEQ ID NO:34)PCR扩增得到HXT16位点的上同源臂HXT16-FA；使用引物对HXT16-FB-U(SEQ ID NO:35)和HXT16-FB-D(SEQ ID NO:36)PCR扩增得到HXT16位点的下同源臂HXT16-FB；以重组质粒Yep352-PT和Yep352-PA为模板，使用引物对PGK1p-U(SEQ ID NO:49)和PGK1t-D(SEQ ID NO:50)分别PCR扩增获得带有强启动子和终止子的PGK1p-Ter-PGK1t和PGK1p-AAT-PGK1t片段；以pUG6质粒为模板，使用引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KAN-D(SEQID NO:24)PCR扩增获得筛选标记KanMX。
以基因HXT16为整合位点，将以上PCR获得的五个片段HXT16-FA、PGK1p-Ter-PGK1t和PGK1p-AAT-PGK1t、KanMX、HXT16-FB用醋酸锂转化法同时转化入重组菌株6中，按顺序依次连接并插入到整合位点上，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株7。同源重组过程图如图6。
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计四组验证，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。以引物对HXT16-FA-U(SEQ ID NO:33)和Ter-D(SEQ ID NO:38)为上游验证引物；以引物对Ter-U(SEQ ID NO:37)和KAN-D(SEQ ID NO:24)为中游验证引物；以引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和AAT-D(SEQ ID NO:40)为中游验证引物；以引物对AAT-U(SEQ ID NO:39)和HXT16-FB-D(SEQ ID NO:36)为下游验证引物。转化子验证琼脂凝胶电泳图如图9(b)所示，泳道2为上游验证条带，条带大小2700bp左右，与预期一致；泳道3为中游验证条带，条带大小3000bp左右，与预期大小一致；泳道4为中游验证条带，条带大小5100bp左右，与预期大小一致；泳道5为下游验证条带，条带大小2100bp左右，与预期大小一致。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株7中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以重组菌株7的基因组为对照扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株7则能扩增得到该片段，则获得丢掉筛选标记KanMX的重组菌株8。将重组菌株8接到YPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株9(即获得酵母菌株EST)。
(3)单独二拷贝基因Ter
以AY14-ɑ的基因组为模板，使用引物对LPP1-FA-U(SEQ ID NO:41)和LPP1-FA-D(SEQ ID NO:42)PCR扩增得到LPP1位点的上同源臂LPP1-FA；使用引物对LPP1-FB-U(SEQ IDNO:43)和LPP1-FB-D(SEQ ID NO:44)PCR扩增得到LPP1位点的下同源臂LPP1-FB；以重组质粒Yep352-PT为模板，使用引物对PGK1p-U(SEQ ID NO:49)和PGK1t-D(SEQ ID NO:50)PCR扩增获得带有强启动子和终止子的PGK1p-Ter-PGK1t片段；以pUG6质粒为模板，使用引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KAN-D(SEQ ID NO:24)PCR扩增获得筛选标记KanMX。
以LPP1基因为整合位点，将以上PCR获得的四个片段LPP1-FA、PGK1p-Ter-PGK1t、KanMX、LPP1-FB用醋酸锂转化法同时转化入重组菌株9中，按照顺序依次连接并插入到整合位点上，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株10。同源重组过程图如图7。
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组验证，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。以引物对LPP1-FA-U(SEQ ID NO:41)和Ter-D(SEQ ID NO:38)为上游验证引物；以引物对Ter-U(SEQ ID NO:37)和KAN-D(SEQ ID NO:24)为中游验证引物；以引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和LPP1-FB-D(SEQ ID NO:44)为下游验证引物。转化子验证琼脂凝胶电泳图如图9(d)所示，泳道2为上游验证条带，条带大小3000bp左右，与预期一致；泳道3为中游验证条带，条带大小3100bp左右，与预期大小一致；泳道4为下游验证条带，条带大小2100bp左右，与预期大小一致。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株10中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以重组菌株10的基因组为对照扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株10则能扩增得到该片段，则获得丢掉筛选标记KanMX的重组菌株11。将重组菌株11接到YPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株12。(即获得酵母菌株EDT)
(4)单独二拷贝AAT基因
以AY14-ɑ的基因组为模板，使用引物对KU70-FA-U(SEQ ID NO:45)和KU70-FA-D(SEQ ID NO:46)PCR扩增得到KU70位点的上同源臂KU70-FA；使用引物对KU70-FB-U(SEQ IDNO:47)和KU70-FB-D(SEQ ID NO:48)PCR扩增得到KU70位点的下同源臂KU70-FB；以重组质粒Yep352-PA为模板，使用引物对PGK1p-U(SEQ ID NO:49)和PGK1t-D(SEQ ID NO:50)PCR扩增获得带有强启动子和终止子的PGK1p-AAT-PGK1t片段；以pUG6质粒为模板，使用引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KAN-D(SEQ ID NO:24)PCR扩增获得筛选标记KanMX。
以KU70基因为插入位点，将以上PCR获得的四个片段KU70-FA、PGK1p-AAT-PGK1t、KanMX、KU70-FB用醋酸锂转化法同时转化入重组菌株9中，按照顺序依次连接并插入到整合位点上，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株13。同源重组过程图如图8。
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计四组验证，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。以引物对KU70-FA-U(SEQ ID NO:45)和AAT-D(SEQ ID NO:40)为上游验证引物；以引物对AAT-U(SEQ ID NO:39)和KAN-D(SEQ ID NO:24)为中游验证引物；以引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KU70-FB-D(SEQ ID NO:48)为下游验证引物。转化子验证琼脂凝胶电泳图如图9(e)所示，泳道2为上游验证条带，条带大小3300bp左右，与预期一致；泳道3为中游验证条带，条带大小3100bp左右，与预期大小一致；泳道4为下游验证条带，条带大小2100bp左右，与预期大小一致。(即获得菌株EDS)
(5)同时二拷贝Ter基因和AAT基因
以KU70基因为插入位点，将PCR获得的四个片段KU70-FA、PGK1p-AAT-PGK1t、KanMX、KU70-FB(片段获得方式同(4)单独二拷贝AAT基因的方法)用醋酸锂转化法同时转化入重组菌株12((3)单独二拷贝基因Ter制备的菌株)中，按照顺序依次连接并插入到整合位点上，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株14。同源重组过程图如图8。
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计四组验证，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。以引物对KU70-FA-U(SEQ ID NO:45)和AAT-D(SEQ ID NO:40)为上游验证引物；以引物对AAT-U(SEQ ID NO:39)和KAN-D(SEQ ID NO:24)为中游验证引物；以引物对KAN-U(SEQ ID NO:23)和KU70-FB-D(SEQ ID NO:48)为下游验证引物。转化子验证琼脂凝胶电泳图如图9(f)所示，泳道2为上游验证条带，条带大小3300bp左右，与预期一致；泳道3为中游验证条带，条带大小3100bp左右，与预期大小一致；泳道4为下游验证条带，条带大小2100bp左右，与预期大小一致。即获得菌株EDST。
实施例2：出发菌株以及改造菌株的玉米原料浓醪发酵实验
(1)重组菌株EST、EDT、EDS以及EDST与亲本菌株(AY14-ɑ)的玉米原料浓醪发酵实验
将亲本菌株AY14-ɑ及重组菌株EST、EDT、EDS以及EDST分别同时进行玉米浓醪发酵实验，发酵工艺路线图：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；
分别挑取一环酵母细胞，分别接入装有5mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24h，按10％接种量接种到装有45mL二级种子培养基的150mL三角瓶中，30℃静置培养16h至对数期的后期，按10％接种量接种到发酵培养基，30℃静置发酵。每隔12h称重1次，当两次失重小于1g，发酵结束，即发酵84h发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样。测定CO2累积排放量、酒精度和残还原糖等发酵性能指标，结果如表3。
其中，一级种子培养基组成为：玉米粉82g/L，耐高温α-淀粉酶添加量约为1.0×104U/L，糖化酶酶活约为32U/L，余量为水，糖度为8°BX。
二级种子培养基组成为：玉米粉约125g/L，耐高温α-淀粉酶添加量约为1.5×104U/L，糖化酶酶活约为50U/L，余量为水，糖度为12°BX。
发酵培养基组成为：玉米粉315g/L，耐高温α-淀粉酶为3.5×104U/L，糖化酶95U/L，酸性蛋白酶15U/L，营养盐溶液5.5-5.6mL/L，余量为水；所述营养盐溶液组成为：MgSO4150g/L，KH2PO4 75g/L，尿素81g/L，余量为水，经过滤后，4℃保存。
发酵培养基的处理工艺条件：
浸泡条件：将玉米粉于60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，按照上述比例加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min，加入营养盐溶液和酸性蛋白酶，30℃反应20min，得到发酵培养基。
表3亲本菌株与重组菌株发酵性能对比
Figure BDA0002341298200000151
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
通过表3以及参照附图10，可以看出，重组菌株EST、EDT、EDS以及EDST发酵后的酒精含量和残糖含量与出发菌株AY14-α相比没有明显差别，由此说明改造菌株的生长与发酵性能未产生明显改变。
(2)GC-MS测定酯的产量
将由上述(1)重组菌株EST、EDT、EDS以及EDST与亲本菌株(AY14-α)的玉米原料浓醪发酵实验中最终获得的100mL酒样，进行丁酸乙酯及巴豆酸乙酯产量的测定。
测定方法：设定气相色谱仪的条件GC条件：色谱柱HP-5MS，60m×0.32mm×0.25μm石英毛细管柱；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气，流速1mL/min；柱温起始为40℃，保持3min，以9/min℃升至116℃，保持4min，再以9/min℃升至260℃，保持5min；不分流进样。质谱仪条件：离子源为EI源，离子源温度230℃，电子能量70eV，四极杆温度150℃，接口温度280℃，电子倍增器电压1280V，扫描范围m/z为40～450u。
测得重组菌株EST、EDT、EDS以及EDST与原菌株AY14-α的丁酸乙酯及巴豆酸乙酯产量如表4所示。
表4亲本菌株和重组菌株的酯产量(单位mg/L)
Figure BDA0002341298200000152
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
表3和表4中，AY14-α为原始菌株，EST为过表达基因Erg10、Hbd、Crt、Ter、AAT的菌株，EDS为在EST基础上只二拷贝AAT的菌株；EDT为在EST基础上只二拷贝Ter的菌株；EDST为在EST基础上二拷贝AAT和Ter的菌株。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种高产丁酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法与用途
<130> 1
<141> 2019-12-27
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1197
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 CICC32315()
<400> 1
atgtctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagaaccc caattggttc attccagggt 60
tctctatcct ccaagacagc agtggaattg ggtgctgttg ctttaaaagg cgccttggct 120
aaggttccag aattggatgc atccaaggat tttgacgaaa ttatttttgg taacgttctt 180
tctgccaatt tgggccaagc tccggccaga caagttgctt tggctgccgg tttgagtaat 240
catatcgttg caagcacagt taacaaggtc tgtgcatccg ctatgaaggc aatcattttg 300
ggtgctcaat ccatcaaatg tggtaatgct gatgttgtcg tagctggtgg ttgtgaatct 360
atgactaacg caccatacta catgccagca gcccgtgcgg gtgccaaatt tggccaaact 420
gttcttgttg atggtgtcga aagagatggg ttgaacgatg cgtacgatgg tctagccatg 480
ggtgtacacg cagaaaagtg tgcccgtgat tgggatatta ctagagaaca acaagacaat 540
tttgccatcg aatcctacca aaaatctcaa aaatctcaaa aggaaggtaa attcgacaat 600
gaaattgtac ctgttaccat taagggattt agaggtaagc ctgatactca agtcacgaag 660
gacgaggaac ctgctagatt acacgttgaa aaattgagat ctgcaaggac tgttttccaa 720
aaagaaaacg gtactgttac tgccgctaac gcttctccaa tcaacgatgg tgctgcagcc 780
gtcatcttgg tttccgaaaa agttttgaag gaaaagaatt tgaagccttt ggctattatc 840
aaaggttggg gtgaggccgc tcatcaacca gctgatttta catgggctcc atctcttgca 900
gttccaaagg ctttgaaaca tgctggcatc gaagacatca attctgttga ttactttgaa 960
ttcaatgaag ccttttcggt tgtcggtttg gtgaacacta agattttgaa gctagaccca 1020
tctaaggtta atgtatatgg tggtgctgtt gctctaggtc acccattggg ttgttctggt 1080
gctagagtgg ttgttacact gctatccatc ttacagcaag aaggaggtaa gatcggtgtt 1140
gccgccattt gtaatggtgg tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa gatatga 1197
<210> 2
<211> 849
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌()
<400> 2
atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt 60
gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga 120
ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct 180
actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240
tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct 300
gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca 360
ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga cctgataagg ttataggtat gcatttcttt 420
aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa 480
acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540
gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt 600
atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct 660
aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct 720
ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt 780
aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat 840
tcaaaataa 849
<210> 3
<211> 786
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌()
<400> 3
atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac 60
agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata 120
ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180
tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240
aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta 300
atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat 360
ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca 420
cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag 480
cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat 540
aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg 600
agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt 660
gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag 720
gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat 780
agatag 786
<210> 4
<211> 1194
<212> DNA
<213> 密螺旋体()
<400> 4
atgattgtta agccaatggt tagaaacaac atttgtttga atgctcatcc acaaggttgc 60
aagaagggtg tcgaagacca gattgagtac actaagaaac gtattacagc tgaagtcaag 120
gctggtgcta aggctcctaa gaatgtttta gttttgggtt gttctaatgg ttacggtttg 180
gcatctagaa ttactgctgc tttcggttac ggagctgcta ctattggtgt ttcattcgaa 240
aaagctggtt cagaaacaaa atatggtaca cccggttggt ataataactt agctttcgat 300
gaggctgcta agagggaagg tttgtactca gttacaattg atggtgatgc tttctctgat 360
gagattaagg ctcaagttat tgaagaagct aagaagaaag gtattaagtt cgatttaatt 420
gtctactcat tggcttctcc agttcgtact gatccagata ctggtataat gcataaatct 480
gtcttgaaac cttttggtaa gacttttact ggtaaaactg tcgatccttt cactggtgaa 540
ttgaaagaaa tttctgctga acccgctaac gacgaggaag ctgctgctac agtcaaggtc 600
atgggtggtg aggattggga aagatggatt aaacaattgt ctaaagaagg tttgttggaa 660
gaaggatgta ttactttggc ttactcttac attggtcccg aagcaactca agctttgtac 720
agaaagggta caattggaaa ggctaaagag cacttggagg caactgcaca cagattgaat 780
aaagagaatc cttctattag agcatttgtt tctgttaata aaggtttagt tacaagagct 840
tctgctgtca ttcccgttat tccattgtat ttagcatctt tattcaaagt tatgaaagaa 900
aaaggtaacc atgagggttg tattgaacaa attactagat tgtacgctga aagattgtac 960
agaaaagatg gtactattcc agtcgatgaa gaaaatagaa ttagaattga tgattgggaa 1020
ttggaagaag atgtccaaaa agcagtttct gctttgatgg aaaaggttac tggtgaaaat 1080
gctgaatctt taacagattt agctggttat agacatgatt tcttggcatc taatggtttc 1140
gatgttgaag gtattaatta cgaagctgaa gttgaaagat ttgatagaat ataa 1194
<210> 5
<211> 1359
<212> DNA
<213> 草莓(Fragaria x ananassa)
<400> 5
atggaaaaaa ttgaagtctc tattaattca aaacatacaa ttaagccatc aacatcttca 60
acaccattgc agccatataa attgacttta ttggatcagt taactccacc agcttatgtt 120
ccaattgtct tcttttatcc aattacagat catgatttca atttgccaca gactttggct 180
gacttgagac aggctttgtc agaaacttta actttgtact atccattatc aggtagagtt 240
aaaaataatt tgtatataga cgatttcgaa gagggtgtcc catacttgga ggctagggtc 300
aactgcgaca tgactgattt tttgagatta agaaagattg aatgtttaaa cgaattcgtt 360
ccaataaaac cattttctat ggaagctata tctgatgaaa ggtatccatt attgggagtt 420
caagttaatg tttttgattc aggtatagct attggtgttt ctgtttctca taagttgatt 480
gatggtggta cagctgattg ttttttgaag tcttggggtg ctgttttcag gggttgtagg 540
gaaaatatta ttcatccatc tttgtctgaa gcagcattgt tgttcccacc tagggatgac 600
ttgccagaaa aatatgttga tcaaatggaa gctttatggt tcgctggtaa gaaggtcgct 660
actagaaggt ttgtcttcgg tgttaaagct atttcttcta ttcaagacga ggctaagtct 720
gagtctgtcc ctaagccatc tagagtccac gcagttactg gttttttgtg gaaacattta 780
atagctgcat ctagagcttt gacatctggt acaacatcta ctagattgtc tattgcagct 840
caggctgtca acttgaggac tagaatgaac atggaaacag ttttagacaa cgcaactggt 900
aacttgtttt ggtgggctca ggcaattttg gaattgtctc acacaacacc tgaaatatct 960
gatttgaaat tatgtgattt ggttaacttg ttaaatggtt ctgttaagca atgtaacggt 1020
gattattttg aaacttttaa aggtaaggaa ggatacggta gaatgtgtga atatttagat 1080
ttccagagaa ctatgtcttc tatggagcca gcaccagata tttacttgtt ttcttcatgg 1140
acaaatttct ttaacccatt ggatttcggt tggggtagga catcttggat tggtgttgct 1200
ggtaagattg agtctgcttc ttgcaaattc attatattgg tcccaacaca gtgcggttct 1260
ggtattgagg catgggtcaa tttggaggag gagaaaatgg ctatgttgga gcaggaccca 1320
cactttttgg ctttggcttc accaaagaca ttgatttaa 1359
<210> 6
<211> 1479
<212> DNA
<213> 酿酒酵母 CICC32315()
<400> 6
tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60
gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120
cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180
tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240
catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300
ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360
tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420
ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480
agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540
accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600
cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660
attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720
tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020
tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaac 1479
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aagatcggaa ttccagatct catgtctcag aacgtttaca ttg 43
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gatctatcgc agatccctcg agtcatatct tttcaatgac aatag 45
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
aagatcggaa ttccagatct catgaaaaag gtatgtgtta tagg 44
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gatctatcgc agatccctcg agttattttg aataatcgta gaaacc 46
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
aagatcggaa ttccagatct catggaacta aacaatgtca tcc 43
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gatctatcgc agatccctcg agctatctat ttttgaagcc ttc 43
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
aagatcggaa ttccagatct catgattgtt aagccaatgg ttag 44
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gatctatcgc agatccctcg agttatattc tatcaaatct ttc 43
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
aagatcggaa ttccagatct catggaaaaa attgaagtct c 41
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gatctatcgc agatccctcg agttaaatca atgtctttgg tgaagc 46
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gaagaatcct tacgcacata agc 23
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
cagttttgga tagatcagtt agactgagac attttgagta cgtc 44
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
gatccactag tggcctatgc gaaggaggta agatcggtgt tg 42
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
ggaacaggtg cttaacactc ac 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ctatcctcca agacagcagt g 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
gtgtaacaac cactctagca cc 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
cagctgaagc ttcgtacgct g 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gcataggcca ctagtggatc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
ccatagagag aaggagcaag c 21
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
cagttttgga tagatcagtt agacggttga gaccgaagat ctcttg 46
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
gatccactag tggcctatgc ccgttagcaa tatctcgcat tatag 45
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
catgctacct tccatggttg ag 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ggaattgctc aggcatttgc ag 22
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
gtggtctata cttagaatct ccag 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
gtagcaggag cagatatttc tg 22
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ctatgaaagc tgtcattgca tcc 23
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
gatgtgccta tgaatatgca gc 22
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
cagttttgga tagatcagtt agactggtga ggactgttcg cttg 44
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
gatccactag tggcctatgc ccaaggagag gagcttcttc c 41
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
ggaatggtac agtgttacgt tcc 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
cgtattacag ctgaagtcaa ggc 23
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
ctgtgtgcag ttgcctccaa g 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
ggatcagtta actccaccag c 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
gcctcaatac cagaaccgca c 21
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
gctgtgtatg aagaattagt tcacg 25
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
cagttttgga tagatcagtt agaccatgac agagatcatc cttgg 45
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
gatccactag tggcctatgc gagacatact tccttcaccg g 41
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 44
ccttgagcga tatctggaga ttg 23
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 45
gccttgatca acaatgcaat cc 22
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 46
cagttttgga tagatcagtt agagtgactg agcgcataat attcc 45
<210> 47
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 47
gatccactag tggcctatgc ctgagaagtc agaagatcca atc 43
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 48
gcaggtcttg ataatgatag agg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 49
tctaactgat ctatccaaaa ctg 23
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 50
cagcgtacga agcttcagct gtaacgaacg cagaattttc gag 43

Claims (7)

1.一种高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述菌株以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，同时过表达3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因Hbd、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因Crt、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter，同时过表达醇酰基转移酶基因AAT构建而成；
其中，通过强启动子过表达所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，同时所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因Hbd和 3-羟基丁酰辅酶A脱水酶编码基因Crt通过串联共同替换基因GAL80，并通过强启动子分别过表达基因Hbd和基因Crt；同时所述反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter和所述醇酰基转移酶基因AAT通过串联共同替换基因HXT16，并通过强启动子分别过表达基因Ter和基因AAT。
2.如权利要求1所述一种高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述基因Ter和基因AAT中至少一个基因为双拷贝表达；
其中，所述基因Ter的二拷贝是通过替换基因LPP1，并通过强启动子过表达；所述基因AAT的二拷贝是通过替换基因KU70，并通过强启动子过表达。
3.如权利要求1所述一种高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因Erg10，其核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；
所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因Hbd，其核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示；
所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因Crt，其核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:3所示；
所述反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因Ter，其核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:4所示；
所述醇酰基转移酶基因AAT，其核苷酸序列如核苷酸序列表SEQ ID NO:5所示。
4.如权利要求1所述一种高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述出发菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC32315。
5.如权利要求1所述一种高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述强启动子为PGK1P。
6.权利要求1-5任一所述高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株在发酵酿造、发酵食品、香精香料领域中的用途。
7.如权利要求6所述高产丁酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株的用途，其特征在于：将酿酒酵母基因工程菌经过两级活化后，将种子液按接种量8-12%接种于发酵培养基，28-30 ℃静置发酵80-86 h；
所述发酵培养基组成为：玉米粉300-320 g/L，耐高温α-淀粉酶为（2-5）×104 U/L，糖化酶90-100 U/L，酸性蛋白酶10-20 U/L，营养盐溶液5.5-5.6 mL/L，余量为水；所述营养盐溶液组成为：MgSO4 140-160 g/L，KH2PO4 70-80 g/L，尿素80-85 g/L，余量为水。
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