CN104962488B - 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104962488B CN104962488B CN201510435606.2A CN201510435606A CN104962488B CN 104962488 B CN104962488 B CN 104962488B CN 201510435606 A CN201510435606 A CN 201510435606A CN 104962488 B CN104962488 B CN 104962488B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- homologous sequence
- yeast
- site
- gal1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。所述重组酵母菌株敲除gal1、gal7、gal10和ypl062w基因，且包含经酵母同源重组整合到基因组上的9个基因片段。本发明构建四敲酵母菌株，为生产β‑胡萝卜素提供优化的宿主细胞，选取不同来源的番茄红素环化酶crtY并配合特定来源的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因等，经模块化设计整合至四敲酵母菌株基因组上，获得一株全新的高产β‑胡萝卜素的重组菌株。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。
背景技术
在世界范围内，随着经济水平和对健康需求的提高，食品的安全性、营养性和功能性受到越来越多的关注，因此功能性营养化学品已成为发展趋势，代表当代食品发展的新潮流，具有广阔的市场前景。β-胡萝卜素是一种橘黄色脂溶性天然食用色素，具备极强的抗氧化能力，是近年来国际上功能食品成分研究的热点。
β-胡萝卜素的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成，前两种方法各有其自身的不足，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性，被认为是最有前途的方法。目前，在微生物合成β-胡萝卜素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大肠杆菌与酿酒酵母。2013年，通过上调内源MEP途径中的关键基因并在胞内组合搭建异源MVA路径，最终通过分批补料发酵优化实现2.47g/L(72mg/gDCW)的β-胡萝卜素产量，属目前公开报道的重组菌株中单位细胞产量最高。2014年，Yang等人也通过类似策略在大肠杆菌中实现3.2g/L的β-胡萝卜素产量。同年，天津工业生物技术研究所马延和课题组通过组合优化胞内MEP模块、ATP合成模块、PP路径及TCA循环，获得一株高产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌，其在分批补料发酵罐上的产量为2.1g/L(60mg/g DCW)。
酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生长周期更短且更易培养。因此，实现β-胡萝卜素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。然而，截至目前公开报道的利用重组酿酒酵母合成β-胡萝卜素的产量比起重组大肠杆菌依然存在很大的差距。2013年以前报道的在酿酒酵母中合成β-胡萝卜素的产量最高仅有6.29mg/gDCW。2013年，Reyes等人以过氧化氢作为筛选压力，通过短期进化将β-胡萝卜素的产量提高3倍，达到18mg/gDCW。与此同时，浙江大学于洪巍课题组应用诱导表达系统在酿酒酵母中实现11mg/gDCW(7.41mg/gDCW β-胡萝卜素)的总类胡萝卜素产量；随后，该课题组通过下调ERG9等一系列优化手段，并通过发酵优化将总胡萝卜素的产量提高到1156mg/L(20.79mg/gDCW)，但其中β-胡萝卜素的所占比例较低，仅占总产量的30％。因此，亟待开发高纯度、高产β-胡萝卜素的重组酿酒酵母菌株。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得所述重组菌株能够应用于β-胡萝卜素的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述重组菌株的构建方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种重组酵母菌株，所述酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10和ypl062w基因，且包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；
酵母ypl062w基因上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子以及酵母ypl062w基因下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3；
基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4；
酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段5；
酵母YGLCtau3位点上游同源序列、hphA抗性标签、IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子、酵母YGLCtau3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段6；
酵母gal7基因下游同源序列、nat抗性标签、ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子、酵母gal1基因下游同源序列顺次拼接而成的基因片段7；
酵母YMRWdelta15位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段8；
酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段9。
本发明通过利用特定的酵母内源基因以及外源基因进行基因元件、基因模块的构建，并转入到敲除gal1、gal7、gal10和ypl062w基因的酵母基因组上，实现重组菌株β-胡萝卜素的合成产量提高。
其中，所涉及的酵母内源基因包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合酶基因ERG13、乙酰乙酰辅酶A转乙酰酶ERG10、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19、法尼基焦磷酸(FPP)合酶基因ERG20、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶基因BTS1以及异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1，上述基因的获得可以酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得；
同时，本发明还涉及采用酵母中的氨基酸标记、启动子和终止子，包括CYC1终止子、GAL10启动子、GAL1启动子及其上游激活序列UAS、PGK1终止子、ACT1终止子、GPM1终止子、LEU2标记、TDH2终止子、FBA1终止子、ENO2终止子、HIS3标记、IDI1终止子、HXT7终止子、ERG13终止子、ERG19终止子、ERG10终止子、ADH1终止子，上述基因元件的获得也可以酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得；
在本发明中，上述各基因元件以及相关的上下游同源序列以酿酒酵母菌株BY4741的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到；而LEU2上游同源序列及LEU2标记是一并从质粒pRS405上PCR扩增下来，HIS3上游同源序列及HIS3标记是一并从质粒pRS313上PCR扩增下来。
本发明所涉及的外源基因包括来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)的甲羟戊酸激酶基因Sa MK、磷酸甲羟戊酸激酶基因Sa PMK，以及不同来源的用于合成β-胡萝卜素的四种基因：GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB、八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及番茄红素环化酶基因crtY。选取特定来源的合成番茄红素的功能基因集(crtE、crtB、crtI)与三种不同来源的crtY进行组合，具体为曼地亚红豆杉(Taxus xmedia)来源的Tm crtE、成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的Pa crtB、三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)来源的Bt crtI、成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的Pa crtY、杜氏盐藻(Dunaliella salina)来源的Ds crtY以及截短的雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)来源的Hp crtY，上述基因均为经过密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到。此外，本发明所用抗性标签也通过人工合成得到。
作为优选，所述基因片段1-9序列为：
基因片段1如SEQ ID NO:1所示、基因片段2如SEQ ID NO:2所示、基因片段3如SEQID NO:3所示、基因片段4如SEQ ID NO:4所示、基因片段5如SEQ ID NO:5所示、基因片段6如SEQ ID NO:6所示、基因片段7如SEQ ID NO:7所示、基因片段8如SEQ ID NO:8-10任意一项所示、基因片段9如SEQ ID NO:11-13任意一项所示；
其中，包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段8如SEQ ID NO:8所示；包含雨生红球藻来源crtY基因的基因片段8如SEQ ID NO:9所示；包含成团泛菌来源crtY基因的基因片段8如SEQ ID NO:10所示；
包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段9如SEQ ID NO:11所示；包含雨生红球藻来源crtY基因的基因片段9如SEQ ID NO:12所示；包含成团泛菌来源crtY基因的基因片段9如SEQ ID NO:13所示。
更优选地，所述酵母包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:11所示核苷酸序列；或包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:9所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:12所示核苷酸序列；或包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:10所示核苷酸序列以及SEQ IDNO:13所示核苷酸序列。进一步优选，上述包含SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:10所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的重组酵母菌株，保藏编号为CGMCCNo.10753，在本发明中记为SyBE_Sc0014CY06。
作为优选，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。除此之外，也可以以藻类、霉菌(如链霉菌等)和细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)为改造菌株将本发明所限定的基因元件和模块根据这些菌株的已被解析的类胡萝卜素生物合成路径来重组。
更优选地，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。进一步优选地，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C。
本发明所述重组酵母菌株能够大量的合成β-胡萝卜素，因此本发明还提供了所述重组酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用以及在生产以β-胡萝卜素为中间产物的产品(如虾青素)中的应用。
此外，本发明还提供了所述重组酵母菌株的构建方法，包括：
步骤1、构建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、gal1基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段1，以及由ypl062w基因上游同源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段2，利用敲除盒片段1和2通过酵母自身同源重组敲除酵母gal1、gal7、gal10和ypl062w基因，获得四敲基因酵母，备用；
将酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段1(基因片段模式图见图1)，即trp1位点上游同源序列-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-trp1位点下游同源序列，备用；
将四敲基因酵母kanMX抗性标签上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子以及kanMX抗性标签下游同源序列顺次拼接，获得基因片段2(基因片段模式图见图2)，即kanMX抗性标签上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-kanMX抗性标签下游同源序列，备用；
将酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段3(基因片段模式图见图3)，即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，备用；
将基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接，获得基因片段4(基因片段模式图见图4)，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3-TACT1-ACT1终止子及其下游同源序列，备用；
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行连接，获得融合基因BTS1-ERG20，然后将酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段5(基因片段模式图见图5)，即his3位点上游同源序列-HIS3-TENO2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，备用；
将酵母YGLCtau3位点上游同源序列、hphA抗性标签、IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子、酵母YGLCtau3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段6(基因片段模式图见图6)，即YGLCtau3上游同源序列-hphA-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7-YGLCtau3下游同源序，备用；
将酵母gal7基因下游同源序列、nat抗性标签、ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子、酵母gal1基因下游同源序列顺次拼接，获得基因片段7(基因片段模式图见图7)，即gal7下游同源序列-nat-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10-gal1下游同源序列，备用；
将酵母YMRWdelta15位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-KlURA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段8(基因片段模式图见图8)，即YMRWdelta15位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YMRWdelta15位点下游同源序列，备用；
将酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-KlURA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段9(基因片段模式图见图9)，即YNRCdelta9位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，备用；
步骤2、将基因片段1通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段1中trp1位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上trp1位点发生重组而整合到基因组上；
步骤3、将基因片段3通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段3中leu2位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上；
然后将基因片段4继续通过醋酸锂法转化到已转入基因片段3的四敲基因酵母中，通过基因片段4中TDH2终止子及其上游同源序列、ACT1终止子及其下游同源序列，与已整合的基因片段3上的TDH2终止子和ACT1终止子位点发生重组而插入到已整合基因片段3的四敲基因酵母基因组上；
步骤4、将基因片段5通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段5中his3位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上his3位点发生重组而整合到基因组上；
步骤5、将基因片段6通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段6中YGLCtau3位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上YGLCtau3位点发生重组而整合到基因组上；
步骤6、将基因片段7通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段7中gal7基因下游同源序列、gal1基因下游同源序列与四敲基因酵母基因组上的gal1基因下游及gal7基因下游位点发生重组而整合到基因组上；
步骤7、将基因片段2通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段2中kanMX抗性标签上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上kanMX抗性标签发生重组而整合到基因组上；
步骤8、将基因片段8通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段8中YMRWdelta15位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上YMRWdelta15位点发生重组而整合到基因组上；
步骤9、将基因片段9通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段9中YNRCdelta9位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上YNRCdelta9位点发生重组而整合到基因组上；
步骤10、完成步骤2-步骤9后获得所述重组酵母菌株，其中步骤2-步骤9不分先后顺序。
作为优选，所述四敲基因酵母具体构建方法为：
以质粒pWJ1042(全基因序列见SEQ ID NO:14所示)为模板，设计上、下游引物(针对质粒pWJ1042中DR-Kl URA3-DR营养标签涉及上下游引物，并在上、下游引物5’端各加上40bp同源序列即可)PCR扩增由酵母gal7基因下游40bp同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、gal1基因下游40bp同源序列顺次连接的敲除盒片段1，通过醋酸锂法转入酵母中，利用敲除盒片段1中gal7基因下游40bp同源序列、gal1基因下游40bp同源序列，与酵母基因组上顺次连接的gal7、gal10、gal1三个基因发生重组，将DR-Kl URA3-DR营养标签替代gal1、gal7、gal10三个基因整合到基因组上，完成gal1、gal7、gal10基因的敲除(示意图见图10)，然后通过SD-URA固体培养基筛选出正确菌株，正确菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布在5-氟乳清酸固体板再次筛选以回收Kl URA3标签，获得三敲基因酵母；
以酿酒酵母BY4742单敲库中的单敲菌株YPL062W的基因组为模板，设计上、下游引物PCR扩增由ypl062w基因上游394bp同源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游317bp同源序列顺次连接的敲除盒片段2，通过醋酸锂法转入三敲基因酵母中，利用敲除盒片段2中ypl062w基因上、下游同源序列，与三敲基因酵母基因组上的ypl062w基因发生重组，将kanMX抗性标签替代ypl062w基因整合到基因组上，完成ypl062w基因的敲除(示意图见图11)，然后通过含G418抗性的YPD固体板筛选出正确菌株，获得四敲基因酵母。
作为优选，所述基因片段1具体构建方法为：
将CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindIII和XhoI酶切位点的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
同时，将酵母trp1位点上游同源631bp序列、酵母trp1位点下游同源733bp序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在酵母trp1位点上、下游同源序列之间包含HindIII和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405(全基因序列见SEQ ID NO:15所示，质粒图谱见图12)，得到TRP1整合质粒pRS405-TRP，将上述得到的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1与pRS405-TRP质粒通过HindIII和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段1整合质粒，记为pRS405-TRP-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1，SacI和ApaI双酶切获得基因片段1，即trp1位点上游同源序列-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-trp1位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
作为优选，所述基因片段2具体构建方法为：
以四敲基因酵母基因组为模板，设计上、下游引物分别PCR扩增kanMX抗性标签上游123bp同源序列、下游538bp同源序列，同时设计上、下游引物从质粒pWJ1042上PCR扩增DR-Kl URA3-DR营养标签；
将CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindIII和XhoI酶切位点的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
将kanMX抗性标签上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1片段、kanMX抗性标签下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段2，即kanMX抗性标签上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-kanMX抗性标签下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为优选，所述基因片段3具体构建方法为：
将ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPM1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1；
同时，将酵母leu2位点上游同源561bp序列、LEU2标记、TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源584bp序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到LEU2整合质粒pRS405-LEU，将上述得到的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1与pRS405-LEU质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段3整合质粒，记为pRS405-LEU-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1，SacI和ApaI双酶切获得基因片段3，即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
作为优选，所述基因片段4具体构建方法为：
扩增基因片段3中TDH2终止子及其上游869bp同源序列、ACT1终止子及其下游355bp同源序列，然后将TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段4，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3-ACT1终止子及其下游同源序列，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段4整合质粒记为pleu-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3，PmeI酶切获得基因片段4，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-BtcrtI-PGAL3-ACT1终止子及其下游同源序列,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
作为优选，所述基因片段5具体构建方法为：
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行融合表达，通过OE-PCR方法用GGGS linker将BTS1的C端与ERG20的N端连接形成融合基因BTS1-ERG20；
将ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1；
将片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和PstI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1；
PCR分别扩增酵母his3位点上游同源312bp序列、HIS3标记、ENO2终止子以及酵母his3位点下游同源578bp序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在ENO2终止子、酵母his3位点下游同源序列之间包含BamHI和PstI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到HIS3整合质粒pRS405-HIS，将上述得到的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1与pRS405-HIS质粒通过BamHI和PstI酶切位点进行连接，得到基因片段5整合质粒，记为pRS405-HIS3-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1，SacI和ApaI双酶切获得基因片段5，即his3位点上游同源序列-HIS3-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
作为优选，所述基因片段6具体构建方法为：
将IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7；
PCR分别扩增酵母YGLCtau3位点上游391bp同源序列、hphA抗性标签、酵母YGLCtau3位点下游294bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI、PmeI以及PmeI、ApaI酶切位点，且在hphA抗性标签、酵母YGLCtau3位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到YGLC整合质粒pRS405-YGLC，将上述得到的片段TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7与pRS405-YGLC质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段6整合质粒，记为pRS405-YGLC-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7，然后进行PmeI酶切获得基因片段6，即YGLCtau3上游同源序列-hphA-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7-YGLCtau3下游同源序，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
作为优选，所述基因片段7具体构建方法为：
将ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10；
PCR扩增酵母gal7基因下游426bp同源序列、nat抗性标签、gal1下游234bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含包含SacI、PmeI以及PmeI、ApaI酶切位点，且在nat抗性标签、gal1下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到gal1710整合质粒pRS405-gal1710，将片段TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10与pRS405-gal1710质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段7整合质粒，记为pRS405-gal1710-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10，然后进行PmeI酶切获得基因片段7，即gal7下游同源序列-nat-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10-gal1下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
作为优选，所述基因片段8具体构建方法为：
将GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子通过OE-PCR方法顺次拼接起来，得到3种含不同来源的crtY的两端包含XbaI和SmaI酶切位点的片段PGAL1-crtY-TADH1；
分别PCR扩增酵母YMRWdelta15位点上游230bp同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、DR-Kl URA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游365bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在UAS与DR-Kl URA3-DR营养标签之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，然后与平末端载体pJET1.2(质粒图谱见图13)连接得到YMRW整合质粒pYMRW，将片段PGAL1-crtY-TADH1通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，然后进行PmeI酶切获得3种不同来源crtY的基因片段8，即YMRWdelta15位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YMRWdelta15位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:8-10所示。
作为优选，所述基因片段9具体构建方法为：
将GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子通过OE-PCR方法顺次拼接起来，得到3种含不同来源的crtY的两端包含XbaI和SmaI酶切位点的片段PGAL1-crtY-TADH1；
分别PCR扩增酵母YNRCdelta9位点上游259bp同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、DR-Kl URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游271bp同源序列，并通过OE-PCR顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在UAS与DR-Kl URA3-DR营养标签之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，然后与平末端载体pJET1.2连接得到YNRC整合质粒pYNRC，将片段PGAL1-crtY-TADH1通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，然后进行PmeI酶切获得3种不同来源crtY的基因片段9，即YNRCdelta9位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:11-13所示。
作为优选，在构建方法中，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。除此之外，也可以以藻类、霉菌(如链霉菌等)和细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)为改造菌株将本发明所限定的基因元件和模块根据这些菌株已被解析的类胡萝卜素生物合成路径来重组。更优选地，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。进一步优选地，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C。
同时，本发明还提供由本发明任意一种构建方法构建的重组酵母菌株。由本发明所述构建方法构建的重组酵母菌株用于生产β-胡萝卜素中时，β-胡萝卜素产量介于18-27mg/gDCW，远远超出了当前重组微生物菌株普遍的6-7mg/gDCW的产量。基于此，本发明提供了由本发明构建方法构建的重组酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用以及在生产以β-胡萝卜素为中间产物的产品(如虾青素)中的应用。
根据上述应用，本发明还提供了一种生产β-胡萝卜素的方法，将本发明所述重组酵母菌株或由本发明所述构建方法构建的重组酵母菌株经种子培养基活化后接种于发酵培养基中培养，培养后收集菌体细胞提取β-胡萝卜素。
其中，所述种子培养基优选为40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，其余为水。
所述酵培养基为40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖，其余为水。
所述培养优选为在30℃、250rpm条件下培养。
由以上技术方案可知，本发明构建四敲酵母菌株，为生产β-胡萝卜素提供优化的宿主细胞，通过选取不同来源的番茄红素环化酶crtY并配合特定来源的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，以及特定的酵母内源基因等，经模块化设计整合至优化的四敲酵母菌株基因组上，获得一株全新的重组菌株并实现了β-胡萝卜素的高产。
生物保藏说明
SyBE_Sc0014CY06，分类命名：酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae于2015年4月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10753。
附图说明
图1所示为基因片段1的基因元件模式图；其中，两端TRP1-L、TRP1-R分别表示酵母trp1位点上、下游同源序列；
图2所示为基因片段2的基因元件模式图；其中，两端kanMX-L、kanMX-R分别表示四敲基因酵母kanMX抗性标签上、下游同源序列；
图3所示为基因片段3的基因元件模式图；其中，两端LEU2-L、LEU2-R分别表示酵母leu2位点上、下游同源序列；
图4所示为基因片段4的基因元件模式图；其中，两端TTDH2-L、TACT1-R分别表示基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列和ACT1终止子及其下游同源序列；
图5所示为基因片段5的基因元件模式图；其中，两端HIS3-L、HIS3-R分别表示酵母his3位点上、下游同源序列；
图6所示为基因片段6的基因元件模式图；其中，两端YGLCtau3-L、YGLCtau3-R分别表示酵母YGLCtau3位点上、下游同源序列；
图7所示为基因片段7的基因元件模式图；其中，两端gal7-L、gal1-R分别表示酵母gal7基因下游同源序列和gal1下游同源序列；
图8所示为基因片段8的基因元件模式图；其中，两端YMRWdelta15-L、YMRWdelta15-R分别表示酵母YMRWdelta15位点上、下游同源序列，Ds/Hp/PacrtY基因元件表示杜氏盐藻来源/雨生红球藻来源/成团泛菌来源的crtY基因；
图9所示为基因片段9的基因元件模式图；其中，两端YNRCdelta9-L、YNRCdelta9-R分别表示酵母YNRCdelta9位点上、下游同源序列，Ds/Hp/Pa crtY基因元件表示杜氏盐藻来源/雨生红球藻来源/成团泛菌来源的crtY基因；
图10所示为敲除盒片段1敲除gal1、gal7、gal10基因的示意图；
图11所示为敲除盒片段2敲除ypl062w基因的示意图；
图12所示为质粒pRS405图谱；
图13所示为质粒pJET1.2图谱；
图14所示为本发明重组酿酒酵母的β-胡萝卜素的产量折线图；
图15所示为本发明重组酿酒酵母的β-胡萝卜素的单位细胞产量柱形图；其中，每个柱形的下半部分代表β-胡萝卜素的单位细胞产量；
图16所示为质粒pRS313图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中所涉及的一些质粒载体、菌株均可市售获得，如pJET1.2质粒载体购买自Thermo Scientific公司的CloneJET PCR Cloning Kit，#K1231；酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C购买自德国Scientific Research and Development GmbH的EUROSCARF，菌株编号为30000A；酿酒酵母BY4742单敲库菌株YPL062W购买自美国Thermo Fisher Scientific公司；质粒pRS405、pRS313(质粒图谱见图16)以及酿酒酵母BY4741是从BioVector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心-NTCC国家典型培养物保藏中心购买的。
对于本发明构建重组酵母菌株中所采用的各基因元件，如氨基酸标记、标签、内源基因、外源基因等均为本领域公知，本领域技术人员知晓其具体序列。为方便理解本发明，本发明对各基因片段中的各基因元件进行说明：
敲除盒片段1(SEQ ID NO:16所示)：1-40bp为gal7基因下游40bp同源序列；41-1615bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；1616-1655bp为gal1基因下游40bp同源序列。
敲除盒片段2(SEQ ID NO:17所示)：1-394bp为ypl062w基因上游394bp同源序列；395-1864bp为kanMX抗性标签序列；1865-2181bp为ypl062w基因下游317bp同源序列。
基因片段1(SEQ ID NO:1所示)：1-631bp为trp1位点上游631bp同源序列；632-637bp为BamHI酶切位点；638-640bp为无意义序列；641-646bp为HindIII酶切位点；647-901bp为CYC1终止子序列；902-2650bp为Bt crtI序列；2651-3318bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；3319-4248bp为Pa crtB序列；4249-4523bp为PGK1终止子序列；4524-4529bp为XhoI酶切位点；4530-5262bp为trp1位点下游同源733bp序列。
基因片段2(SEQ ID NO:2所示)：1-123bp为kanMX抗性标签上游123bp同源序列(即酵母ypl062w基因上游123bp同源序列)；124-1698bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；1699-1704bp为HindIII酶切位点；1705-1959bp为CYC1终止子序列；1960-3708bp为Bt crtI序列；3709-4376bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；4377-5306bp为Pa crtB序列；5307-5581bp为PGK1终止子序列；5582-5587bp为XhoI酶切位点；5588-6125bp为kanMX抗性标签下游538bp同源序列(即酵母ypl062w基因下游538bp同源序列)。
基因片段3(SEQ ID NO:3所示)：1-561bp为leu2位点上游同源561bp序列；562-1656bp为LEU2标记；1657-2056bp为TDH2终止子序列；2057-2062bp为BamHI酶切位点；2063-2349bp为ACT1终止子序列；2350-3858bp为截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1；3859-4526bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；4527-5708bp为Tm crtE序列；5709-6108bp为GPM1终止子序列；6109-6114bp为XhoI酶切位点；6115-6698bp为leu2位点下游同源584bp序列。
基因片段4(SEQ ID NO:4所示)：1-869bp为TDH2终止子及其上游同源序列869bp；870-2444bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；2445-2699bp为CYC1终止子序列；2700-4448bp为Bt crtI序列；4449-5108bp为GAL3启动子；5109-5463bp为ACT1终止子及其下游同源序列355bp。
基因片段5(SEQ ID NO:5所示)：1-312bp为his3位点上游312bp同源序列；313-975bp为HIS3标记；976-1375bp为ENO2终止子；1376-1381bp为BamHI酶切位点；1382-1668bp为ACT1终止子序列；1669-3177bp为截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1；3178-3845bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；3846-5921bp为融合基因BTS1-ERG20；5922-6121bp为FBA1终止子序列；6122-6127bp为PstI酶切位点；6128-6705bp为his3位点下游578bp同源序列。
基因片段6(SEQ ID NO:6所示)：1-391bp为YGLCtau3位点上游391bp同源序列；392-2050bp为hphA抗性标签；2051-2056bp为XhoI酶切位点；2057-3073bp为基因IDI1及其终止子序列；3074-3573bp为GAL7启动子序列；3574-3881bp为PDC1终止子序列；3882-4958bp为Sa PMK序列；4959-5626bp为5627-6547bp为Sa MK序列；6548-6947bp为HXT7终止子序列；6948-6953bp为BamHI酶切位点；6954-7247bp为YGLCtau3位点下游294bp同源序列。
基因片段7(SEQ ID NO:7所示)：1-426bp为gal7基因下游426bp同源序列(以gal7基因阅读框方向为准，其下游同源序列即为左臂同源序列)；427-1629bp为nat抗性标签；1630-1635bp为XhoI酶切位点；1636-3261bp为基因ERG13及其终止子序列；3262-3761bp为GAL7启动子序列；3762-5103bp为基因ERG19及其终止子序列；5104-5771bp为GAL10-GAL1双向启动子序列；5772-7118bp为基因ERG10及其终止子序列；7119-7124bp为BamHI酶切位点；7125-7358bp为gal1下游234bp同源序列。
包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段8(SEQ ID NO:8所示)：1-230bp为YMRWdelta15位点上游230bp同源序列；231-539bp为UAS序列；540-545bp为XbaI酶切位点；546-1002bp为GAL1启动子序列；1003-2757bp为杜氏盐藻来源crtY基因；2758-2976bp为ADH1终止子序列；2977-2982为SmaI酶切位点；2983-2986bp为无意义序列；2987-4534bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；4535-4899bp为YMRWdelta15位点下游365bp同源序列。
包含雨生红球藻来源crtY基因的基因片段8(SEQ ID NO:9所示)：1-230bp为YMRWdelta15位点上游230bp同源序列；231-539bp为UAS序列；540-545bp为XbaI酶切位点；546-1002bp为GAL1启动子序列；1003-2562为雨生红球藻来源crtY基因；2563-2781bp为ADH1终止子序列；2782-2787bp为SmaI酶切位点；2788-2791bp为无意义序列；2792-4339bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；4340-4704bp为YMRWdelta15位点下游365bp同源序列。
包含成团泛菌来源crtY基因；的基因片段8(SEQ ID NO:10所示)：1-230bp为YMRWdelta15位点上游230bp同源序列；231-539bp为UAS序列；540-545bp为XbaI酶切位点；546-1002bp为GAL1启动子序列；1003-2163bp为成团泛菌来源crtY基因；2164-2382bp为ADH1终止子序列；2383-2388bp为SmaI酶切位点；2389-2392bp为无意义序列；2393-3940bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；3941-4305bp为YMRWdelta15位点下游365bp同源序列。
包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段9(SEQ ID NO:11所示)：1-259bp为YNRCdelta9位点上游259bp同源序列；260-568bp为UAS序列；569-574bp为XbaI酶切位点；575-1031bp为GAL1启动子序列；1032-2786bp为杜氏盐藻来源crtY基因；2787-3005bp为ADH1终止子序列；3006-3011bp为SmaI酶切位点；3012-3015bp为无意义序列；3016-4563bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；4564-4834bp为YNRCdelta9位点下游271bp同源序列。
包含雨生红球藻来源crtY基因的基因片段9(SEQ ID NO:12所示)：1-259bp为YNRCdelta9位点上游259bp同源序列；260-568bp为UAS序列；569-574bp为XbaI酶切位点；575-1031bp为GAL1启动子序列；1032-2591bp为雨生红球藻来源crtY基因；2592-2810bp为ADH1终止子序列；2811-2816bp为SmaI酶切位点；2817-2820bp为无意义序列；2821-4368bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；4369-4639bp为YNRCdelta9位点下游271bp同源序列。
包含成团泛菌来源crtY基因的基因片段9(SEQ ID NO:13所示)：1-259bp为YNRCdelta9位点上游259bp同源序列；260-568bp为UAS序列；569-574bp为XbaI酶切位点；575-1031bp为GAL1启动子序列；1032-2192bp为成团泛菌来源crtY基因；2193-2411bp为ADH1终止子序列；2412-2417bp为SmaI酶切位点；2418-2421bp为无意义序列；2422-3969bp为DR-Kl URA3-DR营养标签序列；3970-4240bp为YNRCdelta9位点下游271bp同源序列。
DR-Kl URA3-DR营养标签序列中URA3为乳酸克鲁维酵母来源(Kluyveromyceslactis，Kl)。
在知晓上述各基因元件的具体序列后，本领域技术人员可按照常规引物设计原则进行扩增和OE-PCR拼接。同时，本发明所采用的SD培养基是在酵母筛选领域常用的一种培养基，根据酵母具有哪些基因缺陷而在基本培养基的组成上特意删减某一种成分或几种成分来实现筛选出目标菌株。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：四敲菌株的构建
以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，构建四基因敲除菌株CEN.PK2-1C△gal1,△gal7,△gal10::DR,△ypl062w::kanMX。具体过程如下：
首先构建△gal1,△gal7,△gal10::DR-Kl URA3-DR敲除盒，即敲除盒片段1，以质粒pWJ1042为模板，设计上、下游引物PCR扩增带基因上、下游40bp同源臂及DR-Kl URA3-DR营养标签的敲除盒片段，利用酵母自身的同源重组机制将该片段通过醋酸锂法酵母转化整合到酵母基因组上，转化后采用SD-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板(DR-Kl URA3-DR营养标签两端各有143bp的同向重复序列DR，酵母自身会利用这两段相同的序列发生同源重组而删除URA3基因以及其中一个DR；YPD培养基因为没有氨基酸营养缺陷这种筛选压力，这样自发删除了URA3的酵母菌能够生长。然后用5-FOA进行筛选，因为含有URA3的菌株在URA3基因编码的酶作用下可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长，从而筛选出删除URA3基因的菌)，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，即三基因敲除菌株，将该正确菌株命名为SyBE_Sc0014C011。敲除gal1、gal7、gal10的菌株将不会代谢D-半乳糖，从而可以维持胞内诱导物半乳糖浓度恒定，实现高效诱导。
然后，在菌株SyBE_Sc0014C011的基础上构建△ypl062w::kanMX敲除盒，以BY4742单敲库中的单敲菌株YPL062W的基因组为模板，设计上、下游引物PCR扩增带基因YPL062W上、下游同源序列及kanMX抗性标签的敲除盒片段2，将该片段通过酵母转化整合到酵母基因组上，转化后采用含200mg/L G418抗性的YPD固体板筛选四敲菌株(kanMX抗性标签可对遗传霉素G418这种抗生素产生抗性，从而利用G418板筛选出成功敲除了基因ypl062w的菌)，得到的转化子通过分纯培养后提取基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌，并将其命名为SyBE_Sc0014C012。
实施例2：基因片段1的构建
扩增CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子并顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindIII和XhoI酶切位点的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
同时，扩增酵母trp1位点上游同源631bp序列、酵母trp1位点下游同源733bp序列并顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在酵母trp1位点上、下游同源序列之间包含HindIII和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405(全基因序列见SEQ ID NO:15所示，质粒图谱见图12)，得到TRP1整合质粒pRS405-TRP，将上述得到的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1与pRS405-TRP质粒通过HindIII和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段1整合质粒，记为pRS405-TRP-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，分别用SacI和ApaI双酶切位点切割，获得基因片段1，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3：基因片段2的构建
从SyBE_Sc0014C012基因组上设计上、下游引物分别PCR扩增kanMX抗性标签上游123bp同源序列、下游538bp同源序列，从质粒pWJ1042上PCR扩增DR-Kl URA3-DR营养标签；将kanMX抗性标签上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、实施例2构建的TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1片段、kanMX抗性标签下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含PmeI酶切位点的基因片段2整合片段，即kanMX抗性标签上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-kanMX抗性标签下游同源序列，并与平末端载体pJET1.2连接得到kanMX整合质粒pkanMX，记为pkanMX-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切位点切割，获得基因片段2，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例4：基因片段3的构建
将ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPM1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1；同时，将酵母leu2位点上游同源561bp序列、LEU2标记、TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源584bp序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到LEU2整合质粒pRS405-LEU。将得到的上述片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1和pRS405-LEU质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段2整合质粒，记为pRS405-LEU-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，分别用SacI和ApaI双酶切位点切割，获得基因片段3，leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例5：基因片段4的构建
扩增基因片段3中TDH2终止子及其上游869bp同源序列、ACT1终止子及其下游355bp同源序列，然后将TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段4，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3-ACT1终止子及其下游同源序列，与平末端载体pJET1.2连接得到基因片段4整合质粒，记为pleu-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切位点切割，获得基因片段4，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例6：基因片段5的构建
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行融合表达，通过OE-PCR方法用GGGS linker(GGTGGTGGTTCT)将BTS1的C端与ERG20的N端连接形成融合基因BTS1-ERG20；从实施例4中LEU2整合质粒pRS405-LEU上扩增TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1片段；
将片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和PstI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1；同时，PCR分别扩增酵母his3位点上游同源312bp序列、HIS3标记、ENO2终止子以及酵母his3位点下游同源578bp序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在ENO2终止子、酵母his3位点下游同源序列之间包含BamHI和PstI酶切位点的片段，通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到HIS3整合质粒pRS405-HIS。将得到的上述片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1和pRS405-HIS质粒通过BamHI和PstI酶切位点进行连接，得到基因片段5整合质粒，记为pRS405-HIS-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用SacI和ApaI双酶切切割，获得基因片段5，即his3位点上游同源序列-HIS3-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
实施例7：基因片段6的构建
将IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7；同时，PCR分别扩增酵母YGLCtau3位点上游391bp同源序列、hphA抗性标签、酵母YGLCtau3位点下游294bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI、PmeI以及PmeI、ApaI酶切位点，且在hphA抗性标签、酵母YGLCtau3位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，通过SacI和ApaI连入载体pRS405，得到两端包含PmeI酶切位点的整合质粒pRS405-YGLC。将得到的上述片段TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7和pRS405-YGLC质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段6整合质粒，记为pRS405-YGLC-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7；
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切切割，获得基因片段6，即YGLCtau3上游同源序列-hphA-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7-YGLCtau3下游同源序，核苷酸序列如SEQID NO:6所示。
实施例8：基因片段7的构建
将基因ERG13及其终止子、GAL7启动子、基因ERG19及其终止子、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10；同时，PCR扩增酵母gal7基因下游426bp同源序列、nat抗性标签、gal1下游234bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含包含SacI、PmeI以及PmeI、ApaI酶切位点，且在nat抗性标签、gal1下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到两端包含PmeI酶切位点的整合质粒pRS405-gal1710。将得到的上述片段TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10和pRS405-gal1710质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段7整合质粒，记为pRS405-gal1710-nat-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切切割，获得基因片段7，即gal7下游同源序列-nat-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10-gal1下游同源序列，核苷酸序列如SEQID NO:7所示。
实施例9：基因片段8的构建
将GAL1启动子、3种不同来源的基因crtY(Pa crtY、Ds crtY或Hp crtY)ADH1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到3种含不同来源的crtY的两端包含XbaI和SmaI酶切位点的片段PGAL1-crtY-TADH1；同时，分别PCR扩增酵母YMRWdelta15位点上游230bp同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、DR-Kl URA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游365bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在UAS与DR-Kl URA3-DR营养标签之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，并与平末端载体pJET1.2连接得到YMRW整合质粒pYMRW。将上述得到的3种片段PGAL1-crtY-TADH1分别和pYMRW质粒通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，得到3种基因片段8整合质粒，统记为pYMRW-DR-Kl URA3-DR-PUAS-GAL1-crtY-TADH1。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切切割，获得3种不同来源crtY的基因片段8，即YMRWdelta15位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YMRWdelta15位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:8-10所示。
实施例10：基因片段9的构建
分别PCR扩增酵母YNRCdelta9位点上游259bp同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、DR-Kl URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游271bp同源序列，并通过OE-PCR顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在UAS与DR-Kl URA3-DR营养标签之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，并与平末端载体pJET1.2连接得到YNRC整合质粒pYNRC。将实施例9中的3种含不同来源crtY的片段PGAL1-crtY-TADH1分别和pYNRC质粒通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，得到3种基因片段9整合质粒，统记为pYNRC-DR-Kl URA3-DR-PUAS-GAL1-crtY-TADH1。
整合质粒转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
验证正确后，用PmeI酶切切割，获得3种不同来源crtY的基因片段9，YNRCdelta9位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:11-13所示。
实施例11：基因片段整合构建重组酿酒酵母菌株
基因片段1采用醋酸锂法将片段转化四敲酵母菌株SyBE_Sc0014C012，通过TRP1上、下游同源序列与酵母基因组上trp1位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014C015。
然后，将基因片段3采用醋酸锂法将片段转化酵母菌株SyBE_Sc0014C015，通过LEU2上、下游同源序列与酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，双缺色氨酸和亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc0014C035。
将基因片段4采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014C035，通过TDH2终止子上游同源序列和ACT1终止子下游同源序列发生重组而插入到基因组上之前整合的基因片段3的中间。转化后采用SD-URA-TRP-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，将该正确菌株命名为SyBE_Sc0014C038。
将基因片段5采用醋酸锂法将该片段转化上述重组酵母菌株SyBE_Sc0014C038，通过HIS3上、下游同源序列与酵母基因组上his3位点发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-TRP-LEU-HIS固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、组氨酸和亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc0014C041。
将基因片段6采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014C041，通过YGLCtau3两侧的上、下游同源序列发生重组而整合到基因组上。转化后采用含200mg/L潮霉素抗性的YPD固体板筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌，并将其命名为SyBE_Sc0014C043。
将基因片段7采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014C043，通过gal1710两侧的上、下游同源序列发生重组而整合到基因组上。转化后采用含100mg/L诺尔斯菌素抗性的YPD固体板筛选，得到的转化子通过分纯培养后提取基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌，并将其命名为SyBE_Sc0014C044。
将基因片段2采用醋酸锂法将该片段转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014C044，通过kanMX上的左、右同源序列发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-URA-TRP-LEU-HIS固体板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，将该正确菌株命名为SyBE_Sc0014C045。
采用醋酸锂法分别将含有3种不同来源的crtY的基因片段8片段单独转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014C045，通过YMRWdelta15的上、下游同源序列发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-URA-TRP-LEU-HIS固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014CY01、SyBE_Sc0014CY02、SyBE_Sc0014CY03。其中：
SyBE_Sc0014CY01:SyBE_Sc0014C045，△ymrwdelta15::PUAS-GAL1-Ds crtY-TADH1；
SyBE_Sc0014CY02:SyBE_Sc0014C045,△ymrwdelta15::PUAS-GAL1-Hp crtY-TADH1；
SyBE_Sc0014CY03:SyBE_Sc0014C045,△ymrwdelta15::PUAS-GAL1-Pa crtY-TADH1。
采用醋酸锂法分别将含有3种不同来源的crtY的基因片段9片段单独转化重组酵母菌株SyBE_Sc0014CY01、SyBE_Sc0014CY02、SyBE_Sc0014CY03，通过YNRCdelta9的上、下游同源序列发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SD-URA-TRP-LEU-HIS固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA3基因的正确菌株，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc0014CY04、SyBE_Sc0014CY05、SyBE_Sc0014CY06。其中：
SyBE_Sc0014CY04:SyBE_Sc0014CY01，△ynrcdelta9::PUAS-GAL1-Ds crtY-TADH1；
SyBE_Sc0014CY05:SyBE_Sc0014CY02，△ynrcdelta9::PUAS-GAL1-Hp crtY-TADH1；
SyBE_Sc0014CY06:SyBE_Sc0014CY03，△ynrcdelta9::PUAS-GAL1-Pa crtY-TADH1。
实施例12：重组酿酒酵母菌株的摇瓶发酵
试验材料：菌株SyBE_Sc0014CY04、SyBE_Sc0014CY05、SyBE_Sc0014CY06。
试验方法：
种子培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
发酵培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)及β-胡萝卜素产量。
β-胡萝卜素定量方法：取两等份的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，β-胡萝卜素的检测波长为452nm。
试验结果：如图14所示，发酵60h，菌株SyBE_Sc0014CY05和SyBE_Sc0014CY06的β-胡萝卜素产量相当，均达到210mg/L；菌株SyBE_Sc0014CY04积累159.36mg/Lβ-胡萝卜素。
如图15所示，相比发酵60h的β-胡萝卜素的单位细胞产量，菌株SyBE_Sc0014CY06的26.68mg/gDCW产量要高于菌株SyBE_Sc0014CY05的22.42mg/gDCW，而SyBE_Sc0014CY04产量在18mg/gDCW左右。由此可见，本发明构建的重组酿酒酵母菌株的β-胡萝卜素产量明显要高于当下重组微生物菌株的β-胡萝卜素产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (18)
1.一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10和ypl062w基因，且包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；
酵母ypl062w基因上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子以及酵母ypl062w基因下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；
酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3；所述截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1序列如SEQ ID NO:3的2350-3858bp所示；
基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、BtcrtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4；
酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段5；所述截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1序列如SEQ ID NO:5的1669-3177bp所示；
酵母YGLCtau3位点上游同源序列、hphA抗性标签、IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子、酵母YGLCtau3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段6；
酵母gal7基因下游同源序列、nat抗性标签、ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子、酵母gal1基因下游同源序列顺次拼接而成的基因片段7；
酵母YMRWdelta15位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段8；
酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段9。
2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述基因片段1-9序列为：
基因片段1如SEQ ID NO:1所示、基因片段2如SEQ ID NO:2所示、基因片段3如SEQ IDNO:3所示、基因片段4如SEQ ID NO:4所示、基因片段5如SEQ ID NO:5所示、基因片段6如SEQID NO:6所示、基因片段7如SEQ ID NO:7所示、基因片段8如SEQ ID NO:8-10任意一项所示、基因片段9如SEQ ID NO:11-13任意一项所示；
其中，包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段8如SEQ ID NO:8所示；包含雨生红球藻来源crtY基因的基因片段8如SEQ ID NO:9所示；包含成团泛菌来源crtY基因的基因片段8如SEQ ID NO:10所示；
包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段9如SEQ ID NO:11所示；包含雨生红球藻来源crtY基因的基因片段9如SEQ ID NO:12所示；包含成团泛菌来源crtY基因的基因片段9如SEQ ID NO:13所示。
3.根据权利要求2所述菌株，其特征在于，所述酵母包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:11所示核苷酸序列；或包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:9所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:12所示核苷酸序列；或包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:10所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:13所示核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述菌株，其特征在于，所述包含SEQ ID NO:1-7所示核苷酸序列、SEQ ID NO:10所示核苷酸序列以及SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的重组酵母菌株，保藏编号为CGMCC No.10753。
5.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。
6.根据权利要求5所述菌株，其特征在于，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C。
7.权利要求1-6任意一项所述菌株在生产β-胡萝卜素中的应用以及在生产以β-胡萝卜素为中间产物的产品中的应用。
8.权利要求1所述重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括：
步骤1、构建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、gal1基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段1，以及由ypl062w基因上游同源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段2，利用敲除盒片段1和2通过酵母自身同源重组敲除酵母gal1、gal7、gal10和ypl062w基因，获得四敲基因酵母，备用；
将酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段1，即trp1位点上游同源序列-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-trp1位点下游同源序列，备用；
将四敲基因酵母kanMX抗性标签上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子以及kanMX抗性标签下游同源序列顺次拼接，获得基因片段2，即kanMX抗性标签上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-kanMX抗性标签下游同源序列，备用；
将酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段3，即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，备用；所述截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1序列如SEQ ID NO:3的2350-3858bp所示；
将基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接，获得基因片段4，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3-TACT1-ACT1终止子及其下游同源序列，备用；
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行连接，获得融合基因BTS1-ERG20，然后将酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、ENO2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段5，即his3位点上游同源序列-HIS3-TENO2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，备用；所述截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1序列如SEQ ID NO:5的1669-3177bp所示；
将酵母YGLCtau3位点上游同源序列、hphA抗性标签、IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子、酵母YGLCtau3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段6，即YGLCtau3上游同源序列-hphA-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7-YGLCtau3下游同源序，备用；
将酵母gal7基因下游同源序列、nat抗性标签、ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子、酵母gal1基因下游同源序列顺次拼接，获得基因片段7，即gal7下游同源序列-nat-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10-gal1下游同源序列，备用；
将酵母YMRWdelta15位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段8，即YMRWdelta15位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YMRWdelta15位点下游同源序列，备用；
将酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-Kl URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段9，即YNRCdelta9位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，备用；
步骤2、将基因片段1通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段1中trp1位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上trp1位点发生重组而整合到基因组上；
步骤3、将基因片段3通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段3中leu2位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上；
然后将基因片段4继续通过醋酸锂法转化到已转入基因片段3的四敲基因酵母中，通过基因片段4中TDH2终止子及其上游同源序列、ACT1终止子及其下游同源序列，与已整合的基因片段3上的TDH2终止子和ACT1终止子位点发生重组而插入到已整合基因片段3的四敲基因酵母基因组上；
步骤4、将基因片段5通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段5中his3位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上his3位点发生重组而整合到基因组上；
步骤5、将基因片段6通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段6中YGLCtau3位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上YGLCtau3位点发生重组而整合到基因组上；
步骤6、将基因片段7通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段7中gal7基因下游同源序列、gal1基因下游同源序列与四敲基因酵母基因组上的gal1基因下游及gal7基因下游位点发生重组而整合到基因组上；
步骤7、将基因片段2通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段2中kanMX抗性标签上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上kanMX抗性标签发生重组而整合到基因组上；
步骤8、将基因片段8通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段8中YMRWdelta15位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上YMRWdelta15位点发生重组而整合到基因组上；
步骤9、将基因片段9通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段9中YNRCdelta9位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上YNRCdelta9位点发生重组而整合到基因组上；
步骤10、完成步骤2-步骤9后获得所述重组酵母菌株，其中步骤2-步骤9不分先后顺序。
9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述四敲基因酵母具体构建方法为：
以质粒pWJ1042为模板，设计上、下游引物PCR扩增由酵母gal7基因下游40bp同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、gal1基因下游40bp同源序列顺次连接的敲除盒片段1，通过醋酸锂法转入酵母中，利用敲除盒片段1中gal7基因下游40bp同源序列、gal1基因下游40bp同源序列，与酵母基因组上顺次连接的gal7、gal10、gal1三个基因发生重组，将DR-Kl URA3-DR营养标签替代gal1、gal7、gal10三个基因整合到基因组上，完成gal1、gal7、gal10基因的敲除，然后通过SD-URA固体培养基筛选出正确菌株，正确菌株用YPD液体培养基培养后取少许菌液涂布在5-氟乳清酸固体板再次筛选以回收Kl URA3标签，获得三敲基因酵母；
以酿酒酵母BY4742单敲库中的单敲菌株YPL062W的基因组为模板，设计上、下游引物PCR扩增由ypl062w基因上游394bp同源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游317bp同源序列顺次连接的敲除盒片段2，通过醋酸锂法转入三敲基因酵母中，利用敲除盒片段2中ypl062w基因上、下游同源序列，与三敲基因酵母基因组上的ypl062w基因发生重组，将kanMX抗性标签替代ypl062w基因整合到基因组上，完成ypl062w基因的敲除，然后通过含G418抗性的YPD固体板筛选出正确菌株，获得四敲基因酵母。
10.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段1具体构建方法为：
将CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindIII和XhoI酶切位点的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
同时，将酵母trp1位点上游同源631bp序列、酵母trp1位点下游同源733bp序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在酵母trp1位点上、下游同源序列之间包含HindIII和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到TRP1整合质粒pRS405-TRP，将上述得到的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1与pRS405-TRP质粒通过HindIII和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段1整合质粒，记为pRS405-TRP-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1，SacI和ApaI双酶切获得基因片段1，即trp1位点上游同源序列-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-trp1位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
11.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段2具体构建方法为：
以四敲基因酵母基因组为模板，设计上、下游引物分别PCR扩增kanMX抗性标签上游123bp同源序列、下游538bp同源序列，同时设计上、下游引物从质粒pWJ1042上PCR扩增DR-Kl URA3-DR营养标签；
将CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindIII和XhoI酶切位点的片段TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1；
将kanMX抗性标签上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1片段、kanMX抗性标签下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段2，即kanMX抗性标签上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-crtI-PGAL10-PGAL1-crtB-TPGK1-kanMX抗性标签下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
12.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段3具体构建方法为：
将ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPM1终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1；
同时，将酵母leu2位点上游同源561bp序列、LEU2标记、TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源584bp序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在TDH2终止子、酵母leu2位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到LEU2整合质粒pRS405-LEU，将上述得到的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1与pRS405-LEU质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段3整合质粒，记为pRS405-LEU-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1，SacI和ApaI双酶切获得基因片段3，即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-crtE-TGPM1-leu2位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
13.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段4具体构建方法为：
扩增基因片段3中TDH2终止子及其上游869bp同源序列、ACT1终止子及其下游355bp同源序列，然后将TDH2终止子及其上游同源序列、DR-Kl URA3-DR营养标签、CYC1终止子、BtcrtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次通过OE-PCR方法拼接起来，获得两端包含PmeI酶切位点的基因片段4，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3-ACT1终止子及其下游同源序列，将上述得到的片段与平末端载体pJET1.2连接，得到基因片段4整合质粒记为pleu-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-Bt crtI-PGAL3，PmeI酶切获得基因片段4，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-Kl URA3-DR-TCYC1-BtcrtI-PGAL3-ACT1终止子及其下游同源序列,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
14.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段5具体构建方法为：
将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行融合表达，通过OE-PCR方法用GGGS linker将BTS1的C端与ERG20的N端连接形成融合基因BTS1-ERG20；
将ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1；
将片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和PstI酶切位点的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1；
PCR分别扩增酵母his3位点上游同源312bp序列、HIS3标记、ENO2终止子以及酵母his3位点下游同源578bp序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI和ApaI酶切位点，且在ENO2终止子、酵母his3位点下游同源序列之间包含BamHI和PstI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到HIS3整合质粒pRS405-HIS，将上述得到的片段TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1与pRS405-HIS质粒通过BamHI和PstI酶切位点进行连接，得到基因片段5整合质粒，记为pRS405-HIS-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1，SacI和ApaI双酶切获得基因片段5，即his3位点上游同源序列-HIS-TACT1-tHMGR1-PGAL10-PGAL1-(BTS1-ERG20)-TFBA1-his3位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
15.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段6具体构建方法为：
将IDI1终止子、基因IDI1、GAL7启动子、PDC1终止子、Sa PMK、GAL10启动子、GAL1启动子、Sa MK、HXT7终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7；
PCR分别扩增酵母YGLCtau3位点上游391bp同源序列、hphA抗性标签、酵母YGLCtau3位点下游294bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含SacI、PmeI以及PmeI、ApaI酶切位点，且在hphA抗性标签、酵母YGLCtau3位点下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到YGLC整合质粒pRS405-YGLC，将上述得到的片段TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7与pRS405-YGLC质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段6整合质粒，记为pRS405-YGLC-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7，然后进行PmeI酶切获得基因片段6，即YGLCtau3上游同源序列-hphA-TIDI1-IDI1-PGAL7-TPDC1-PMK-PGAL10-PGAL1-MK-THXT7-YGLCtau3下游同源序，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
16.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段7具体构建方法为：
将ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子顺次通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含BamHI和XhoI酶切位点的片段TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10；
PCR扩增酵母gal7基因下游426bp同源序列、nat抗性标签、gal1下游234bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含包含SacI、PmeI以及PmeI、ApaI酶切位点，且在nat抗性标签、gal1下游同源序列之间包含BamHI和XhoI酶切位点的片段，然后通过SacI和ApaI酶切位点连入载体pRS405，得到gal1710整合质粒pRS405-gal1710，将片段TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10与pRS405-gal1710质粒通过BamHI和XhoI酶切位点进行连接，得到基因片段7整合质粒，记为pRS405-gal1710-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10，然后进行PmeI酶切获得基因片段7，即gal7下游同源序列-nat-TERG13-ERG13-PGAL7-TERG19-ERG19-PGAL10-PGAL1-ERG10-TERG10-gal1下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
17.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段8具体构建方法为：
将GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子通过OE-PCR方法顺次拼接起来，得到3种含不同来源的crtY的两端包含XbaI和SmaI酶切位点的片段PGAL1-crtY-TADH1；
分别PCR扩增酵母YMRWdelta15位点上游230bp同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、DR-Kl URA3-DR营养标签、YMRWdelta15位点下游365bp同源序列，并通过OE-PCR方法顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在UAS与DR-Kl URA3-DR营养标签之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，然后与平末端载体pJET1.2连接得到YMRW整合质粒pYMRW，将片段PGAL1-crtY-TADH1通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，然后进行PmeI酶切获得3种不同来源crtY的基因片段8，即YMRWdelta15位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YMRWdelta15位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:8-10所示。
18.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述基因片段9具体构建方法为：
将GAL1启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子通过OE-PCR方法顺次拼接起来，得到3种含不同来源的crtY的两端包含XbaI和SmaI酶切位点的片段PGAL1-crtY-TADH1；
分别PCR扩增酵母YNRCdelta9位点上游259bp同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、DR-Kl URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游271bp同源序列，并通过OE-PCR顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在UAS与DR-Kl URA3-DR营养标签之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，然后与平末端载体pJET1.2连接得到YNRC整合质粒pYNRC，将片段PGAL1-crtY-TADH1通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，然后进行PmeI酶切获得3种不同来源crtY的基因片段9，即YNRCdelta9位点上游同源序列-UAS-PGAL1-crtY-TADH1-DR-Kl URA3-DR-YNRCdelta9位点下游同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:11-13所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510435606.2A CN104962488B (zh) | 2015-07-22 | 2015-07-22 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510435606.2A CN104962488B (zh) | 2015-07-22 | 2015-07-22 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104962488A CN104962488A (zh) | 2015-10-07 |
| CN104962488B true CN104962488B (zh) | 2019-03-05 |
Family
ID=54216588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510435606.2A Active CN104962488B (zh) | 2015-07-22 | 2015-07-22 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104962488B (zh) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201804966VA (en) * | 2015-12-17 | 2018-07-30 | Evonik Degussa China Co Ltd | Gene cassette for homologous recombination knock-out in yeast cells |
| CN105779319B (zh) * | 2016-03-23 | 2019-04-16 | 天津大学 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| CN105950493B (zh) * | 2016-05-25 | 2019-12-27 | 天津大学 | 一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用 |
| CN107164254B (zh) * | 2016-09-13 | 2020-05-15 | 湖北广济药业股份有限公司 | 微生物及其用途 |
| CN106566779B (zh) * | 2016-10-28 | 2019-04-16 | 天津大学 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| CN106754448B (zh) * | 2017-02-08 | 2020-07-21 | 天津大学 | 一种重组酵母菌株及其应用 |
| CN106987550B (zh) * | 2017-05-18 | 2020-10-13 | 陕西师范大学 | 一种产β-胡萝卜素的重组菌及其构建方法和应用 |
| CN109136120B (zh) * | 2017-06-19 | 2022-08-09 | 武汉合生科技有限公司 | 微生物及其用途 |
| CN107287331B (zh) * | 2017-08-01 | 2020-06-26 | 北京大学 | 一种高效检测蓝藻细胞周期的方法 |
| CN109097385B (zh) * | 2018-07-26 | 2022-05-20 | 西安海斯夫生物科技有限公司 | 一种产β-胡萝卜素类球红细菌工程菌株及其构建方法 |
| CN111690690B (zh) * | 2019-03-11 | 2023-10-20 | 浙江医药股份有限公司 | 用于生产法尼烯的酿酒酵母 |
| CN109943492B (zh) * | 2019-04-03 | 2022-08-16 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种重组酵母菌株及其应用 |
| CN109943493B (zh) * | 2019-04-17 | 2021-05-18 | 天津大学 | 实现通用酶催化功能多样性的突变体菌株及其构建方法 |
| CN110195023B (zh) * | 2019-06-27 | 2021-01-05 | 天津大学 | 一种酿酒酵母菌株及其应用 |
| CN111057712B (zh) * | 2019-12-02 | 2022-05-24 | 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 | 重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| WO2021114029A1 (zh) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | 宜昌东阳光生化制药有限公司 | 提高酿酒酵母代谢产物产量的方法 |
| CN111187786A (zh) * | 2020-02-03 | 2020-05-22 | 天津大学 | 重组载体及其在制备比卡菌素中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589650A (zh) * | 2005-03-18 | 2014-02-19 | 米克罗比亚公司 | 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生 |
-
2015
- 2015-07-22 CN CN201510435606.2A patent/CN104962488B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589650A (zh) * | 2005-03-18 | 2014-02-19 | 米克罗比亚公司 | 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Construction of a Controllable β-carotene Biosynthetic Pathway by Decentralized Assembly Strategy in Saccharomyces cerevisiae;Wenping Xie 等;《Cellular and Metabolic Engineering》;20140131;125-133 * |
| 产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌的构建;高书良 等;《工业微生物》;20131231;14-17 * |
| 产虾青素酿酒酵母工程菌的构建;谢贵各 等;《中国医药生物技术》;20141231;446-452 * |
| 代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素;王贝贝 等;《生物工程学报》;20140825;1204-1216 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104962488A (zh) | 2015-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104962488B (zh) | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN105420134B (zh) | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN105087406B (zh) | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN106566779B (zh) | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN105779319B (zh) | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN109777815B (zh) | HMG-CoA合成酶基因RKHMGCS及其应用 | |
| CN113652440B (zh) | 3-酮脂酰辅酶a硫解酶基因rkacaa1-2及其应用 | |
| CN105861538B (zh) | 一种重组质粒及重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN109810999B (zh) | 一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法 | |
| CN109266663A (zh) | 一种桑树白藜芦醇合成酶、其编码基因及重组载体和应用 | |
| CN106244615B (zh) | 一种工程菌及其构建方法与在制备香叶醇中的应用 | |
| CN107641605A (zh) | 一种快速优化酵母细胞工厂的方法 | |
| KR100701319B1 (ko) | 라이코펜 생산능이 향상된 대장균 및 그를 이용한 라이코펜의 생산방법 | |
| CN109136119A (zh) | 微生物及其用途 | |
| CN108485996A (zh) | 一种新型产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及构建方法 | |
| WO2023208037A1 (zh) | 一种橙花叔醇合成酶及应用 | |
| CN106893684A (zh) | 一种重组酵母菌株及其应用 | |
| CN112409492B (zh) | 龙脑樟单萜合酶CcTPS1及其相关生物材料与应用 | |
| CN114806909B (zh) | 一种生产β-胡萝卜素的菌株及其应用 | |
| WO2018233531A1 (zh) | 微生物及其用途 | |
| CN111518739A (zh) | 角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法 | |
| CN114774297B (zh) | 产t-杜松醇的重组酿酒酵母及其应用 | |
| CN115975830A (zh) | 一种胞外转运番茄红素的酿酒酵母菌株构建及其应用 | |
| CN105886518B (zh) | 基因、表达载体、宿主细胞及其应用，高产玉米黄质的重组菌株的构建方法 | |
| CA3215316A1 (en) | Methods of isoprenoid synthesis using a genetically engineered hydrocarbonoclastic organism in a biofilm bioreactor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yuan Yingjin Inventor after: Xiao Wenhai Inventor after: Chen Yan Inventor after: Li Xia Inventor before: Xiao Wenhai Inventor before: Chen Yan Inventor before: Li Xia Inventor before: Yuan Yingjin |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |