CN111187786A - 重组载体及其在制备比卡菌素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组载体及其在制备比卡菌素中的应用。本发明通过研究表明，通过引入Bik1，Bik2，Bik3基因和PPTase、NpgA中至少一个的组合，能够实现复杂聚酮路径‑Bikaverin pathway在酿酒酵母中的首次合成，这是比卡菌素在外源物种中的首次合成。

Description

重组载体及其在制备比卡菌素中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组载体及其在制备比卡菌素中的应用。

背景技术

真菌聚酮是一大类结构和功能多样的天然产物，具有多样的临床相关的医学生物活性，包括抗生素、抗真菌、免疫抑制和抗癌活性。由于该类化合物种类巨多，生物活性明显，已经成为了筛选新药物开发新疗法的优秀候选分子。因此，此类产物的生物合成及大规模发酵，具有重要意义。真菌聚酮的生物合成是由一个多功能聚酮合酶从乙酰辅酶A开始通过聚合多个丙二酰辅酶A(或其他碳单元)形成初始骨架，然后经过相应的修饰蛋白催化形成最终产物。这是一个高度调控，多重迭代的过程，涉及了聚酮碳链的起始，延伸，环化和解离多等个环节。因此真菌聚酮的合成和大规模发酵也成为了一个难点。

比卡菌素(Bikaverin)是一种红色的四环聚酮化合物，具有抗细菌，抗真菌，抗原虫，抗肿瘤的效果，在农业，林业和临床医学上都有巨大的应用潜力。作为次级代谢产物，比卡菌素在自然界中主要由镰刀菌属(Fusarium)生产，受环境中的pH值，氮源等因素调节，同时又与硫元素，磷酸盐等因素相关。

目前研究已发现了一个推测的bikaverin生物合成基因簇，并在敲除研究的基础上提出了一种生物合成途径，但该途径尚未被完全表征，也没有通过功能实验的增益得到验证。在该推测的基因簇中包含有6个蛋白，分别为Bik1，Bik2，Bik3，Bik4，Bik5，Bik6，其中Bik1、Bik2和Bik3酶被预测负责bikaverin的合成，Bik4和Bik5被预测为转录调控因子，Bik6被推测为是一个渗透酶或转运蛋白。比卡菌素的合成是一个典型的聚酮合成过程。它的四环骨架首先由一个I型聚酮合酶(Type I PKS)，Bik1，催化形成。这是一个含有超过2000个氨基酸的多功能酶，包含了6个具有不同功能的域：初始单位酰基转移酶功能域(SAT)，酮基合酶功能域(KS)，丙二酰酰基转移酶功能域(MAT)，聚酮产物模板功能域(PT)，酰基载体蛋白功能域(ACP)和Claise环化酶功能域(CLC)，其中SAT功能域选择乙酰辅酶A为起始单元，将1个乙酰辅酶A锚定到ACP区，接着KS和MAT功能域将8个丙二酰辅酶A聚合到延伸的聚酮碳链上，最后由CLC功能域将该碳链环化并将其从ACP区解离出来。该释放的四环前体物，pre-bikaverin在单加氧酶Bik2和o-甲基转移酶Bik3的作用下经过两次单氧化，两次甲基化最终形成比卡菌素(图1)。

酵母作为一个被清楚阐释的模式生物，易操作，安全，已被广泛用来生产工业材料分子，然而真菌聚酮类物质，尤其是复杂聚酮类物质在酵母中的表达并不常见。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组载体及其在制备比卡菌素中的应用，该重组载体转化酵母菌后能够实现比卡菌素在酵母体内的表达。

本发明提供了Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种在构建产比卡菌素的酵母菌株中的应用。

本发明提供了基因表达模块，其包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种。

本发明所述基因表达模块包含如下I)～II)中至少一种：

I)、Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种，每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子；

II)、Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少两种的融合片段，每个融合片段的5’端连接启动子，3’端连接终止子。

一些实施例中，本发明所述表达模块包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少5种。

一些实施例中，本发明所述表达模块包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中任意2个组成的融合片段，以及其余4个基因中至少一种。

一些实施例中，所述启动子、终止子来自酿酒酵母。

所述启动子选自RPS2、TEF1、TPI1、PGK1、ENO2、TEF2或GAL1；

所述终止子选自CYC1、ACS2、ACS1、ZEO1、ADH2或HXT7。

一些具体实施例中，本发明所述的表达模块包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase；

或包括P_GAL1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_GAL1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_GAL1-Bik2、P_GAL1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_GAL1-Bik2-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA。

更具体的，本发明所述表达模块包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_RPS2-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_RPS2-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-NPGA-T_ADH2；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-BIK3-T_CYC1、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_GAL1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-T_CYC1、P_GAL1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7。

本发明所述的表达模块中，

Bik1的序列如SEQ ID NO：1或2所示；

Bik2的序列如SEQ ID NO：3或4所示；

Bik3的序列如SEQ ID NO：5或6所示；

Bik6的序列如SEQ ID NO：7或8所示；

PPTase的序列如SEQ ID NO：9所示；

NpgA的序列如SEQ ID NO：10所示。

本发明还提供了重组载体，其包括本发明所述的表达模块。

本发明所述重组载体的骨架载体为pSR416。

重组酵母菌，其由酵母菌转化本发明所述的重组载体制得

本发明重组酵母菌的底盘菌为酿酒酵母或奇异酵母。

本发明中，所述酿酒酵母选自BY4742、S288c、L-1528、UWOPS872421、YJM978、DBVPG6044、378604X、YJM981、273614N、UWOPS03-461.4、YIIc17-E5、DBVPG 1373、Y55、DBVPG1106、UWOPS05-227.2、UWOPS83-787.3、DBVPG6765、Y12、SK1、L-1374、YPS606、W303、322134S；

所述奇异酵母选自：CBS432、Y8.5、T21.4、Q62.5、Z1、Y7、Q89.9、Y8.1、Q32.3、Y9.6、N-17、Q59.1、Q74.4、CBS5829、Q95.3、Q69.8、S36.7、W7、YPS138、Z1.1、Q31.4、IFO 1804、A12、IV-44。

本发明所述的重组酵母菌在制备比卡菌素中的应用。

本发明还提供了一种制备比卡菌素的方法，其包括发酵本发明所述的重组酵母菌。

所述方法中，发酵的培养基中：

氮源包括无机氮源和酵母基础氮源；

所述无机氮源选自硫酸铵；

所述酵母基础氮源包括肌醇、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、硫酸铜、磷酸二氢钾、硼酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、氯化铁、氯化钙、碘化钾、钼酸钠、生物素、叶酸、氯化钠；

对于未采用GAL1启动子的重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源；对于采用GAL1启动子的重组酵母菌株则以半乳糖为碳源；

除碳源和碳源外，发酵培养基中还包括精氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、组氨酸、亮氨酸和腺嘌呤。

本发明中，所述发酵的条件为25～35℃，100～1000rpm，时间为1～10d。

所述发酵后，还包括以乙酸乙酯从菌体中提取比卡菌素的步骤。

本发明通过合成生物学策略，实现了复杂聚酮路径-Bikaverin pathway在酿酒酵母中的首次合成，这也是比卡菌素在外源物种中的首次合成。本发明首先通过GFP融合策略找到了比卡菌素在酵母合成过程中的瓶颈步骤：Bik1的催化步骤；然后通过更换Bik1的启动子，筛选出了GAL1启动子来表达Bik1蛋白实现了比卡菌素在酵母中的合成。同时本发明又筛选了Bik1，Bik2，Bik3的两个不同版本的序列蛋白，最终得到了一个优化的通路，当以BY4742酵母菌为底盘时，菌株的摇瓶产量达到了0.7mg/L。在此基础上本发明将Bik2，Bik3的启动子进行了优化：将Bik2，Bik3基因的启动子分别更换为GAL1启动子以及将Bik2，Bik3基因的启动子同时更换为GAL1启动子，从而筛选出了更加优化的Pathway通路，使摇瓶产量达到了3.56mg/L(以BY4742为底盘)。此外，由于pre-bikaverin到bikaverin的过程是由Bik2，Bik3反复交错催化修饰而成，为了更进一步的的优化Bik2与Bik3的催化过程，本发明提出了Bik2和Bik3蛋白融合策略，此策略大大提高了bikaverin的产量，当使用摇瓶培养时，产量达到了41.44mg/L(以BY4742为底盘)。此外，我们将最终优化后pathway，转入了48种不同的酵母底盘，通过24孔深孔板发酵，得到了高于BY4742产量8倍产量的优质底盘。

附图说明

图1示比卡菌素生物合成路径；

图2示比卡菌素途径组装示意图；

图3示比卡菌素通路质粒示意图；

图4示GFP融合策略解决Bik1的表达问题；a示GFP融合策略示意图，b示荧光观察个基因的表达水平，c示不同启动子表达Bik1蛋白；

图5示启动子对比卡菌素产量影响；a示yzm002/009质粒示意图b示yZM002/009转入酵母后的颜色cHPLC和MS确定酵母合成了比卡菌素d空心圆表示该蛋白使用版本1，实心圆表示该蛋白使用版本2；

图6示bik6，ppt，npga的删除对比卡菌素产量的影响；

图7示bikpathway各基因表达强度；

图8示启动子优化和蛋白融合策略，a示通过启动子优化和蛋白融合提高比卡菌素产量，b示yZM037质粒示意图；c示蛋白表达水平；d示YPG培养基发酵比卡菌素水平；

图9不同底盘产量图。

具体实施方式

本发明提供了重组载体及其在制备复杂聚酮-比卡菌素中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明提供了Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种在构建产比卡菌素的酵母菌株中的应用。

本发明提供了Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少两者的组合。

本发明提供了基因表达模块，其包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种。

本发明所述的基因表达模块中，基因的顺序不做限定，基因的数量为1～6个，基因可以融合也可不融合。当基因融合时，两基因之间连接有linker片段。

本发明中，所述基因表达模块包含如下I)～II)中至少一种：

I)、Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种，每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子；

II)、Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少两种的融合片段，每个融合片段的5’端连接启动子，3’端连接终止子。

具体的，本发明中，所述的基因表达模块由相互连接的转录单元组成。本发明中所述的转录单元包括顺序连接的启动子、基因片段、终止子。例如，Bik1基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、Bik1基因、终止子。Bik2基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、Bik2基因、终止子。Bik3基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、Bik3基因、终止子。Bik6基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、Bik1基因、终止子。PPTase基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、PPTase基因、终止子。NpgA基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、NpgA基因、终止子。

本发明中，所述的转录单元为：

Bik1基因转录单元、Bik2基因转录单元、Bik3基因转录单元、Bik6基因转录单元、PPTase基因转录单元、NpgA基因转录单元；

Bik1-Bik2融合片段的转录单元、Bik1-Bik3融合片段的转录单元、Bik1-Bik6融合片段的转录单元、Bik1-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-NpgA融合片段的转录单元、Bik2-Bik3融合片段的转录单元、Bik2-Bik6融合片段的转录单元、Bik2-PPTase融合片段的转录单元、Bik2-NpgA融合片段的转录单元、Bik3-Bik6融合片段的转录单元、Bik3-PPTase融合片段的转录单元、Bik3-NpgA融合片段的转录单元、Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik6-NpgA融合片段的转录单元、PPTase-NpgA融合片段的转录单元；

Bik1-Bik2-Bik3融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik6融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-Bik6融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-NpgA-PPTase融合片段的转录单元、Bik2-Bik3-Bik6融合片段的转录单元、Bik2-Bik3-PPTase融合片段的转录单元、Bik2-Bik3-NpgA融合片段的转录单元、Bik2-Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik2-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik2-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元；

Bik1-Bik2-Bik3-Bik6融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik3-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik3-PPTase融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik2-Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元、Bik2-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik3-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik2-Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik2-Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元；

Bik2-Bik3-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik3-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元、Bik1-Bik2-Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

本发明所述的转录单元中，融合片段中基因片段的连接顺序不做限定，以任何连接顺序进行连接都能获得良好的表达效果。

本发明所述的表达模块由相互连接的上述转录单元组成，并且，对每种转录单元的拷贝数、连接顺序、以及连接方向不做限定。

本发明所述表达模块中，转录单元的制备通过yeast golden gate技术实现。

各转录单元通过同源臂连接。在本发明实施例中，所述同源臂的左臂和右臂分别位于转录单元启动子的5’端和终止子3’端。本发明实施例中，所述同源臂的长度为50～60bp。优选为57bp。

本发明所述表达模块的制备方法为：通过versatile genetic assembly system(VEGAS)将转录单元组装到一起。

作为优选，本发明提供了如下表达模块：

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元和Bik2基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元和Bik3基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元和Bik3基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含NpgA基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元和Bik3基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、NpgA基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、NpgA基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元、NpgA基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和Bik6基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、PPTase基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和NpgA基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元和PPTase基因的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik1-Bik2融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik1-Bik2融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3、Bik6、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik1-Bik2融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种，以及Bik3、Bik6、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik1-Bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik1-Bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik2、Bik6、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik1-Bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种，以及Bik2、Bik6、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik6融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik1-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik1-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3、Bik2、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik1-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种，以及Bik3、Bik2、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-NpgA融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik1-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、Bik2基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik1-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3、Bik6、PPTase、Bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik1-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、Bik2基因的转录单元中至少一种，以及Bik3、Bik6、PPTase、Bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-PPTase融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik1-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、Bik2基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik1-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3、Bik6、NpgA、Bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik1-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、Bik2基因的转录单元中至少一种，以及Bik3、Bik6、NpgA、Bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik2-Bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik2-Bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik6、NpgA、PPTase中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik2-Bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、PPTase基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik6、NpgA、PPTase中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一些具体实施例中，基因表达模块包括：Bik2-Bik3融合片段的转录单元、Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、PPTase基因的转录单元。

在此表达模块中，Bik2-Bik3融合片段中，Bik2基因与Bik3基因以3×(GGGS)1inker连接。在此表达模块中，转录单元的连接顺序为：Bik2-Bik3融合片段的转录单元、Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、PPTase基因的转录单元。

其中，Bik2-Bik3融合片段的转录单元左右同源臂的序列分别为：VA1(SEQ ID NO：11)，VA3(SEQ ID NO：12)；

Bik1基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：VA3(SEQ ID NO：12)，VA5(SEQ IDNO：13)，

Bik6基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：VA5(SEQ ID NO：13)，VA6(SEQ IDNO：14)，

PPt基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：VA6(SEQ ID NO：14)，VA7(SEQ IDNO：15)，

NpgA基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：VA7(SEQ ID NO：15)，VA2(SEQ IDNO：16)。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik6融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik2-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik1基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik2-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik3、NpgA、PPTase中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik2-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、PPTase基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik3、NpgA、PPTase中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-NpgA融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik2-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、Bik1基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik2-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik3、Bik6、PPTase中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik2-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、Bik3、基因的转录单元、PPTase基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik6、Bik3、、PPTase中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-PPTase融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik2-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、Bik1基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik2-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik3、Bik6、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik2-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、Bik3、基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik6、Bik3、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-Bik6融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik3-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、PPTase基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik3-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik2、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik3-Bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik2、PPTase、NpgA中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-NpgA融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik3-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、Bik1基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik3-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik2、PPTase、Bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik3-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、Bik6基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik2、PPTase、Bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-PPTase融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik3-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik3-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik2、NpgA、Bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik3-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、Bik6基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik2、NpgA、Bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik6-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、PPTase基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik6-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik2、PPTase、Bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik6-NpgA融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、PPTase基因的转录单元、Bik3基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik2、PPTase、Bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有Bik6-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、NpgA基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有Bik6-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik2、NpgA、Bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有Bik6-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、NpgA基因的转录单元、Bik3基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik2、NpgA、Bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含NpgA-PPTase融合片段的转录单元。

一种实施方式中，含有NpgA-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik3基因的转录单元、Bik6基因的转录单元中至少一种。

另一种实施方式中，含有NpgA-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1、Bik2、Bik6、Bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。

另一种实施方式中，含有NpgA-PPTase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含Bik1基因的转录单元、Bik2基因的转录单元、Bik6基因的转录单元、Bik3基因的转录单元中至少一种，以及Bik1、Bik2、Bik6、Bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik6融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-Bik6融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-NpgA-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-Bik6融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3-Bik6融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik3-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik2-Bik3-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik3-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik6-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3-PPTase-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3-Bik6-NpgA融合片段的转录单元。

一种基因表达模块，其包含Bik1-Bik2-Bik3-Bik6-PPTase融合片段的转录单元。

一些实施例中，本发明所述表达模块包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少5种。

一些实施例中，本发明所述表达模块包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中任意2个组成的融合片段，以及其余4个基因中至少一种。

本发明所述的表达模块中，对基因的连接顺序不做限定，任意顺序的连接都能够实现本发明的目的；所述的表达模块中，对转录单元的拷贝数也不做限定，尽管在实施例中，仅验证了每种基因1个拷贝，实现酵母中比卡菌素的表达，但根据本领域的公知常识，提高基因的拷贝数有利于酶促反应产物产量的提高。在本发明中，也不限定表达模块中基因的转录方向，其可与实施例中所展示的方向一致，也可以与其呈反向互补关系。

一些实施例中，所述启动子、终止子来自酿酒酵母。

所述启动子选自RPS2、TEF1、TPI1、PGK1、ENO2、TEF2或GAL1；

所述终止子选自CYC1、ACS2、ACS1、ZEO1、ADH2或HXT7。

一些具体实施例中，本发明所述的表达模块包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_ENo2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENo2-PPTase；

或包括P_GAL1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_GAL1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_GAL1-Bik2、P_GAL1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_GAL1-Bik2-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA。

更具体的，本发明所述表达模块包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_RPS2-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_RPS2-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-NPGA-T_ADH2；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-BIK3-T_CYC1、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_GAL1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENo2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-T_CYC1、P_GAL1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7。

本发明所述的表达模块中，

Bik1的序列如SEQ ID NO：1或2所示；

Bik2的序列如SEQ ID NO：3或4所示；

Bik3的序列如SEQ ID NO：5或6所示；

Bik6的序列如SEQ ID NO：7或8所示；

PPTase的序列如SEQ ID NO：9所示；

NpgA的序列如SEQ ID NO：10所示。

本发明还提供了重组载体，其包括本发明所述的表达模块。

本发明所述的重组载体中，包括至少一个本发明所述的表达模块。

所述重组载体中包含一个或多个本发明所述的表达模块，获得的表达载体中，包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种，也可包括Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少两者的融合片段，每种基因的拷贝数可为1也可为多个。

本发明所述重组载体的骨架载体为pSR416。

重组酵母菌，其由酵母菌转化本发明所述的重组载体制得。

本发明所述的重组酵母菌至少转化有一个本发明所述的重组载体。

本发明所述的重组酵母菌中，至少含有Bik1转录单元、Bik2转录单元、Bik3转录单元和NpgA转录单元。

或者，本发明所述的重组酵母菌中，至少含有Bik1转录单元、Bik2转录单元、Bik3转录单元和PPTase转录单元。

或者，本发明所述的重组酵母菌中，至少含有Bik1转录单元、Bik2转录单元、Bik3转录单元、PPTase转录单元和NpgA转录单元。

或者，本发明所述的重组酵母菌中，至少含有Bik1转录单元、Bik2转录单元、Bik3转录单元、Bik6转录单元、PPTase转录单元和NpgA转录单元。

本发明所述的重组酵母菌中的转录单元可位于同一个重组载体上，也可位于多个重组载体上。每个重组载体中的表达模块的数量不做限定，每个表达模块中的转录单元的数量也不做限定，可位于同一重组载体的不同表达模块中，也可位于同一重组载体的同一表达模块中。其连接顺序、连接方向与拷贝数皆不做限定。

所述重组酵母菌的制备方法包括电转、氯化钙法。

本发明重组酵母菌，其底盘菌为酿酒酵母或奇异酵母。

本发明中，所述酿酒酵母选自BY4742、S288c、L-1528、UWOPS872421、YJM978、DBVPG6044、378604X、YJM981、273614N、UWOPS03-461.4、YIIc17-E5、DBVPG 1373、Y55、DBVPG1106、UWOPS05-227.2、UWOPS83-787.3、DBVPG6765、Y12、SK1、L-1374、YPS606、W303、322134S；

所述奇异酵母选自：CBS432、Y8.5、T21.4、Q62.5、Z1、Y7、Q89.9、Y8.1、Q32.3、Y9.6、N-17、Q59.1、Q74.4、CBS5829、Q95.3、Q69.8、S36.7、W7、YPS138、Z1.1、Q31.4、IFO 1804、A12、IV-44。

本发明所述的重组酵母菌在制备比卡菌素中的应用。

本发明还提供了一种制备比卡菌素的方法，其包括发酵本发明所述的重组酵母菌。

所述方法中，发酵的培养基中：

氮源包括无机氮源和酵母基础氮源；

所述无机氮源为硫酸铵；

所述酵母基础氮源包括肌醇、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、硫酸铜、磷酸二氢钾、硼酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、氯化铁、氯化钙、碘化钾、钼酸钠、生物素、叶酸、氯化钠；

对于未采用GAL1启动子的重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源；对于采用GAL1启动子的重组酵母菌株则以半乳糖为碳源；

除碳源和碳源外，发酵培养基中还包括营养缺陷型氨基酸。

本发明中，所述发酵的条件为25～35℃，100～1000rpm，时间为1～10d。

所述发酵后，还包括以乙酸乙酯从菌体中提取比卡菌素的步骤。

本发明通过合成生物学策略，实现了复杂聚酮路径-Bikaverin pathway在酿酒酵母中的首次合成，这也是比卡菌素在外源物种中的首次合成。本发明首先通过GFP融合策略找到了比卡菌素在酵母合成过程中的瓶颈步骤：Bik1的催化步骤；然后通过更换Bik1的启动子，筛选出了GAL1启动子来表达Bik1蛋白实现了比卡菌素在酵母中的合成。同时本发明又筛选了Bik1，Bik2，Bik3的两个不同版本的序列蛋白，最终得到了一个优化的通路，当以BY4742酵母菌为底盘时，菌株的摇瓶产量达到了0.7mg/L。在此基础上本发明将Bik2，Bik3的启动子进行了优化：将Bik2，Bik3基因的启动子分别更换为GAL1启动子以及将Bik2，Bik3基因的启动子同时更换为GAL1启动子，从而筛选出了更加优化的Pathway通路，使摇瓶产量达到了3.56mg/L(以BY4742为底盘)。此外，由于pre-bikaverin到bikaverin的过程是由Bik2，Bik3反复交错催化修饰而成，为了更进一步的的优化Bik2与Bik3的催化过程，本发明提出了Bik2和Bik3蛋白融合策略，此策略大大提高了bikaverin的产量，当使用摇瓶培养时，产量达到了41.44mg/L(以BY4742为底盘)。此外，我们将最终优化后pathway，转入了48种不同的酵母底盘，通过24孔深孔板SC-Ura发酵，得到了高于BY4742产量8倍产量的优质底盘。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

在酵母中构建比卡菌素生物合成途径：为了在酿酒酵母中实现bikaverin生物合成途径的异种表达，我们选取了Bik1，Bik2，Bik3，Bik6以及Pptase和NpgA等6个基因。

其中Bik1，Bik2，Bik3来源于F.fujikuroi，分别为聚酮合酶，单加氧酶，甲基化酶，它们是比卡菌素合成的必需基因。

PPtase与NpgA为磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyltransferase)，其功能是为了激活聚酮合酶Bik1的ACP功能域。其中PPtase来源于F.fujikuroi，NpgA来源于A.nidulans，由于无法预知这两个蛋白是否能够在酵母中良好表达及是否可以激活Bik1的ACP域，所以我们在构建时，将这两个PPtase都构建进了bikaverin pathway里面。

此外Bik6是一个功能未知，被推测为参与转运的一个蛋白，在Ffujikuroi中，该基因敲后，F.fujikuroi仍能表达比卡菌素，但是产量会大大降低，因此在设计酵母bikaverinpathway时，我们也将其考虑了进去。

此外，在NCBI数据库里，我们发现虽然同在F.fujikuroi种属中，报道出的Bik1，bik2，bik3蛋白序列也有差异，为了保险起见，我们在Bik1，bik2，bik3基因的选择时，分别选取了两个版本(版本1accession numbers：Bik1，CAB92399；Bik2，CAJ76275；Bik3，CAJ76274；Bik6，CAM90596；版本2：Bik1，S0DZM7；Bik2，S0E2X6；Bik3，S0E608；Bik6，S0DZN4)。

设计了一个酵母编码的bikaverin基因簇，包括bik1、bik2、bik3和bik6基因，以及PKS酶翻译后激活ACP结构域所需的PPTase(磷酸戊二醇转移酶)。我们从NCBI蛋白数据库中的两条F.fujikuroi记录中检索到Bik1、Bik2、Bik3和Bik6的蛋白序列：version 1(加入号：Bik1，CAB92399；Bik2 CAJ76275；Bik3 CAJ76274；2017年和修订版本2(加入号：Bik1，S0DZM7；Bik2 S0E2X6；Bik3 S0E608；Bik6，S0DZN4)。我们利用BioPartsBuilder将所选择的基因的蛋白序列反向翻译成核苷酸序列，并优化密码子以适配酵母。

在构建代谢通路的过程中，首先利用yeast golden gate的方法将基因与启动子、终止子以及左右同源臂(VA)连接在一起形成转录单元(TU)。其中基因片段由公司直接合成，启动子和终止子均从酿酒酵母BY4742基因组中PCR获得。然后通过versatile geneticassembly system(VEGAS)将构建好的转录单元组装到一起，装配成完整的代谢通路。组装流程示意图见图2。

组装的质粒首先经过酵母菌落pcr验证，然后将质粒回转入大肠杆菌Top10菌株中，经测序正确后，将质粒重新转入酵母BY4742底盘中。在最初的pathway设计中，Bik1使用RPS2启动子，Bik2使用TEF1启动子，Bik3使用TPI1启动子，Bik6使用PGK1启动子，PPt使用ENO2启动子，NPGA使用TEF2启动子，见图3。

我们将得到的pathway质粒(版本1：yZM001；版本2yZM006)转入酵母中，并没有检测到有比卡菌素合成。于是我们开发了一个GFP融合策略，来寻找代谢通路的瓶颈。我们首先将一个GFP标签融合到不同基因上，然后检测GFP的荧光，发现Bik1的荧光几乎看不到，表明bik1的表达有问题。为解决这个问题，我们分别使用RPL43A，GPM，GAL1启动子将Bik1的启动子进行了更换，发现当使用GAL1启动子时，Bik1得到了良好的表达。见图4。

于是我们将Bik1使用GAL1启动子的质粒(版本1：yZM002；版本2：yZM009见图5a)转入酵母BY4742中。在SC-Ura(半乳糖为碳源)的培养基中，yZM009能使酵母变的有颜色(见图5b)，通过HPLC和MS检测，证实酵母生产了比卡菌素(图5c)。而使用版本1蛋白的质粒yZM002则不能使酵母产生颜色(见图5b)，也检测不到比卡菌素。随后我们又构建了一些版本一与版本二蛋白混合使用的质粒，通过对比发现，当全部使用版本2的蛋白时，摇瓶产量最高(0.7mg/L)，见图5d。于是后续实验全部采用版本2的蛋白。

此外我们也探索了删除Bik6，和只是用一种pptase对产量的影响，发现bik6的删除对酵母生产比卡菌素没有明显影响，当只是用PPt或只是用NpgA时，比卡菌素的产量会减少，见图6。当完全删除PPt和NpgA时，菌株无法生产比卡菌素，见图6。

在yZM009的基础上，我们利用GFP融合策略，检测各蛋白的表达水平，发现Bik2，Bik3的表达水平相对Bik1较低，而PPtase的表达总量相对较高，图7。

为了更进一步优化比卡菌素的产量，我们将比卡菌素通路进行了启动子优化。在yZM009的基础上，我们将Bik2的启动子由TEF1更换为GAL1启动子(yZM029)，使产量提高到了2.9mg/L；将Bik3的启动子由TPI1更换为GAL1后(yZM030)，产量提高到了1.37mg/L；而同时将Bik2，Bik3的启动子换为GAL1时(yZM031)，产量提高到了3.56mg/L。在yZM031的基础上，当Bik2与Bik3融合后(yZM037，见图8b)，摇瓶产量提高到了41.44mg/L，图8。(然而当Bik2于Bik3以相反方向融合时，我们发现，反向的融合的蛋白Bik3-Bik2并无法生产比卡菌素。我们同时又对比了融合前后的蛋白表达水平，并没有发现显著性变化。)当我们化成更加丰富的YPG(YP+20g Gal)培养基时，产量达到了131.48mg/L。当我们进一步在培养基加倍半乳糖(使用YP+40g Gal)后，产量达到了202.75mg/L。(见图8)为了进一步检测构建的pathway对酵母底盘的适配性以及筛选高产底盘，我们利用融合后的pathway(yZM037)对48种酵母底盘进行了筛选，其中24种为酿酒酵母，24种为奇异酵母。经过24孔深孔板SC-Ura发酵，我们筛选出了产量比BY4247(15.8mg/L)高8倍的多个优质底盘，如酿酒酵母378604X(119.2mg/L)，L-1528(91mg/L)，Y12(108.5mg/L)，奇异酵母IFO 1804(93.2mg/L)，图9。

实施例中所述摇瓶、深孔板发酵方法为：

摇瓶发酵：挑取酵母菌落接入5mlSU-Ura液体培养基中，30℃，250rpm，过夜培养。然后收集细胞，使用无菌水洗涤3次，以初始OD＝0.5OD转接到30mlSC-URA(如有GAL1启动子则使用半乳糖为碳源，没有使用GAL1启动子的菌株以葡糖糖为碳源)，30℃，250rpm，培养4天。

24深孔板发酵：首先酵母菌落接入24深孔板(每孔加有1.5mlSC-Ura液体培养基)，30℃，250rpm，过夜培养。然后收集细胞，使用无菌水洗涤3次，以初始OD＝0.5OD转接到新的24深孔板中，每孔加有1.5ml SC-Ura液体培养基(半乳糖为碳源)，30℃，250rpm，培养4天。

比卡菌素提取方法：

摇瓶发酵：使用2ml离心管，收集适量菌体(摇瓶发酵：2-5ml，24深孔板发酵：200μL)，12000rpm离心10min，去上清，加入500μL无菌水，加入200μL玻璃珠，加入500μL乙酸乙酯，涡旋振荡20min，转移有机相至新管中，如此抽提5次，将抽提的有机相，于真空旋干机中旋干，加入500μL乙腈溶解旋干后的产物。

表1菌株基因型

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 重组载体及其在制备比卡菌素中的应用

<130> MP1925957

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6031

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcttctt ctgctgacgt ttacgttttc ggtgaccaat ctaccccagt tttggacaag 60

ttgcaagctt tggttagagt taaggacaac gctttgttga cctctttctt gggtgaagct 120

ttcttggctg ttagaagaga aatcgtttct ttgtcttctt tggaaagaaa gtctatccca 180

gaagctgaat ctttgtcttt gttgttggaa ggtgttagaa gatctgaacc acacgctgct 240

ttggactctg ctttcgtttg tatctacgaa atcggttact acatcgacag atgttgtcac 300

tgtgctaagg acgttttcga aatctctaga ttgggtgttg aagctgctac cgttgctttc 360

agattgggta tgcacgttag aagaagagct gaaaacttgg gttactctac cccatcttct 420

tggtctatga tcttgtcttc taaccaagaa gaattggttt ctgaagcttt gaaggaattc 480

tctaaggaaa agaacttgac ctactcttct agaccataca tctctgctac cggtccaggt 540

ttcaccacca tctctggtcc accatctatc ttggaatctg ttaagtcttg tgacaccttc 600

tctggtaaga gattgtaccc agctccaatc tacggtccat accacaactc ttcttcttac 660

tctgaatctt ctttggaaca cggtttggct tctatcttgg aagacgttgg tttcttggaa 720

aacgaaatgt tgatcccaat catctcttgt gcttctggtt ctagattgga ccaattgtct 780

ttcggtaact tgttgaagaa cgttttgtct tctgctttgt ctcaacaaat cagaatggac 840

ttggttaccg acgctttggt tgaaaccgtt tctggtaccg aagctacctt gatcccagtt 900

aacgctcaaa ccaccgtttg ttctttggct gactggttgg ctaagagagg tgctaccacc 960

agaatcggtc caaccttgga atctttgacc aaggacagag ctgaaccaaa cttggctcca 1020

ggtgacgaaa acaagatcgc tatcatcggt ttctctggta gattcccaga agctgacaac 1080

ttggacgaat tctgggactt gttgatcaga ggtttggacg ttcacaagcc agttccagaa 1140

gaaagattcg ctcgcgacca ctacgaccca accggtcaaa gaaagaacac ctctcaagtt 1200

caatacggtt gttggttgaa gtctgctggt tacttcgaca cccaattctt ccacatgtct 1260

ccaaaggaag ctatgcaaac cgacccagct caaagattgg ctttgttgac cgcttacgaa 1320

gctttggaaa tggctggtgt tgttccagac agaaccccat ctacccaaag aaacagagtt 1380

ggtgtttact acggtaccac ctctaacgac tggggtgaag ttaactcttc tcaagacgtt 1440

gacacctact acatcccagg tgctaacaga gctttcatcc caggtagagt taactacttc 1500

ttcaagttca ccggtccatc tatcgctgtt gacaccgctt gttcttcttc tttggctgct 1560

atcaacttgg ctatcacctc tttgaagaac agagactgta acaccgctat cgctggtggt 1620

accaacgtta tgaccaaccc agacaacttc gctggtttgg acagaggtca cttcttgtct 1680

agaaccggta actgtaaggc tttcaacgac ggtgctgacg gttactgtag agctgacggt 1740

atcggtacct tgatcttgaa gagattgcca gacgctatcg ctgactctga cccaatcttc 1800

ggtgttatct tgggtgctca caccaaccac tctgctgaat ctgtttctat caccagacca 1860

ttggctgacg ctcaagaata cttgttcaag aagttgttga acgaaaccgg tatccaccca 1920

cacgacgttt cttacgttga aatgcacggt accggtaccc aagctggtga cgctgttgaa 1980

atgagatctg ttttgaactc tttcgctttc gaccactcta gaccaagaga caagtctttg 2040

tacttgggtt ctgttaaggc taacgttggt cacgctgaat ctgcttctgg tgttttggct 2100

atcatcaagg ttttgttgat gatgcaaaag aacaccatcc caccacactg tggtatcaag 2160

accaagatca accaaggttt cccaaaggac ttggaccaca gaggtgttag aatcgctttg 2220

aaggactctg ttgactggtc tagaccagaa ggtggtaaga gaagagtttt ggttaacaac 2280

ttctctgctg ctggtggtaa cacctctttg ttgttggaag acggtccagc tgttcaccca 2340

gctagacaac accaagacgg tgacgctaga accgaacacg ttgttgctgt ttctgctaga 2400

tctaccaagg ctttggaaga aaacttgaag gctttggaag cttacatcgc taactcttgg 2460

gctccagaag gtgaattgtt gtctcaattg tcttacacca ccaccgctag aagagttcac 2520

cactctagaa gagttgcttt cgttaccaac ggtttggacg acttgagaaa gtctttgttg 2580

aaggctgcta ccgacgctgg tcaagttaag ggtatcccag ctgtttctcc aaaggttggt 2640

ttcttgttca ccggtcaagg tgctcaagaa accgctatgg ctatcggtta ctacaagtct 2700

ttctcttctt tcagatctga catccaccaa ttggactcta tcgctacctt gcaaggtttg 2760

ccatctgttt tgccattgat ccacggtacc accccagttg aagacttgtc tgctgttgtt 2820

gttcaattgg gtacctgtat catccaaatc tctttggcta gattctggat ctctttgggt 2880

atcaccccac aatacgttat cggtcactct ttgggtgaat acgctgcttt gcaaatcgct 2940

ggtgttttgt ctgttaacga cgctatcttc ttgtgtggtc acagagctgc tttgttggac 3000

aagaagtgta ccgcttacac ccacggtatg gttgctgtta aggctgctgc tgacgacttg 3060

agacaacaca tctcttctga cttgaaggtt gaaatcgctt gtgttaacgg tgctgaagac 3120

accgttttgt ctggtccaaa cgctgacatc gaatctttgt gtggtaagtt gacccaagct 3180

ggttacaagt tgcacaagtt ggaaatccca ttcgctttcc actcttctca agttgaccca 3240

atcttggacg acttggaaga attggcttct caagttggtt tccacgaacc aaagttgcca 3300

atcgtttctc cattgttgag aaccttgttg accggtgaca ccttgggtcc acaatacatc 3360

agaagacact gtagagaaac cgttgacttc ttgggtgcta tcaagatggc tgaatctcaa 3420

ggtatcatgg acagatctgg tatgtgtatc gaaatcggtg ctcacccaat cttgaccaga 3480

atggttaagt ctatcatcgg tcaagacttc agatgtttgg cttctttgag aagaaaggaa 3540

gaccacttca agaccttggc tgactctttg tgtgctttgc acttggctgg tttctctgtt 3600

aactgggacg aataccacag agacttcgct tcttctagaa acgttttgca attgccaaag 3660

tactcttggc aattggctaa ctactggatg caatacaagt actcttggtg tttgaccaag 3720

ggtgacgctc cagttgaaaa cggtccagtt ggtgctgttg ttcaagctag agctttgaga 3780

ttgtctgact ctgttcacaa cgttatcgaa caagttcacg gtgacaagag atcttctatc 3840

accgttgaat ctgacatgca cgacccatct ttgttggcta tcgctcaaaa ccacagagtt 3900

aacggtttga ccatggctcc atctaccttg ttcgctgaca tcgctttcac cttggctaag 3960

cacttgatcc aaaaccacgg tttggacacc cacaccaact tgccatctat caacaacatg 4020

gctgttgaaa aggctttgat cgttggtgaa accggtccac aattgttcag agcttctttg 4080

gacatggact ggaccaccat gagaggttct gttagaatct tctctgttgg tgctaacggt 4140

aagcaaacca ccttgcacgc tgtttgtgac gttgctgttg aaaacccatc ttctcacaga 4200

gaatcttggc aatctaacgc ttacttgatc caaagaggta tcaagcaatt ggttcaaggt 4260

gcttctgacg gttctgctca catgatgaga agaggtttgt tgtacaagat cttctctaac 4320

tctgttcaat acggttctgc tttccaaggt atcgaacaag tttggttcga ctctgaaggt 4380

ttggaaggta ccggtaaggt tttcatgcca tctggtaagg acaccttcgc tttgaaccca 4440

tactgttgtg actctttggg tcacatcacc ggtttcatca tgaactgttc tgactctttg 4500

gacttggacg accacgttta catcaaccac ggttggagaa ccttgagatt ggttgaacca 4560

taccaatgtg acgttcaata ccaaacctac gttaagatgc aagctgttgg ttctgacgac 4620

tctacctact ctggtgacgt tcacgttttg cgcgacggta agatcatcgg tatctgtggt 4680

ggtgttacct tcaagaaggt tgctagaaag gttttggaaa tgttgttgcc aaagccatct 4740

ggtgctaagg ctaagcacgg tgttgttaag cacgttgctc cagaaccagt taagcacgtt 4800

gttttgaccc caccatctac cacctctcac tctgttggta ccacctctcc accagaacca 4860

accgaatctc cagttggttc tgcttctggt ttgatccaaa aggctttgga aatcatcgct 4920

gacgaaatcg gtgttgacat ctctcaattg accgacacca ccttgttggc tgacttgggt 4980

gttgactctt tgatgtcttt gaccatcttg ggtaacttca gagaagaatt ggacttggac 5040

atcccagctg ctcaattcta cgaattctct accgttcaag acttgaagtc tttcttgggt 5100

gctaacgacc aagacttctc ttcttctaac tctgaagctg aatcttctgc ttcttctgct 5160

gcttctacct ctccatctga ccacggtgac gacgttgttg aagaagttaa gccagttgtt 5220

gctgaaatcc caagatctac ctctaccatc ttgcaaggta ccaagcactg ttctcaaacc 5280

ttgttcttgt tcccagacgg tgctggttct gctacctctt acgttacctt gccatctatc 5340

tcttctgaca tgagagttat cggtttgaac tctccatact tgaccaagcc acacgaattc 5400

aactgtgctt tgcaagacat caccggttct tacttgaacg aagttagaag aagacaacca 5460

caaggtccat accacttggc tggttggtct gctggtggtg tttctgcttt cgacgctgct 5520

agacaattgg tttctgaagg tgaagttgtt gaatctttga tcttgatcga ctctccaaac 5580

ccagttggtt tgggtaagtt gccaaagaga atgtacgact tcttggaaaa gtctggtatc 5640

ttcggtgctt tcgaaatggg tgaagaagct caagctccac cagactggtt gttccaacac 5700

ttctgtgttt tcatcgaagc tttggacaga tacgttccag aaccattcga acacggtatg 5760

gctccaaaga ccaccatcat ctgggctgct gacggtgttt gtaagaaccc agacgaccca 5820

agaccagaag ctcaaccaga cgacccaaga ggtatgaact ggttgttgaa caacagagaa 5880

gacttcggtc caaacggttg ggacgaattc atcggtgctg gtaacatctc taccatggct 5940

atcgaaaacg ctaaccactt caccatgatg agagaaccaa tcgcttctgc tttgtgtgct 6000

aagatcagag aaaccatggg tgttaactga g 6031

<210> 2

<211> 6112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcttctt ctgctgacgt ttacgttttc ggtgaccaat ctaccccagt tttggacaag 60

ttgcaagctt tggttagagt taaggacaac gctttgttga cctctttctt gggtgaagct 120

ttcttggctg ttagaagaga aatcgtttct ttgtcttctt tggaaagaaa gtctatccca 180

gaagctgaat ctttgtcttt gttgttggaa ggtgttagaa gatctgaacc tcacgctgct 240

ttagactctg ctttcgtttg tatctacgaa atcggttact acatcgacta cttggctaga 300

tctgacaagc aacaccctcc agctgctcca tctttgttgt tgggtatctg taccggttct 360

atcgctgctg ctgctgtttc ttgtgctaag gacgttttcg aaatctctag attgggtgtt 420

gaagctgcta ccgttgcttt cagattgggt atgcacgtta gaagaagagc tgaaaacttg 480

ggttactcta ccccatcttc ttggtctatg atcttgtctt ctaaccaaga agaattggtt 540

tctgaagctt tgaaggaatt ctctaaggaa aagaacttga cctactcttc tagaccatac 600

atctctgcta ccggtccagg tttcaccacc atctctggtc caccatctat cttggaatct 660

gttaagtctt gtgacacctt ctctggtaag agattgtacc cagctccaat ctacggtcca 720

taccacaact cttcttctta ctctgaatct tctttggaac acggtttggc ttctatcttg 780

gaagacgttg gtttcttgga aaacgaaatg ttgatcccaa tcatctcttg tgcttctggt 840

tctagattgg accaattgtc tttcggtaac ttgttgaaga acgttttgtc ttctgctttg 900

tctcaacaaa tcagaatgga cttggttacc gacgctttgg ttgaaaccgt ttctggtacc 960

gaagctacct tgatcccagt taacgctcaa accaccgttt gttctttggc tgactggttg 1020

gctaagagag gtgctaccac cagaatcggt ccaaccttgg aatctttgac caaggacaga 1080

gctgaaccaa acttggctcc aggtgacgaa aacaagatcg ctatcatcgg tttctctggt 1140

agattcccag aagctgacaa cttggacgaa ttctgggact tgttgatcag aggtttggac 1200

gttcacaagc cagttccaga agaaagattc gctcgcgacc actacgaccc aaccggtcaa 1260

agaaagaaca cctctcaagt tcaatacggt tgttggttga agtctgctgg ttacttcgac 1320

acccaattct tccacatgtc tccaaaggaa gctatgcaaa ccgacccagc tcaaagattg 1380

gctttgttga ccgcttacga agctttggaa atggctggtg ttgttccaga cagaacccca 1440

tctacccaaa gaaacagagt tggtgtttac tacggtacca cctctaacga ctggggtgaa 1500

gttaactctt ctcaagacgt tgacacctac tacatcccag gtgctaacag agctttcatc 1560

ccaggtagag ttaactactt cttcaagttc accggtccat ctatcgctgt tgacaccgct 1620

tgttcttctt ctttggctgc tatcaacttg gctatcacct ctttgaagaa cagagactgt 1680

gacaccgcta tcgctggtgg taccaacgtt atgaccaacc cagacaactt cgctggtttg 1740

gacagaggtc acttcttgtc tagaaccggt aactgtaagg ctttcgacga cggtgctgat 1800

ggttactgta gagctgacgg tatcggtacc ttgatcttga agagattgcc agacgctatc 1860

gctgactctg acccaatctt cggtgttatc ttgggtgctc acaccaacca ctctgctgaa 1920

tctgtttcta tcaccagacc attggctgac gctcaagaat acttgttcaa gaagttgttg 1980

aacgaaaccg gtatccaccc acacgacgtt tcttacgttg aaatgcacgg taccggtacc 2040

caagctggtg acgctgttga aatgagatct gttttgaact ctttcgcttt cgaccactct 2100

agaccaagag acaagtcttt gtacttgggt tctgttaagg ctaacgttgg tcacgctgaa 2160

tctgcttctg gtgttttggc tatcatcaag gttttgttga tgatgcaaaa gaacaccatc 2220

ccaccacact gtggtatcaa gaccaagatc aaccaaggtt tcccaaagga cttggaccac 2280

agaggtgtta gaatcgcttt gaaggactct gttgactggt ctagaccaga aggtggtaag 2340

agaagagttt tggttaacaa cttctctgct gctggtggta acacctcttt gttgttggaa 2400

gacggtccag ctgttcaccc agctagacaa caccaagacg gtgacgctag aaccgaacac 2460

gttgttgctg tttctgctag atctaccaag gctttggaag aaaacttgaa ggctttggaa 2520

gcttacatcg ctaactcttg ggctccagaa ggtgaattgt tgtctcaatt gtcttacacc 2580

accaccgcta gaagagttca ccactctaga agagttgctt tcgttaccaa cggtttggac 2640

gacttgagaa agtctttgtt gaaggctgct accgacgctg gtcaagttaa gggtatccca 2700

gctgtttctc caaaggttgg tttcttgttc accggtcaag gtgctcaaga aaccgctatg 2760

gctatcggtt actacaagtc tttctcttct ttcagatctg acatccacca attggactct 2820

atcgctacct tgcaaggttt gccatctgtt ttgccattga tccacggtac caccccagtt 2880

gaagacttgt ctgctgttgt tgttcaattg ggtacctgta tcatccaaat ctctttggct 2940

agattctgga tctctttggg tatcacccca caatacgtta tcggtcactc tttgggtgaa 3000

tacgctgctt tgcaaatcgc tggtgttttg tctgttaacg acgctatctt cttgtgtggt 3060

cacagagctg ctttgttgga caagaagtgt accgcttaca cccacggtat ggttgctgtt 3120

aaggctgctg ctgacgactt gagacaacac atctcttctg acttgaaggt tgaaatcgct 3180

tgtgttaacg gtgctgaaga caccgttttg tctggtccaa acgctgacat cgaatctttg 3240

tgtggtaagt tgacccaagc tggttacaag ttgcacaagt tggaaatccc attcgctttc 3300

cactcttctc aagttgaccc aatcttggac gacttggaag aattggcttc tcaagttggt 3360

ttccacgaac caaagttgcc aatcgtttct ccattgttga gaaccttgtt gaccggtgac 3420

accttgggtc cacaatacat cagaagacac tgtagagaaa ccgttgactt cttgggtgct 3480

atcaagatgg ctgaatctca aggtatcatg gacagatctg gtatgtgtat cgaaatcggt 3540

gctcacccaa tcttgaccag aatggttaag tctatcatcg gtcaagactt cagatgtttg 3600

gcttctttga gaagaaagga agaccacttc aagaccttgg ctgactcttt gtgtgctttg 3660

cacttggctg gtttctctgt taactgggac gaataccaca gagacttcgc ttcttctaga 3720

aacgttttgc aattgccaaa gtactcttgg caattggcta actactggat gcaatacaag 3780

tactcttggt gtttgaccaa gggtgacgct ccagttgaaa acggtccagt tggtgctgtt 3840

gttcaagcta gagctttgag attgtctgac tctgttcaca acgttatcga acaagttcac 3900

ggtgacaaga gatcttctat caccgttgaa tctgacatgc acgacccatc tttgttggct 3960

atcgctcaaa accacagagt taacggtttg accatggctc catctacctt gttcgctgac 4020

atcgctttca ccttggctaa gcacttgatc caaaaccacg gtttggacac ccacaccaac 4080

ttgccatcta tcaacaacat ggctgttgaa aaggctttga tcgttggtga aaccggtcca 4140

caattgttca gagcttcttt ggacatggac tggaccacca tgagaggttc tgttagaatc 4200

ttctctgttg gtgctaacgg taagcaaacc accttgcacg ctgtttgtga cgttgctgtt 4260

gaaaacccat cttctcacag agaatcttgg caatctaacg cttacttgat ccaaagaggt 4320

atcaagcaat tggttcaagg tgcttctgac ggttctgctc acatgatgag aagaggtttg 4380

ttgtacaaga tcttctctaa ctctgttcaa tacggttctg ctttccaagg tatcgaacaa 4440

gtttggttcg actctgaagg tttggaaggt accggtaagg ttttcatgcc atctggtaag 4500

gacaccttcg ctttgaaccc atactgttgt gactctttgg gtcacatcac cggtttcatc 4560

atgaactgtt ctgactcttt ggacttggac gaccacgttt acatcaacca cggttggaga 4620

accttgagat tggttgaacc ataccaatgt gacgttcaat accaaaccta cgttaagatg 4680

caagctgttg gttctgacga ctctacctac tctggtgacg ttcacgtttt gcgcgacggt 4740

aagatcatcg gtatctgtgg tggtgttacc ttcaagaagg ttgctagaaa ggttttggaa 4800

atgttgttgc caaagccatc tggtgctaag gctaagcacg gtgttgttaa gcacgttgct 4860

ccagaaccag ttaagcacgt tgttttgacc ccaccatcta ccacctctca ctctgttggt 4920

accacctctc caccagaacc aaccgaatct ccagttggtt ctgcttctgg tttgatccaa 4980

aaggctttgg aaatcatcgc tgacgaaatc ggtgttgaca tctctcaatt gaccgacacc 5040

accttgttgg ctgacttggg tgttgactct ttgatgtctt tgaccatctt gggtaacttc 5100

agagaagaat tggacttgga catcccagct gctcaattct acgaattctc taccgttcaa 5160

gacttgaagt ctttcttggg tgctaacgac caagacttct cttcttctaa ctctgaagct 5220

gaatcttctg cttcttctgc tgcttctacc tctccatctg accacggtga cgacgttgtt 5280

gaagaagtta agccagttgt tgctgaaatc ccaagatcta cctctaccat cttgcaaggt 5340

accaagcact gttctcaaac cttgttcttg ttcccagacg gtgctggttc tgctacctct 5400

tacgttacct tgccatctat ctcttctgac atgagagtta tcggtttgaa ctctccatac 5460

ttgaccaagc cacacgaatt caactgtgct ttgcaagaca tcaccggttc ttacttgaac 5520

gaagttagaa gaagacaacc acaaggtcca taccacttgg ctggttggtc tgctggtggt 5580

gtttctgctt tcgacgctgc tagacaattg gtttctgaag gtgaagttgt tgaatctttg 5640

atcttgatcg actctccaaa cccagttggt ttgggtaagt tgccaaagag aatgtacgac 5700

ttcttggaaa agtctggtat cttcggtgct ttcgaaatgg gtgaagaagc tcaagctcca 5760

ccagactggt tgttccaaca cttctgtgtt ttcatcgaag ctttggacag atacgttcca 5820

gaaccattcg aacacggtat ggctccaaag accaccatca tctgggctgc tgacggtgtt 5880

tgtaagaacc cagacgaccc aagaccagaa gctcaaccag acgacccaag aggtatgaac 5940

tggttgttga acaacagaga agacttcggt ccaaacggtt gggacgaatt catcggtgct 6000

ggtaacatct ctaccatggc tatcgaaaac gctaaccact tcaccatgat gagagaacca 6060

atcgcttctg ctttgtgtgc taagatcaga gaaaccatgg gtgttaactg ag 6112

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgaac caaaccaaca ctacgaagtt atcatcgctg gtggtggtat cgctggtgtt 60

accttggctt tgatgttcga aaagttggac atctcttact tcttgttgga aggtagagac 120

accttggaat ctgacagagg tgctggtatc ggtttgcaac caaacggttt gagaatcttg 180

gaccaattgg gtttggttga agacatcgaa gaagctacca tcccattgga aaagtggttc 240

tcttacgact ctgaaggtaa cttgatgaac gactctgacg ctatgggtca atacagagac 300

aagatcggtt acccagttgc tttcatcgaa agaagaaagt tgttgccaat catggttaga 360

cacatccaaa gaaccgaatg tgttaagacc tctgctagag ttgcttctat cgaagaatct 420

gaagaccacg ttaccgttac caccaccgac ggtttgtctt tgaccgctga catcgttgtt 480

ggtgctgacg gtgttagaac cttggttaga acccacatcg actctaagtt gccagaacca 540

ttgaccgctg acgacttgca ccaaagatgt ttgttgcact ctttgagaca cgtttctacc 600

cacagatcta tcgctccagg tgaaagattc gctgtttaca gagaaaacca aaccgttatc 660

ggtttcaccg gtaaggacgg tatcgttttc tggttcgttt tcgaaaactt gaacagaaac 720

gttccattgt ctcaagctcc aagatacacc gaagctgaag ctgaagcttt gtgtttgtct 780

gttgctcaca cccaagttac cccaaagttg aagttcggtg aaatctacaa gaactctgtt 840

gttgctgtta agatcggtgt tgaagaaggt gttgctaagg gttggcacac cgacagagct 900

gttatcgttg gtgacgctgc ttgtaagacc accccagctg gtggtcaagg tgctaaccaa 960

gctatcgaat cttgtgctgt tttcgttaac aagttgatgg ctgctagaaa ggcttctcaa 1020

tctggtgaca agttgtcttc tgacgttgtt aagtctgttt tggcttctta cgctcaagaa 1080

agagctcaac cagctaccac cgctttggaa agatctcaaa tggttggtaa ggctttgttg 1140

tgtaccccag gtccagctac caccttggtt aaggacatgt tgaagttgtc taacgaagac 1200

tggttgttga gagctttcat ggctttgtct gctgctccat acttggaaga cgttgaattg 1260

accgctagag gtcacttgta caacaaggct gttgaagaag ctagagctga aatggctaga 1320

agacaaagag ttgctaagga agttaaggaa gctgaagaaa aggaatctaa gcaagctgct 1380

tctatcaagg aatctgaaca aagaaacgaa ttcgttggtt tgagaaaccc agttcaagct 1440

gctaccggtg ttgttgaagt tggttcttga 1470

<210> 4

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctgaac caaaccaaca ctacgaagtt atcatcgctg gtggtggtat cgctggtgtt 60

accttggctt tgatgttcga aaagttggac atctcttact tcttgttgga aggtagagac 120

accttggaat ctgacagagg tgctggtatc ggtttgcaac caaacggttt gagaatcttg 180

gaccaattgg gtttggttga agacatcgaa gaagctacca tcccattgga aaagtggttc 240

tcttacgact ctgaaggtaa cttgatgaac gactctgacg ctatgggtca atacagagac 300

aagatcggtt acccagttgc tttcatcgaa agaagaaagt tgttgccaat catggttaga 360

cacatccaaa gaaccgaatg tgttaagacc tctgctagag ttgcttctat cgaagaatct 420

gaagaccacg ttaccgttac caccaccgac ggtttgtctt tgaccgctga catcgttgtt 480

ggtgctgacg gtgttagatc tgctgttaga acccacatcg actctaagtt gccagaacca 540

ttgaccgctg acgactacat ctctgttgct tgttctaccg tttacggtat gtctgctcca 600

accgaaggta tcgctccagg tgaaagattc gctgtttaca gagaaaacca aactgttatc 660

ggtttcaccg gtaaggacgg tatcgttttc tggttcgttt tcgaaaactt gaacagaaac 720

gttccattgt ctcaagctcc aagatacacc gaagctgaag ctgaagcttt gtgtttgtct 780

gttgctcaca cccaagttac cccaaagttg aagttcggtg aaatctacaa gaactctgtt 840

gttgctgtta agatcggtgt tgaagaaggt gttgctaagg gttggcacac cgacagagct 900

gttatcgttg gtgacgctgc ttgtaagacc accccagctg gtggtcaagg tgctaaccaa 960

gctatcgaat cttgtgctgt tttcgttaac aagttgatgg ctgctagaaa ggcttctcaa 1020

tctggtgaca agttgtcttc tgacgttgtt aagtctgttt tggcttctta cgctcaagaa 1080

agagctcaac cagctaccac cgctttggaa agatctcaaa tggttggtaa ggctttgttg 1140

tgtaccccag gtccagctac caccttggtt aaggacatgt tgaagttgtc taacgaagac 1200

tggttgttga gagctttcat ggctttgtct gctgctccat acttggaaga cgttgaattg 1260

accgctagag gtcacttgta caacaaggct gttgaagaag ctagagctga aatggctaga 1320

agacaaagag ttgctaagga agttaaggaa gctgaagaaa aggaatctaa gcaagctgct 1380

tctatcaagg aatctgaaca aagaaacgaa ttcgttggtt tgagaaaccc agttcaagct 1440

gctaccggtg ttgttgaagt tggttcttga 1470

<210> 5

<211> 1363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtttcta acggtatctc taacggtacc aacggtacca acggtaccac caccaacggt 60

accaacggtg ttaacggtca cgctgctttg tctccattgg aagttttggt tcaagacttg 120

aacaagaaca ccaccacctt gaacggttac ttgagagcta acaagttgcc agaaccatct 180

ttcgaacgcg acgctccaat catcaacttg tctccagacg ctccagaaga agctcaagtt 240

gctaaggaaa aggttttgga ctctgctttg caaatcttcc aattggtttc tggtccaggt 300

gaatacttgc aaaacgttat caccggttac cactacatgg aaatcttgag atggatgtct 360

cacttcaaga tcttcgaatt ggttccattg gaaggtaaga tctcttacac cgaattggct 420

tctaaggctg gtgttttgaa gttgagattg aagaccttgg ctagaatggg tatgaccaac 480

cacttgttcg ctgaaccaga accaggtttc atcgctcact ctgctacctc tgctgctttg 540

gttaccaaca acagattctc tgaccaaaga gtttggatga cctctatcat cgctccagtt 600

atcgcttcta tggttaccgc tcacgaaaga tggccagact ctaccgctcc aaacaaggct 660

gctttcaacg ctgctttcaa caccgacttg agaatgtacg aatacatctc taagcaacca 720

gacgtttaca agttgttcgg tagagttatg gacgctatcg ctacctctcc aaagtctgac 780

ttgaagcact tggtttctgg tttcgactgg gctggtttgg gtaaggctaa cgttgttgac 840

atcggtggta acatcggtca ctcttgtgtt aagttggctg aagctttccc agacttgaac 900

ttcatcatcc aagacatccc acacgttgtt gaagaaggtg ctaaggttat caaggaaaac 960

aacgaagctt ctatcgctaa cagaatccaa ttccaagaat acgacttctt ccaaaagcaa 1020

ccagttgttg gtgctgacat ctacttgttg agacaaatct tccacaactg ggacttcgaa 1080

aactctgtta agatcttgaa gaacaccgtt gaatctatgg gtcaaaactc tcacgttttg 1140

atcatggact tcgttgttcc agaaccaggt accgtttctt ctgttaacga aagagttttg 1200

agatctcgcg acgttggtat gatgcaattg ttcaactctt tggaaagaga cttggaaggt 1260

tggaaggcta tcttggaagc tgttgactct agattgaaga tcaacgctgt taacacccca 1320

tacggttctt tcatgtctgt tatcgacgtt gttttgggtt gag 1363

<210> 6

<211> 1363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggtttcta acggtatctc taacggtacc aacggtacca acggtaccac caccaacggt 60

accaacggtg ttaacggtca cgctgctttg tctccattgg aagttttggt tcaagacttg 120

aacaagaaca ccaccacctt gaacggttac ttgagagcta acaagttgcc agaaccatct 180

ttcgaacgcg acgctccaat catcaacttg tctccagacg ctccagaaga agctcaagtt 240

gctaaggaaa aggttttgga ctctgctttg caaatcttcc aattggtttc tggtccaggt 300

gaatacttgc aaaacgttat caccggttac cactacatgg aaatcttgag atggatgtct 360

cacttcaaga tcttcgaatt ggttccattg gaaggtaaga tctcttacac cgaattggct 420

tctaaggctg gtgttgctga attgagattg aagaccttgg ctagaatggg tatgaccaac 480

cacttgttcg ctgaaccaga accaggtttc atcgctcact ctgctacctc tgctgctttg 540

gttaccaaca acagattctc tgaccaaaga gtttggatga cctctatcat cgctccagtt 600

atcgcttcta tggttaccgc tcacgaaaga tggccagact ctaccgctcc aaacaaggct 660

gctttcaacg ctgctttcaa caccgacttg agaatgtacg aatacatctc taagcaacca 720

gacgtttaca agttgttcgg tagagttatg gacgctatcg ctacctctcc aaagtctgac 780

ttgaagcact tggtttctgg tttcgactgg gctggtttgg gtaaggctaa cgttgttgac 840

atcggtggta acatcggtca ctcttgtgtt aagttggctg aagctttccc agacttgaac 900

ttcatcatcc aagacatccc acacgttgtt gaagaaggtg ctaaggttat caaggaaaac 960

aacgaagctt ctatcgctaa cagaatccaa ttccaagaat acgacttctt ccaaaagcaa 1020

ccagttgttg gtgctgacat ctacttgttg agacaaatct tccacaactg ggacttcgaa 1080

aactctgtta agatcttgaa gaacaccgtt gaatctatgg gtcaaaactc tcacgttttg 1140

atcatggact tcgttgttcc agaaccaggt accgtttctt ctgttaacga aagagttttg 1200

agatctcgcg acgttggtat gatgcaattg ttcaactctt tggaaagaga cttggaaggt 1260

tggaaggcta tcttggaagc tgttgactct agattgaaga tcaacgctgt taacacccca 1320

tacggttctt tcatgtctgt tatcgacgtt gttttgggtt gag 1363

<210> 7

<211> 1456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaacgaag aatctaacat gggtggtgtt ttcaaggaag aagaagctca atctggtgac 60

gttgttgact tcgaaggtga ctctgacacc cacaacccac aaaactggcc aatgggtaag 120

aaggtttaca ccaccgcttt gtgggctttg accacctgtt ggaccacctt cgcttctgct 180

atctactctg ctggtaccgc tgaaatctct gaagaattcc acgtttctta cgaagttgct 240

aacgctggta cctctttgtt gatcttcggt ttcgctttgg gtccaatgtt gtgggctcca 300

ttgtgtgaag tttacggtag aaagtggcca gctttggctc catacttcat ctctgctgct 360

ttctctttcg gtaccgctac cgctaaggac atccaaacca tcttgatcac cagattcttc 420

gctggtgttt tcggttcttc tccaatctct atcaccggtg gttctatcgt tgacatctgg 480

accccaagac aaagaggtac cccaatggtt tgttacggta tcaccatcgc tgctgctcca 540

accttgggtc caatcatcgg tggtgctttc atcgcttctg gttgtggttg gagatggacc 600

gaatacttga ccggtatcgt tatgatggtt caattcgttt tggacgcttt gtggttggac 660

gaatctcacg ctgacgtttt gttgaccaga aaggctggta gattgagaag atctaccggt 720

aacttctctt tgcacgctaa gtgggaagaa acctctccaa ccttcaagtc tttgttgtct 780

acctacttgg ttagaccatt ccaaatgttg ttggacccaa tctgtttgtt gttgaccatc 840

tacacctctt tcgtttacgc tatcttgtac gcttctttgg aatctttcgc tttggaatac 900

ggtagattca gaagatgggg tccagttgtt tctcaattgc cattcttgtc tttgttcatc 960

ggttgtttgt tcgctgctgc tgctaacatc ttcaacaaca tctactacgg taagaagttg 1020

gttgctaaca acttcccagt tccagaagct agattgccac caatgatggt tggtggtttc 1080

gctttctctg ctggtttgtt cttgttcggt tggacctctg ttgaacacgt ttcttctcca 1140

tggccatcta tcatcggtgt tttcttgacc ggtgttggtt tcaccaccat cttccaatct 1200

tctttgcaat acttggttga caccttcacc agatactctg cttctgctat cgctgctaac 1260

accttcgtta gatctatggc tgctggtgct ttcccattgt tcgtttggcc aatgtacgaa 1320

aagatcggta tcgactgggg ttctaccatc ttcgcttgta tctctgtttt gttgttgcca 1380

gctccattct tgttcttcaa gtggggttac agaatcagag ctagaggtga attctctaag 1440

ttgtctacct actgag 1456

<210> 8

<211> 1459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaacgaag aatctaacat gggtggtgtt ttcaaggaag aagaagctca atctggtgac 60

gttgttgact tcgaaggtga ctctgacacc cacaacccac aaaactggcc aatgggtaag 120

aaggtttaca ccaccgcttt gtgggctttg accacctgtt ggatcacctt cgcttctgct 180

atctactctg ctggtaccgc tgaaatctct gaagaattcc acgtttctta cgaagttgct 240

aacgctggta cctctttgtt gatcttcggt ttcgctttgg gtccaatgtt gtgggctcca 300

ttgtgtgaag tttacggtag aaagtggcca gctttggctc catacttcat ctctgctgct 360

ttcgctttcg gtaccgctac cgctaaggac atccaaacca tcttgatcac cagattcttc 420

gctggtgttt tcggttcttc tccaatctct atcaccggtg gttctatcgt tgacatctgg 480

accccaagac aaagaggtac cccaatggtt tgttacggta tcaccatcgc tgctgctcca 540

accttgggtc caatcatcgg tggtgctttc atcgcttctg gttgtggttg gagatggacc 600

gaatacttga ccggtatcgt tatgatggtt caattcgttt tggacgcttt gtggttggac 660

gaatctcacg ctgacgtttt gttgaccaga aaggcttcta gattgagaag atctaccggt 720

aacttctctt tgcacgctaa gtgggaagaa acctctccaa ccttcaagtc tttgttgtct 780

acctacttgg ttagaccatt ccaaatgttg ttggacccaa tctgtttgtt gttgaccatc 840

tacacctctt tcgtttacgc tatcttgtac gcttctttgg aatctttcgc tttggaatac 900

ggtagattca gaagatgggg tccagttgtt tctcaattgc cattcttgtc tttgttgatc 960

ggttgtttgt tcgctgctgc tgctaacatc ttcaacaaca tctactacgg taagaagttg 1020

gttgctaaca acttcaagcc agttccagaa gctagattgc caccaatgat ggttggtggt 1080

ttcgctttct ctgctggttt gttcttgttc ggttggacct ctgttgaaca cgtttcttct 1140

ccatggccat ctatcatcgg tgttttcttg accggtgttg gtttcaccac catcttccaa 1200

tcttctttgc aatacttggt tgacaccttc accagatact ctgcttctgc tatcgctgct 1260

aacaccttcg ttagatctat ggctgctggt gctttcccat tgttcgtttg gccaatgtac 1320

gaaaagatcg gtatcgactg gggttctacc atcttcgctt gtatctctgt tttgttgttg 1380

ccagctccat tcttgttctt caagtggggt tacagaatca gagctagagg tgaattctct 1440

aagttgtcta cctactgag 1459

<210> 9

<211> 880

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtctagag ctcaatcttc tccaaccgtt atccaatggg ttatcgacac cagaccattg 60

tggccatctg ctttgaagac caaggacttg acctctgctg cttctagagc tttgtctttg 120

ttgaccgaag aagaacaatc ttctgttttg agatactacc acgttcgcga cgctaagttg 180

gctttggctt ctgctttgtt gaagagatac gctatctcta gattctgtca cgttccatgg 240

ttcttggcta agaccacccg cgacgctaga accaagccag ttttcgtttt gccatctggt 300

gacgaaccat tgatcttcaa cgtttctcac caagctggtt tggctgtttt gttggctgtt 360

cacgacccac caaagggttt ggctgttggt gttgacgttg tttgtccatc tgaaagaaga 420

gacagagact tgtcttcttt ggaagaagac ggttgggctt ctttcgttga catccacgct 480

gacgttttcg gtgctggtga agtttctgct ttgaagtcta tgaacccagt tccaaccgtt 540

caagaaagag acagagcttt gagatacttc tacgctttgt ggtgtttgag agaagcttac 600

gttaagatga ccggtgacgc tttgttggct tcttggttga aggacttgga aatgcacaac 660

ttcgctccac cagaagacat gaaggaagct caagaagtta gattgagagg taagaaggtt 720

gaaggtgttg acatgagatt gatgccattg ttggaagaat acatggtttc taccgctgtt 780

agaaacggtg acaacggtga atctgttgaa ttgggtgaat tccaatcttt ggacttggaa 840

gaaatcttgg ctttcggtga acaagcttct aagccatgag 880

<210> 10

<211> 1036

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggttcaag acacctcttc tgcttctacc tctccaatct tgaccagatg gtacatcgac 60

accagaccat tgaccgcttc taccgctgct ttgccattgt tggaaacctt gcaaccagct 120

gaccaaatct ctgttcaaaa gtactaccac ttgaaggaca agcacatgtc tttggcttct 180

aacttgttga agtacttgtt cgttcacaga aactgtagaa tcccatggtc ttctatcgtt 240

atctctagaa ccccagaccc acacagaaga ccatgttaca tcccaccatc tggttctcaa 300

gaagactctt tcaaggacgg ttacaccggt atcaacgttg aattcaacgt ttctcaccaa 360

gcttctatgg ttgctatcgc tggtaccgct ttcaccccaa actctggtgg tgactctaag 420

ttgaagccag aagttggtat cgacatcacc tgtgttaacg aaagacaagg tagaaacggt 480

gaagaaagat ctttggaatc tttgagacaa tacatcgaca tcttctctga agttttctct 540

accgctgaaa tggctaacat cagaagattg gacggtgttt cttcttcttc tttgtctgct 600

gacagattgg ttgactacgg ttacagattg ttctacacct actgggcttt gaaggaagct 660

tacatcaaga tgaccggtga agctttgttg gctccatggt tgagagaatt ggaattctct 720

aacgttgttg ctccagctgc tgttgctgaa tctggtgact ctgctggtga cttcggtgaa 780

ccatacaccg gtgttagaac caccttgtac aagaacttgg ttgaagacgt tagaatcgaa 840

gttgctgctt tgggtggtga ctacttgttc gctaccgctg ctagaggtgg tggtatcggt 900

gcttcttcta gaccaggtgg tggtccagac ggttctggta tcagatctca agacccatgg 960

cgaccattca agaagttgga catcgaaaga gacatccaac catgtgctac cggtgtttgt 1020

aactgtttgt cttgag 1036

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccccttaggt tgcaaatgct ccgtcgacgg gatctgtcct tctctgccgg cgatcgt 57

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaggtactg gcctagcgtc gtggcccggg agagacagtt tagtagtgac tcgcgg 56

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gactaagact ctggtcacgg ttcagaagtg gacgatgcat gtcgtcgggc tgataga 57

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgcacggcgc taggtgtgat atcgtacact tgggagaagt cagatacgat tgcggct 57

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tagcggcgcc gggaaatcca gcatattctc gcggccctga gcagtaggtg tctcggg 57

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgacgcttgg atgcgtgacc ccgtacgtca tgacccgtca tgggtatgta agcgaag 57

Claims (19)

1.Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种在构建产比卡菌素的酵母菌株中的应用。

2.基因表达模块，其包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种。

3.根据权利要求2所述的基因表达模块，其特征在于，包含如下I)～II)中至少一种：

I)、Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少一种，每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子；

II)、Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少两种的融合片段，每个融合片段的5’端连接启动子，3’端连接终止子。

4.根据权利要求3所述的表达模块，其特征在于，包含Bikl，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中至少5种。

5.根据权利要求3所述的表达模块，其特征在于，包含Bik1，Bik2，Bik3、Bik6、PPTase、NpgA基因中任意2个组成的融合片段，以及其余4个基因中至少一种。

6.根据权利要求2～5任一项所述的表达模块，其特征在于，所述启动子、终止子来自酿酒酵母。

7.根据权利要求6所述的表达模块，其特征在于，

包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_P6K1-Bik6、P_ENO2-PPTase；

或包括P_GAL1-Bik2、P_TPI1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_TEF1-Bik2、P_GAL1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_GAL1-Bik2、P_GAL1-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA；

或包括P_GAL1-Bik2-Bik3、P_GAL1-Bik1、P_PGK1-Bik6、P_ENO2-PPTase、P_TEF2-NpgA。

8.根据权利要求7所述的表达模块，其特征在于，

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_RPS2-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_RPS2-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-NPGA-T_ADH2；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-BIK3-T_CYC1、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-T_CYC1、P_TPI1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_TEF1-BIK2-T_CYC1、P_GAL1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7；

包括顺序连接的：P_GAL1-BIK2-T_CYC1、P_GAL1-BIK3-T_ACS2、P_GAL1-BIK1-T_ACS1、P_PGK1-BIK6-T_ZEO1、P_ENO2-PPT-T_ADH2、P_TEF2-NPGA-T_HXT7。

9.根据权利要求2～7任一项所述的表达模块，其特征在于，

Bik1的序列如SEQ ID NO：1或2所示；

Bik2的序列如SEQ ID NO：3或4所示；

Bik3的序列如SEQ ID NO：5或6所示；

Bik6的序列如SEQ ID NO：7或8所示；

PPTase的序列如SEQ ID NO：9所示；

NpgA的序列如SEQ ID NO：10所示。

10.重组载体，其包括权利要求2～9任一项所述的表达模块。

11.根据权利要求10所述的重组载体，其特征在于，骨架载体为pSR416。

12.重组酵母菌，其由酵母菌转化权利要求10所述的重组载体制得。

13.根据权利要求12所述的重组酵母菌，其特征在于，其底盘菌为酿酒酵母或奇异酵母。

14.根据权利要求13所述的重组酵母菌，其特征在于，所述酿酒酵母选自BY4742、S288c、L-1528、UWOPS872421、YJM978、DBVPG6044、378604X、YJM981、273614N、UWOPS03-461.4、YIIc17-E5、DBVPG 1373、Y55、DBVPG1106、UWOPS05-227.2、UWOPS83-787.3、DBVPG6765、Y12、SK1、L-1374、YPS606、W303、322134S；

所述奇异酵母选自：CBS432、Y8.5、T21.4、Q62.5、Z1、Y7、Q89.9、Y8.1、Q32.3、Y9.6、N-17、Q59.1、Q74.4、CBS5829、Q95.3、Q69.8、S36.7、W7、YPS138、Z1.1、Q31.4、IFO 1804、A12、IV-44。

15.权利要求11所述的重组酵母菌在制备比卡菌素中的应用。

16.一种制备比卡菌素的方法，其包括发酵权利要求10所述的重组酵母菌。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基中：

氮源包括无机氮源和酵母基础氮源；

所述无机氮源选自硫酸铵；

所述酵母基础氮源包括肌醇、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、硫酸铜、磷酸二氢钾、硼酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、氯化铁、氯化钙、碘化钾、钼酸钠、生物素、叶酸、氯化钠；

对于未采用GAL1启动子的重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源；对于采用GAL1启动子的重组酵母菌株则以半乳糖为碳源；

除碳源和碳源外，发酵培养基中还包括精氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、组氨酸、亮氨酸和腺嘌呤。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为25～35℃，100～1000rpm，时间为1～10d。

19.根据权利要求16～18任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵后，还包括以乙酸乙酯从菌体中提取比卡菌素的步骤。

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