CN108998383B

CN108998383B - 一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

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Publication number: CN108998383B
Application number: CN201710419622.1A
Authority: CN
Inventors: 花强; 韦柳静; 曹选; 林嘉宇
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: CN108998383A

Abstract

本发明公开了一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将来自猕猴桃(Actinidia arguta)的芳樟醇合成酶基因LIS经优化后，转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f；在此基础上同时过表达内源HMG1、IDI1或ERG中的一种或多种基因。此外，通过对该基因工程菌发酵时添加的碳源如葡萄糖、甘油、果糖、柠檬酸以及丙酮酸及其浓度进行选择，进一步提高芳樟醇的产量。芳樟醇的产量最高能达到6.96mg/L，以及单位胞内芳樟醇含量939.04μg/g细胞干重(DCW)的极高产量。该基因工程菌能用于大规模商业化生产，前景良好。

Description

一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

芳樟醇结构中含有两个类异戊二烯基和十个碳原子，因其作为精油中的芳香物质和食品添加剂以及高级生物能源而被高度关注。芳樟醇作为开环单萜叔醇，是众多精油中的主要成分之一。花香中约有70％的萜类化合物以芳樟醇为代表。芳樟醇作为芳香和风味物质被添加到洗发水、香皂、沐浴露等化妆品中和家用洗涤剂中以及加工食品和饮料中。另外，芳樟醇也是生产维生素E、微生物A、法呢醇、香茅醇和紫罗兰酮等产物的关键前体。芳樟醇还具有抗真菌、细菌和杀虫剂的特性。

当前，天然产物受到自然资源的限制产量普遍很低。作为植物的次级代谢产物，通常提取和分离都会对环境造成一定的污染并且成本很高。同时，大部分天然产物都具有几种异构体，并且结构复杂，传统的化学工艺合成可能无法满足纯度的要求。基于这些原因，利用微生物生产天然产物成为一个可行的选择，其合成途径见图1所示。一般通过外源引入芳樟醇合成酶基因生物发酵法生产芳樟醇，但目前在酿酒酵母中引入外源芳樟醇合成酶基因，其产量不高，仅为0.095mg/L(Pegah Amiri et al.,Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for linalool production,Biotechnology Letters,March2016,Volume 38,Issue 3,pp 503–508)或0.127mg/L(孙明雪等，调控酿酒酵母类异戊二烯合成途径强化芳樟醇合成，生物工程学报，2013年6月23日，29(6)：751-759)，亟需高产芳樟醇的基因工程菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏高产芳樟醇的基因工程菌的不足，提供一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将经特殊优化的外源猕猴桃(Actinidia arguta)芳樟醇合成酶基因(LIS)转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母构建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；优选地，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Polf。

优选地，基因工程菌还转化了内源基因，其中内源基因包括HMG1、IDI1和/或ERG；IDI1为单拷贝、双拷贝或三拷贝，ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20^F88W-N119W；HMG1、IDI1、ERG8、ERG10、ERG12及ERG19基因的核苷酸序列如基因库中所示；ERG20^F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

根据本发明，ERG20^F88W-N119W是指ERG20基因的突变体，其在现有ERG20基因88位氨基酸F(苯丙氨酸)变为W(色氨酸)，119位氨基酸N(天冬酰胺)变为W(色氨酸)。

更优选地，内源基因为HMG1；进一步更优选地，内源基因为组合1)HMG1和IDI1、2)HMG1和ERG、或3)HMG1、IDI1和ERG；其中ERG优选ERG12或ERG20^F88W-N119W。

本发明所述的重组载体为本领域常规的重组载体，其能够转化解脂耶氏酵母，基因均位于重组载体上；其中外源基因的重组载体为质粒pINA1312(简称p1312)；内源基因的重组载体为质粒pINA1312或pINA1269(简称p1269)。

本发明的技术方案之二为：一种产芳樟醇的方法，其包括以下的步骤：培养如权利要求1～4任一项所述的产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相发酵得发酵液，萃取发酵液的十二烷相；其中培养基为添加有碳源的YP培养基，碳源包括1)葡萄糖、柠檬酸、甘油和果糖中的一种、或者2)柠檬酸与选自葡萄糖、甘油和果糖中的一种或一种以上的组合；优选地，总碳源的终浓度为20g/L；更优选地，碳源为柠檬酸和果糖；进一步更优选地，柠檬酸和果糖的浓度均为10g/L；其中单位L为添加碳源后培养基的总体积。

优选地，碳源为柠檬酸和丙酮酸；较佳地，丙酮酸的浓度为2～8g/L，柠檬酸浓度为20g/L；其中单位L为添加碳源后培养基的总体积。

本发明的技术方案之三为：一种用于培养上述解脂耶氏酵母基因工程菌的培养基，其是于YP培养基中添加碳源，其碳源至少包括柠檬酸；优选地，其碳源还包括1)葡萄糖、甘油或果糖中的一种，或2)丙酮酸；更优选地，其碳源为柠檬酸和果糖，柠檬酸和果糖的浓度各为10g/L；或更优选地，当碳源为柠檬酸和丙酮酸时，丙酮酸的浓度为2～8g/L，柠檬酸浓度为20g/L；其中单位L为添加碳源后培养基的总体积。

YP培养基即传统的YPD培养基去除20g/L葡萄糖，其成分包括：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨。YP培养基制成后高温121℃20分钟灭菌，在超净台中按比例加入经灭菌的上述各种碳源。

本发明的技术方案之四为：本发明上述的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备芳樟醇中的应用。

本发明的技术方案之五为：一种制备上述的解脂耶氏酵母基因工程菌的方法，其包括以下的步骤：

(1)构建含有猕猴桃LIS的重组载体p1312-LIS；

(2)将步骤(1)制备的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，得转化体。

较优选地，还包括以下的步骤：

(3)将HMG1和/或IDI1单独或共构建到质粒p1269中，ERG8、ERG10、ERG12、ERG19和ERG20^F88W-N119W单独构建或与其它基因共构建到质粒p1269或p1312中；

(4)将上述(3)中的质粒转化步骤(2)所得的转化体。

本发明的技术方案之六为：一种用于制备上述的解脂耶氏酵母基因工程菌的重组载体，其在质粒p1312上含有猕猴桃LIS，猕猴桃LIS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

较优选地，在质粒p1312或p1269上还含有内源基因HMG1、IDI1和/或ERG；较优选地，上述ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20^F88W-N119W；上述ERG20^F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过在解脂耶氏酵母中导入来源于猕猴桃的基因LIS，并导入内源基因HMG1、IDI1和ERG中的一种或一种以上，在此基础上过表达基因LIS、HMG1、和/或ERG，获得能更大幅度地提高芳樟醇的产量的产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌。该产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌能使芳樟醇产量最高达到5.34mg/L，在添加柠檬酸、甘油、果糖和/或丙酮酸以后，芳樟醇产量最高达到6.96mg/L，超过仅导入基因LIS的菌株所产芳樟醇(0.09mg/L)的产量76.3倍。此外，利用本发明提供的解脂耶氏酵母基因工程菌产芳樟醇的方法，操作简便，反应稳定可靠，能够利用于大规模的商业化生产，所得的芳樟醇能够安全地用于食品添加剂的制备，前景良好。

附图说明

图1为本发明芳樟醇在解脂耶氏酵母中的合成途径。

图2为重组质粒电泳图，M为marker，泳道1为目标产物：A.质粒p1312-LIS的电泳结果；B.重组载体p1312ERG20的PCR验证；C.重组载体p1312ERG12菌液PCR验证；D.重组载体p1312-LISERG20的质粒电泳验证；E.重组载体p1312-LISmERG20的质粒电泳验证；F.重组载体p1312-LISERG12的质粒电泳验证。

图3为芳樟醇和鲨烯测量的标准曲线，其中3A为芳樟醇，3B为鲨烯。

图4为解脂耶氏酵母工程菌CXY01、CXY21、CXY22、CXY23、CXY24、CXY31、CXY32、CXY33、CXY34、CXY35和CXY38在YP培养基上的芳樟醇产量和胞内含量。

图5为YP培养基中不同碳源对芳樟醇产量和胞内含量的影响。

图6为解脂耶氏酵母工程菌CXY25、CXY26、CXY36和CXY37的芳樟醇产量对比，及CXY36在YP和YP-cit-p8培养基中的芳樟醇产量和胞内含量。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的出发菌株Po1f(leu2-,ura3-)根据Madzak C,Tréton B and Roland SB.Strong hybrid promoters andintegrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression ofheterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol MicrobiolBiotechnol.(2000)2(2):207-216所记载的制备方法制得。

质粒pINA1312的制备方法参见Nicaud,J.M.,Madzak,C.,Broek,P.,Gysler,C.,Duboc,P.,Niederberger,P.,Gaillardin,C.,2002,Protein expression and secretionin the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS yeast research 2,371-379。

质粒pINA1269的制备方法参见Madzak C,Tréton B and Roland SB.Stronghybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowialipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol.(2000)2(2):207-216。

质粒p1269-HMG1、p1269-IDI1、p1269-IDI1IDI1、p1269-IDI1IDI1IDI1、p1269-HMG1ERG8、p1269-HMG1ERG10、p1269-HMG1ERG12,p1269-HMG1ERG19、and p1269-HMG1IDI1的制备方法参见本申请人CN201610817882.X的专利申请(以下简称为专利)；以及Cao X,LvYB,Chen J,Imanaka T,Wei LJ,&Hua Q Metabolic engineering of oleaginous yeastYarrowia lipolytica for limonene overproduction.Biotechnology for biofuels.(2016)9:214(以下简称为文献)。

实施例1构建工程菌菌株CXY01

全基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成并构建入p1312质粒。本发明中，质粒的构建采用单片段无缝克隆试剂盒，供应商为南京诺维赞生物科技有限公司。

(1)全基因合成经优化的猕猴桃基因LIS(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示)；通过酶切位点PmlI酶切LIS基因和质粒p1312，将LIS连接到质粒p1312，得到质粒p1312-LIS。

(2)将步骤(1)所得的质粒pINA1312-LIS用酶NotI(本发明所用限制性内切酶均购自Takara宝生物)线性化，利用同源重组的方法转化入解脂耶氏酵母Po1f中，获得能够生成芳樟醇的初始菌株CXY01。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation II^TM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。

实施例2构建工程菌菌株CXY21-24

质粒的具体构建方法参见专利及文献，简述如下：

(1)以解脂耶氏酵母基因组为模板，分别扩增出HMG1(在NCBI中登录号为GB:YALI0E04807g，引物序列如文献中P7和P8所示)、IDI1(在NCBI中登录号为YALI0F04015g，引物序列如文献中P9和P10所示)。

(2)将上述(1)制得基因和实施例2制得通过酶切位点PmlI分别连接到质粒p1269上，得到质粒p1269-HMG1、p1269-IDI1；p1269-IDI1IDI1和p1269-IDI1IDI1IDI1具体构建方法参见上述文献。

将步骤(2)所得的质粒用限制性内切酶BsrGI线性化，利用同源重组的方法分别转化入实施例1所得的初始菌株CXY01中，依次得到菌株CXY21、CXY22、CXY23和CXY24。其中，转化的方法与实施例1中转化的方法相同。

实施例3构建工程菌菌株CXY25-27

A.突变基因ERG20^F88W-N119W制作

(1)以解脂耶氏酵母基因组为模板，用引物ERG20sk-F(序列如SEQ ID No.3所示)和ERG20sk-R(序列如SEQ ID No.4所示)扩增出ERG20基因，引物对的5’端分别带有与pBluescript II SK+酶切位点HindIII和EcoRI上下游的同源序列。将ERG20基因连接到pBluescript II SK+(购自Stratagene)获得SK-ERG20质粒。

(2)以SK-ERG20为模板，用引物F88W-F(序列如SEQ ID No.5所示)和F88W-R(序列如SEQ ID No.6所示)反向PCR扩增出F88W突变的目的条带，参照试剂盒KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO Co.,Ltd)做菌株的构建，并将挑取的送至上海捷瑞公司测序正确的单克隆放大培养，提取质粒命名为SK-ERG20^F88W。

(3)以SK-ERG20^F88W为模板，用引物N119W-F(序列如SEQ ID No.7所示)和N119W-R(序列如SEQ ID No.8所示)反向PCR扩增出突变的目的条带，参照试剂盒KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO Co.，Ltd)做菌株的构建，并将挑取的送至捷瑞公司测序正确的单克隆放大培养，提取质粒命名为SK-ERG20^F88W-N119W。

B.构建工程菌菌株CXY25-27

(1)以A中的SK-ERG20、SK-ERG20^F88W-N119W和解脂耶氏酵母基因组为模板，分别扩增出ERG20(在NCBI中登录号为YALI0E05753g，引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示)、ERG20^F88W-N199W(以下简称为mERG20，引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示)和ERG12(在NCBI中登录号为YALI0B16038g，引物序列如文献中P15和P16所示)。

(2)将上述(1)制得基因通过PmlI分别连接到质粒pINA1312上，得到质粒p1312-ERG20,p1312-mERG20和p1312-ERG12。以p1312-LIS为模板，用引物1312PTEcoRI-F和1312PTEcoRI-R(引物序列分别如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示)，扩增出带有启动子和终止子区域的LIS基因表达盒P-LIS-T，类似的，引物对5’端分别带有与质粒pINA1312酶切位点EcoRI上下游同源序列用于无缝克隆连接(使用单片段无缝克隆试剂盒，南京诺维赞生物科技有限公司)。将胶回收后的表达盒P-LIS-T分别与用EcoRI酶切过的质粒p1312ERG20和p1312mERG20连接获得重组载体p1312-LISERG20和p1312-LISmERG20。以p1312LIS为模板，用引物1312PTStuI-F和1312PTStuI-R(引物序列分别如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示)，扩增出带有启动子和终止子区域的LIS基因表达盒P-LIS-T，类似的，引物对5’端分别带有与质粒pINA1312酶切位点StuI上下游同源序列用于无缝克隆连接(无缝克隆试剂盒)。将胶回收后的表达盒P-LIS-T分别与用StuI酶切过的质粒p1312ERG12连接获得重组载体p1312-LISERG12。

将步骤(2)所得的质粒用酶NotI线性化，利用同源重组的方法分别转化入解脂耶氏酵母Po1f中，依次得到菌株CXY26、CXY25和CXY27。其中，转化的方法与实施例1中转化的方法相同。

实施例4构建工程菌菌株CXY31-35

质粒的具体构建方法参见专利及文献，简述如下：

(1)以解脂耶氏酵母基因组为模板，分别扩增出ERG8(在NCBI中登录号为YALI0E06193g，引物序列如文献中P11和P12所示)、ERG10(在NCBI中登录号为YALI0E11099g，引物序列如文献中P13和P14所示)、ERG12(在NCBI中登录号为GB:YALI0B16038g，引物序列如文献中P15和P16所示)、ERG19(在NCBI中登录号为YALI0F05632g，引物序列如文献中P17和P18所示)和IDI1(在NCBI中登录号为YALI0F04015g，引物序列如文献中P9和P10所示)。

(2)将上述(1)制得基因连接到质粒p1269-HMG1上，得到质粒p1269-HMG1ERG8、p1269-HMG1ERG10、p1269-HMG1ERG12、p1269-HMG1ERG19和p1269-HMG1IDI1。

将步骤(2)所得的质粒用酶BsrGI线性化，利用同源重组的方法分别转化入实施例1所得的初始菌株CXY01中，依次得到菌株CXY31、CXY32、CXY33、CXY34和CXY35。其中，转化的方法与实施例1中转化的方法相同。

实施例5构建工程菌菌株CXY36-38

将实施例4中制备的质粒p1269-HMG1和p1269-HMG1IDI1线性化，利用同源重组的方法分别转化入工程菌菌株CXY25或CXY27中，依次得到菌株CXY36(p1312-LISmERG20+p1269-HMG1IDI1)、CXY37(p1312-LISmERG20+p1269-HMG1)和CXY38(p1312-LISERG12+p1269-HMG1IDI1)。其中，以p1312为骨架的表达质粒转化前用NotI酶切线性化，以p1269为骨架的表达质粒转化前用BsrGI酶切线性化，其余转化方法与实施例1中转化的方法相同。

以上实施例1-5所得重组质粒电泳图见图2。

实施例6芳樟醇和鲨烯的测定方法

A.芳樟醇的检测分析

(1)芳樟醇的测定方法

芳樟醇样品的测定采用高效液相色谱(HPLC)方法。本实验采用安捷伦1200高效液相色谱系统(Agilent Technologies,Ltd)。所用色谱柱为SinoChrom ODS-BP(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为45％乙腈，55％超纯水，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为210nm，进样量为20μL。

(2)芳樟醇标准曲线的制定

取11.63μL购买的芳樟醇标准品，用十二烷溶解，并定容至10mL容量瓶，配制成1000mg/L的芳樟醇标准品母液。再用十二烷将母液梯度稀释至100，50，20，10，5和1mg/L。将各浓度的标准品溶液用HPLC检测，根据测定结果，绘制出峰面积(Area)对浓度(mg/L)的标准曲线，如图3A所示。

(3)芳樟醇样品的制备及检测

由于芳樟醇作为单萜也是易挥发物质，为了防止发酵过程中芳樟醇挥发流失，发酵初始取1mL过滤除菌的十二烷添加到YPD培养基里，作为萃取剂。发酵结束后，用移液枪尽量吸取发酵液的十二烷层，离心后，取上清过滤，用HPLC检测。

3.5.2鲨烯的检测分析

(1)鲨烯的提取和检测方法

鲨烯的提取参考文献，仅作发酵液提取量的调整，其提取量更改为1mL。

(2)鲨烯标准曲线的制定

取11.63μL购买的鲨烯标准品，用无水乙醇溶解，并定容至10mL容量瓶，配制成1000mg/L的鲨烯标准品母液。再用无水乙醇将母液梯度稀释至500，200，100，50，20mg/L。将各浓度鲨烯标准品溶液用HPLC检测，根据测定结果，绘制出峰面积(Area)浓度(mg/L)的标准曲线，如图3B所示。

实施例7测定菌株产芳樟醇和鲨烯的产量

将菌株解脂耶氏酵母Po1f、实施例1-5制得的工程菌分别接种于2mL YPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养，并加入2％十二烷，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。芳樟醇样品的测定采用高效液相色谱(HPLC)方法。本实验采用安捷伦1200高效液相色谱系统(Agilent Technologies,Ltd)。所用色谱柱为SinoChrom ODS-BP(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为45％乙腈，55％超纯水，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为210nm，进样量为20μL。

检测的结果参见图4和表1。表1的结果说明，菌株CXY01和现有技术的芳樟醇产量相近，均为0.09mg/L左右，但其副产物鲨烯的产量从0.21mg/L降低到0.07mg/L。菌株CXY21-25及CXY31-34产芳樟醇的能力比CXY01及现有技术有大幅度提升，在0.418mg/L-0.837mg/L之间。过表达单拷贝IDI1的工程菌CXY22芳樟醇的产量为0.418mg/L，相比初始菌株CXY01提高了约3.6倍，而增加IDI1拷贝数之后的工程菌CXY23，CXY24中，虽然增加两个拷贝的IDI1基因没有再次显著提高芳樟醇的产量(0.445mg/L)，但是三个拷贝的IDI1基因的过表达，芳樟醇产量相比CXY22进一步提高了75％，相比出发菌株CXY01提高了7.1倍。实验结果说明，IDI1基因的过表达对芳樟醇在宿主菌中的积累有很大帮助，并且表达水平越高，越有益于对芳樟醇的积累。特别是当与HMG1基因共表达时，可以将更多的代谢流流向芳樟醇。

经过两天的发酵培养，四株工程菌CXY31、CXY32、CXY33和CXY34其芳樟醇的产量分别为0.708、0.678、0.837和0.657mg/L(图4和表1)。结果表明，相对于工程菌CXY21，四株工程菌中芳樟醇的产量都有了27-62％不等的提高，而ERG12结合HMG1基因的过表达提高的最显著。在工程菌CXY35中，当将HMG1和IDI1两个基因共同过表达时，芳樟醇的产量提高明显，为1.44mg/L，是CXY01的16倍。工程菌CXY37和CXY36的生长相对于对照菌没有明显差异，芳樟醇产量分别为4.69mg/L和5.34mg/L(表1)。说明将有利于芳樟醇积累的基因综合起来过表达会更进一步提高芳樟醇的产量。表达量最高的CXY36，其在CXY35的基础上还导入了mERG20基因，它的芳樟醇产量为5.34mg/L，同时，其鲨烯的含量为4.38mg/g DCW(细胞干重)。

表1不同菌株的芳樟醇和鲨烯产量

/：未测量

实施例7提高菌株产芳樟醇的产量的优化发酵方法

A、使用较优的碳源

以实施例4制备的工程菌CXY35为实验菌株，在YP培养基中分别添加20g/L甘油、果糖和柠檬酸并命名为YP-gly，YP-fru和YP-cit(表2)。以YPD培养基作为对照，经过两天的发酵培养，如图4所示，相比于YPD培养基，工程菌CXY35在YP-gly和YP-fru培养基中的胞内芳樟醇含量略有下降，而在YP-cit培养基中生长较缓慢，胞内芳樟醇含量只有7.1g/L。而相比于YPD培养基，工程菌CXY35在YP-cit培养基中发酵时，芳樟醇的产量提高非常显著，从1.44mg/L提升到2.52mg/L，单位胞内芳樟醇含量从82.22μg/g DCW提升到356.49μg/g DCW。这说明，柠檬酸作为乙酰辅酶A的来源之一，在添加到培养中后被转化成乙酰辅酶A而将代谢流更多的流向了MVA途径。其次，在YP-gly中发酵时，产量也略有提高。

表2实验用培养基的配料

/：未添加

为了弥补柠檬酸作为唯一碳源时不利于工程菌生长的情况，尝试了将柠檬酸分别与葡萄糖、甘油和果糖混合作为碳源来探究对芳樟醇产量的影响。同样地，以工程菌CXY35为实验菌株，YP-cit培养中分别添加10g/L葡萄糖、甘油和果糖并命名为YP-cit-glu，YP-cit-gly和YP-cit-fru。经过两天的发酵培养，CXY35在三种培养基中的生长量相较于YP-cit培养基都有明显的提升，分别为12.1、12.4和12.5g/L。而芳樟醇的产量分别为4.6、4.19和4.47mg/L(图5和表3)，相较于YP-cit提高了约75％，但是值得注意的是，单位胞内芳樟醇的含量却依然变化不大。这说明在利用混合碳源培养基发酵时，芳樟醇产量的积累是因为工程菌生长量的提升，而不是有更多的代谢流通向MVA途径。

表3发酵条件优化后的芳樟醇产量

产量指芳樟醇的产量，单位：mg/L；胞内含量指芳樟醇的胞内含量，单位：μg/gDCW；生长量指工程菌的生长量，单位：g/L；/：未测量

B、使用较优浓度的丙酮酸

将实施例4制备以工程菌CXY35为实验菌株，YP-cit中分别添加2,4和8g/L丙酮酸并命名为YP-cit-p2，YP-cit-p4和YP-cit-p8(表2)。经过两天的发酵培养，虽然CXY35在三种培养基中的生长量相较于YP-cit培养基仅仅提高了一些(分别为7.5、8.2和8g/L)，但是当丙酮酸的添加量为8g/L时，芳樟醇的产量增加到4.6mg/L，单位芳樟醇胞内含量为580.46μg/g DCW(表4和图6)，分别是YP-cit培养基中产量的1.8和1.6倍。说明这里芳樟醇的积累是因为添加到培养基中的丙酮酸会被宿主转化成更多的乙酰辅酶A，从而流向MVA途径增加芳樟醇在CXY35菌株中的产量。最后，将工程菌CXY36在培养基YP-cit-p8中发酵培养，虽然生长较YPD培养基缓慢，但是芳樟醇产量从5.34mg/L被提高到6.96mg/L(表4和图6)，单位胞内芳樟醇含量也由333.93μg/g DCW被提高到939.04μg/g DCW，但没有进一步提高CXY36中鲨烯的含量。

表4发酵条件优化后的芳樟醇产量

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

<130> P1710691C

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经优化的猕猴桃LIS基因

<400> 1

atggcttctt tcaaccgatt ctgcgtgtct tccctgctcg ctcctaacaa ctccccccaa 60

atctctaacg ctccccgatc taccgccgtg ccttctatgc ctaccaccca gaagtggtcc 120

attaccgagg acctcgcttt catctccaac ccttctaagc agcacaacca ccagaccgga 180

taccgaattt tctctgacga gttctacctc aagcacgaga acaagctgaa ggacgtgcga 240

cgagccctgc gagaggtgga agaaacccct ctggagggac tcgttatgat tgacaccctt 300

cagcgactcg gcattgacta ccacttccag ggtgagatcg gcgctctctt acagaagcag 360

cagcgaattt ctacctgcga ctaccctgag cacgacctgt tcgaggtgtc tacccgattc 420

cgactgctgc gacaggaagg ccacaacgtc cccgctgacg tgttcaacaa cttccgagac 480

aaggaaggtc gattcaagtc tgagctgtcc cgagacattc gaggtctgat gtctctgtac 540

gaggcttccc agctgtccat tcagggtgag gacatcctgg accaggccgc tgacttctct 600

tcccagctgc tgtccggttg ggccaccaac ctggaccacc accaggcccg actcgtgcga 660

aacgccctca cccaccctta ccacaagtct ctggctacct tcatggctcg aaacttcaac 720

tacgactgca agggtcagaa cggttgggtg aacaacttgc aagaactggc taagatggac 780

ctcacaatgg tccagtctat gcaccagaaa gaggtgctcc aggtgtctca gtggtggaag 840

ggtcgaggcc tcgctaacga gctgaagctc gtgcgaaacc agcccctcaa gtggtacatg 900

tggcctatgg ccgctctgac cgacccccga ttctctgagg aacgagtcga gcttaccaag 960

cctatttctt tcatctatat tattgacgac attttcgacg tgtacggaac cctggaagaa 1020

ttgaccctgt tcaccgacgc cgtcaaccga tgggaactca ccgccgtcga gcagctgccc 1080

gactacatga agatttgctt caaggctctg tacgacatca ccaacgagat tgcttacaag 1140

atatataaga agcacggtcg aaaccctatt gactccctgc gacgaacctg ggcttctctg 1200

tgcaacgctt tcctggaaga ggctaagtgg ttcgcctccg gtaacctgcc taaggctgaa 1260

gaatacctca agaacggcat tatttcttcc ggtatgcacg tcgtcaccgt ccacatgttc 1320

ttcctgctcg gcggttgctt caccgaggaa tccgtgaacc tcgtggacga gcacgccggt 1380

attacctcct ctatcgctac catcctgcga ctgtctgacg acctcgggag tgctaaggac 1440

gaggaccagg acggatacga cggatcttac ctggagtgct acctcaagga ccacaaggga 1500

tcttccgtcg agaacgcccg agaggaagtc atacggatga tctctgacgc ttggaagcga 1560

ctgaacgaag aatgcctgtt ccctaaccct ttctccgcca ccttccgaaa gggatctctg 1620

aacatcgccc gaatggtgcc cctcatgtac tcttacgacg acaaccacaa cctgcctatc 1680

ctggaagaac acatgaaaac catgctgtac gactcctcct cttaa 1725

<210> 2

<211> 3000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体ERG20F88W-N119W

<400> 2

atgctacaag cagctattgg aaagattgtg ggatttgcgg tcaaccgacc catccacaca 60

gttgtcctga cgtccatcgt ggcgtcaacc gcatacctcg ccatcctcga cattgccatc 120

ccgggtttcg agggcacaca acccatctca tactaccacc ctgcagcaaa atcttacgac 180

aaccctgctg attggaccca cattgcagag gccgacatcc cttcagacgc ctaccgactt 240

gcatttgccc agatccgtgt cagtgatgtt cagggcggag aggcccccac catccctggc 300

gccgtggccg tgtctgatct cgaccacaga atcgtcatgg actacaaaca gtgggccccc 360

tggaccgcca gcaacgagca gatcgcctcg gagaaccaca tctggaagca ctccttcaag 420

gaccacgtgg ccttcagctg gatcaagtgg ttccgatggg cctacctgcg tttgtccact 480

ctcatccagg gggcagacaa cttcgacatt gccgtggtcg cccttggcta tcttgccatg 540

cactacacct tcttcagtct cttccgatcc atgcgaaagg ttggctcgca cttttggctt 600

gcctccatgg ctctggtctc ttccaccttc gctttcctgc ttgcggtggt ggcttcctct 660

agcctgggtt accgacctag catgatcacc atgtccgagg gcctgccctt cctcgtggtc 720

gccattggct ttgaccgaaa ggtcaacctg gctagcgagg tgctcacatc caagagcagc 780

cagctcgctc ccatggtgca ggtgatcaca aagatcgcct ccaaggcgct gtttgagtac 840

agccttgagg tggccgccct gtttgctggc gcctataccg gagttcctcg actgtcccag 900

ttttgcttct tatctgcttg gatcctcatc ttcgactaca tgtttttgct gaccttctac 960

tctgctgtcc ttgctatcaa gtttgagatc aatcacatta agcgaaaccg aatgatccag 1020

gatgctctca aggaggatgg tgtatctgct gctgttgccg agaaggtagc cgactcttct 1080

cccgacgcca agctcgaccg aaagtccgac gtttctcttt ttggagcctc tggcgccatt 1140

gcggtgttca agatcttcat ggtccttggg ttccttggtc tcaacctcat caacctgact 1200

gccatccctc accttggcaa ggcggccgcc gctgcccagt ctgtgactcc catcaccctc 1260

tcccccgagc ttctccatgc catccccgcc tctgtgcccg ttgttgtcac ctttgtgccc 1320

agcgttgtgt acgagcactc ccagctcatt ctgcagctgg aggacgccct cactaccttc 1380

ctggctgcct gctccaaaac tattggtgac cccgtcatct ccaagtacat cttcctgtgc 1440

ctgatggtct ccaccgccct gaacgtctac ctgtttggag ccacccgaga agttgtgcga 1500

acccagtctg tgaaggtggt tgagaagcac gttcctatcg tcattgagaa gcccagcgag 1560

aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag 1620

cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc 1680

aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat 1740

gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc 1800

tcccagcagt ctaataccaa gactttagag acctcaaagc ttccttacct gcactacgac 1860

tacgaccgtg tttttggagc ctgttgcgag aacgttattg gttacatgcc tctccccgtt 1920

ggtgttgctg gccccatgaa cattgatggc aagaactacc acattcctat ggccaccact 1980

gagggttgtc ttgttgcctc aaccatgcga ggttgcaagg ccatcaacgc cggtggcggt 2040

gttaccactg tgcttactca ggacggtatg acacgaggtc cttgtgtttc cttcccctct 2100

ctcaagcggg ctggagccgc taagatctgg cttgattccg aggagggtct caagtccatg 2160

cgaaaggcct tcaactccac ctctcgattt gctcgtctcc agtctcttca ctctaccctt 2220

gctggtaacc tgctgtttat tcgattccga accaccactg gtgatgccat gggcatgaac 2280

atgatctcca agggcgtcga acactctctg gccgtcatgg tcaaggagta cggcttccct 2340

gatatggaca ttgtgtctgt ctcgggtaac tactgcactg acaagaagcc cgcagcgatc 2400

aactggatcg aaggccgagg caagagtgtt gttgccgaag ccaccatccc tgctcacatt 2460

gtcaagtctg ttctcaaaag tgaggttgac gctcttgttg agctcaacat cagcaagaat 2520

ctgatcggta gtgccatggc tggctctgtg ggaggtttca atgcacacgc cgcaaacctg 2580

gtgaccgcca tctaccttgc cactggccag gatcctgctc agaatgtcga gtcttccaac 2640

tgcatcacgc tgatgagcaa cgtcgacggt aacctgctca tctccgtttc catgccttct 2700

atcgaggtcg gtaccattgg tggaggtact attttggagc cccagggggc tatgctggag 2760

atgcttggcg tgcgaggtcc tcacatcgag acccccggtg ccaacgccca acagcttgct 2820

cgcatcattg cttctggagt tcttgcagcg gagctttcgc tgtgttctgc tcttgctgcc 2880

ggccatcttg tgcaaagtca tatgacccac aaccggtccc aggctcctac tccggccaag 2940

cagtctcagg ccgatctgca gcgtctacaa aacggttcga atatttgcat acggtcatag 3000

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ERG20sk-F

<400> 3

gtcgacggta tcgataagct tatgtccaag gcgaaattcg a 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ERG20sk-R

<400> 4

caggaattcg atatcaagct tctacttctg tcgcttgtaa a 41

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物F88W-F

<400> 5

tggctcgtgt cggacgaca 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物F88W-R

<400> 6

aaacgcctgc agcagctcaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物N119W-F

<400> 7

tgggatgctt tcatgctaga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物N119W-R

<400> 8

gatggcaatc atgccgacct 20

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ERG20-F

<400> 9

acaaccacac acatccacgt gatgtccaag gcgaaattcg a 41

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ERG20-R

<400> 10

ttagtttcgg gttcccacgt gctacttctg tcgcttgtaa a 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物mERG20-F

<400> 11

acaaccacac acatccacgt gatgtccaag gcgaaattcg a 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物mERG20-R

<400> 12

ttagtttcgg gttcccacgt gctacttctg tcgcttgtaa a 41

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1312PTEcoRI-F

<400> 13

gagatgcccg tgtccgaatt cgctagctta tcgatacgcg tgcatg 46

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1312PTEcoRI-R

<400> 14

cgagtgttac acatggaatt ccatctcact tgcgtatgta tggaaa 46

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1312PTStuI-F

<400> 15

agatagagtc gacaaaggcc tgctagctta tcgatacgcg tgcatg 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1312PTStuI-R

<400> 16

tgtacaccga gaaacaggcc tcatctcact tgcgtatgta tggaaa 46

Claims

1.一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）基因工程菌，其特征在于，其是将经优化的外源猕猴桃（Actinidia arguta）芳樟醇合成酶基因（LIS）转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母Po1f构建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；

其还转化了内源基因，所述内源基因为HMG1、IDI1和/或ERG；所述IDI1为单拷贝、双拷贝或三拷贝，所述ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20 ^F88W-N119W中的一种，其中所述ERG20 ^F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述内源基因为HMG1。

3.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述内源基因为组合1）HMG1和IDI1、2）HMG1和ERG、或者3）HMG1、IDI1和ERG。

4.如权利要求3所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述ERG为ERG12或ERG20 ^F88W-N119W。

5.如权利要求1~4任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因均位于重组载体上；其中所述的外源猕猴桃芳樟醇合成酶基因的重组载体为质粒pINA1312；所述的内源基因的重组载体为质粒pINA1312或pINA1269。

6.一种产芳樟醇的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：培养如权利要求1~5任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相发酵得发酵液，萃取发酵液的十二烷相；其中培养基为添加有碳源的YP培养基，所述碳源包括1）葡萄糖、柠檬酸、甘油和果糖中的一种、或者2）柠檬酸与选自葡萄糖、甘油和果糖中的一种或一种以上的组合。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，总的所述碳源的终浓度为20 g/L。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的碳源为柠檬酸和果糖。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸和果糖的浓度均为10 g/L；单位L为添加碳源后培养基的总体积。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源为柠檬酸时，所述碳源还包括丙酮酸。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸的浓度为2~8 g/L，所述柠檬酸浓度为20 g/L；单位L为添加碳源后培养基的总体积。

12.如权利要求1~5任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备芳樟醇中的应用。

13.一种制备如权利要求1~5任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

（1）构建含有猕猴桃LIS的重组载体pINA1312-LIS；

（2）将步骤（1）制备的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Po1f，得转化体。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，其还包括以下的步骤：

（3）将HMG1和/或IDI1单独或共构建到质粒pINA1269中，ERG8、ERG10、ERG12、ERG19和ERG20 ^F88W-N119W单独构建或与其它基因共构建到质粒pINA1269或pINA1312中；

（4）将上述（3）中的质粒转化步骤（2）所得的转化体。