KR102652526B1 - 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용 - Google Patents

생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용 Download PDF

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Abstract

본 출원에서는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용을 공개하는 바, 유전자 코돈 최적화, 엔지니어링 박테리아 구성, 엔지니어링 박테리아 배양, 기질 전환 및 생성물 제조가 포함되며; 엔지니어링 박테리아를 사용하여 발효에 의해 효소를 발현시키고 발현된 효소가 기질을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시키는 바, 기질은 타우로우루소데옥시콜산이다. 기질 농도는 250g/L로 높을 수 있고, 반응 시간이 짧으며, 기질에 대한 전환율은 98% 이상으로 높을 수 있고, 취득한 제품 순도는 99% 이상이며; 반응계에서 NAD+는 순환 재생되어, 보호 효소 NAD+의 사용량을 크게 낮추고, 효소 촉매 반응의 원가가 낮아지며, 산업 확대에 유리하며; 히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 보호 효소 재생 효소를 연성 폴리펩티드 서열을 통하여 한데 연결시켜 융합 단백질 폴리머를 구성하여, 기질 및 보조 효소와의 결합 거리가 더욱 가깝고, 전환 반응의 진행에 더욱 유리하며, 산업화 생산에서, 발효의 회수를 줄이고, 공정을 간략화시키며, 시간 원가와 원료 원가를 절약한다.

Description

생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용
본 출원은 2018년 11월 29일 중국 특허청에 출원되어, 출원번호가 201811446689.5이고, 발명의 명칭이 “생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 이의 모든 내용은 인용을 통하여 본 발명에 포함되어 있다.
기술분야
본 출원은 생물 기술분야에 관한 것으로서, 유전 공학 수단을 사용하여 생물 효소에 대하여 조작은 진행한 후, 고효율적으로 타우로케노데옥시콜산 생물 전환을 촉매 작용하는 방법에 관한 것이고, 특히 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법의 응용에 관한 것이다.
배경기술
타우로우루소데옥시콜산은 화학명이 3α,7β-디히드록실콜란아실-N-타우린이고, 경련 해소, 경기 방지, 항염 및 담석 용해 등 작용을 가진다. 타우로우루소데옥시콜산은 주요하게 흑곰 담즙에 존재하고, 담즙 중의 대표적인 유효 성분이다. 2007년, 제품명이 “Taurolite()”인 타우로우루소데옥시콜산 캡슐이 중국에서 판매하도록 허락되었다. 이는 주요하게 콜레스테롤 결석을 용해시키는데 사용된다. 우루소데옥시콜산은 친수성의 담즙산으로서, 돌 용해율이 제한적이고, 안정송이 좋으며, 부작용이 비교적 적어, 이미 널리 임상에 적용되고 있다. 타우로우루소데옥시콜산은 우루소데옥시콜산과 타우린의 공액체이고, 우루소데옥시콜산에 비하여 친수성이 더욱 강하고, 돌 용해 속도가 더욱 빠르며, 안전성이 더욱 좋다.
최초에 타우로우루소데옥시콜산은 “인공 인출”된 흑곰 담즙으로부터 추출한 것이어서, 원천이 제한적이고 수율이 낮으며, 배치 간의 차이가 크고 동물에 대하여 인간적이지 못하다. 후에는 점차적으로 인공 합성 방법으로 대체되었다 인공 화학 합성 방법은 주요하게 세 가지 유형으로 구분되는 바, 첫째는 활성 중간체 예를 들면 혼합 산무수물, 활성 티오에스테르 등을 형성하는 것을 통하여, 다시 소듐 타우레이트와 반응을 진행하는 것이며; 둘째는 축합제 작용 하에서 아마이드를 형성하는 것이며; 셋째는 시스타민계 물질을 통하여 술푸릴화물을 형성하고 다시 산화시켜 목표 생성물을 취득하는 것이다. 이러한 방법은 선택성이 낮고, 대량의 유기 시제를 사용하며, 환경을 오염시킨다.
곰 담즙 “인공 인출” 추출과 인공 화학 합성 방법의 결함을 해결하기 위하여, 점차적으로 생물 전환의 방법을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법을 발전시켰다. 타우로케노데옥시콜산은 닭, 오리, 게사니 등 가축의 담즙에 널리 존재하며, 타우로우루소데옥시콜산과는 7자리 히드록시 상의 에피머이다. 중국 발명 특허 CN102994604A는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 두 단계 촉매 작용을 거쳐, 타우로케노데옥시콜산을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시키는 방법을 공개하였다. 이 방법에서, 기질 농도가 비교적 낮고(1g/L), 기질 전환이 완전하지 못하며, 대량의 원가가 비싼 보조 효소를 사용하여야 하고, 반응 중간체 타우린 7-케톤리토콜린산이 부산물로서 제거하기 어렵다. 중국 발명 특허 CN107287272A는 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법을 공개하였다. 이는 각각 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제가 포함된 발현 벡터 또는 양자의 공동 발현 벡터를 구성하고, 배지에 기질을 첨가하고 발효시키는 동시에 전환을 진행하여, 타우로케노데옥시콜산을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시킨다. 하지만 이러한 방법은 기질 농도가 낮고 전환율이 낮으며, 반응 중간체 타우린 7-케톤리토콜린산 함량이 높고 전환 주기가 길며, 산업화 생산을 진행하기 쉽지 않다.
기술적 과제
본 출원의 실시예는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용을 제공하여, 종래의 생물 전환 기술을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산을 제조할 때 존재하는 기질 농도가 낮고 전환율이 낮으며, 반응 중간체 타우린 7-케톤리토콜린산 함량이 높고 전환 주기가 길며, 산업화 생산을 진행하기 쉽지 않은 문제를 해결하는 것을 하나의 목적으로 한다.
기술적 해결 수단
상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 출원의 기술 방안은 하기와 같다.
제1 방면으로, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법을 제공하는 바, 유전자 코돈 최적화 단계, 엔지니어링 박테리아 구성 단계, 엔지니어링 박테리아 배양 단계, 기질 전환 및 생성물 제조 단계를 포함하며; 이 때 상기 엔지니어링 박테리아는 발효에 의해 효소를 발현하고, 발현된 효소는 기질을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시키며; 상기 기질은 타우로케노데옥시콜산이고; 상기 엔지니어링 박테리아는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아 계열에서 선택된다.
제2 방면으로, 상기 방법의 우루소데옥시콜산을 제조하는 중의 응용을 제공한다.
본 출원의 실시예에서 제공하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법의 유익한 효과는 하기와 같다.
(1) 본 출원에서 제공하는 생물 전환 방법을 사용하면, 전환시키고자 하는 기질 농도를 높을 있어, 기질 농도가 250g/L로 높을 수 있고, 반응 시간이 짧으며, 기질에 대한 전환율은 98% 이상으로 높을 수 있고, 취득한 제품 순도는 99% 이상이며;
(2) 상기 특정 발현의 대장간균을 사용하여 생물 엔지니어링 박테리아로 하면, 생물 전환 과정에서 반응 중간물 타우린 7-케톤리토콜린산이 타우로우루소데옥시콜산으로 전환되는 효율이 높고, 최종 제품에 거의 부산물이 포함되지 않으며;
(3) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 및 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 사용하여, 반응계에서 NAD+는 순환 재생되어, 보호 효소 NAD+의 사용량을 크게 낮추고, 효소 촉매 반응의 원가가 낮아지며, 산업 확대에 유리하며;
(4) 히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 보호 효소 재생 효소를 연성 폴리펩티드 서열을 통하여 한데 연결시켜 융합 단백질 폴리머를 구성하여, 기질 및 보조 효소와의 결합 거리가 더욱 가깝고, 전환 반응의 진행에 더욱 유리하며, 산업화 생산에서, 발효의 회수를 줄이고, 공정을 간략화시키며, 시간 원가와 원료 원가를 절약하며;
(5) 본 출원은 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 및 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 전세포를 사용하여 타우로우루소데옥시콜산의 전환을 진행할 수 있어, 세포 파쇄, 세포액 정화, 효소의 친화 정제 등 산업 원가가 큰 단계를 피하여, 대량의 원가를 절감하고, 또한 과정이 간단하고 제어가능하다.
본 발명의 실시예에서 제공하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 응용의 유익한 효과라면, 생물 전환으로 제조된 타우로우루소데옥시콜산 전환액 중에서, 알칼리 분해를 진행하여 우루소데옥시콜산을 제조하여, 화학법으로 우루소데옥시콜산을 제조할 때 대량의 유기 용제를 사용하는 것을 피하며; 또한 방법은 반응 시간이 짧고, 반응이 온화하고 제어가능하며, 조작이 간단하다.
도면 설명
본 출원의 실시예 중의 기술방안에 대하여 더욱 명확한 설명을 진행하기 위하여, 아래 실시예 또는 시범성 기술 설명에 사용될 도면에 대하여 간략한 설명을 진행하는 바, 하기 설명 중의 도면은 단지 본 출원의 일부 실시예에 불과하며, 당업계의 기술자로 말하면 창조성적인 노력이 필요없이 이러한 도면에 의하여 기타 도면을 취득할 수 있다.
도1은 본 출원의 실시예에서 제공하는 생물 전환 방법을 이용하여 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 원리도.
도2는 본 출원의 일 실시예에서 제공하는 히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 보조 효소 재생 효소가 기질을 융합 발현 촉매 작용하는 도면.
도3은 본 출원에서 제공하는 실시예9에서 제조하여 취득한 타우로우루소데옥시콜산의 HPLC 스펙트럼.
본 발명의 실시방식
본 출원의 목적, 기술방안 및 장점을 더욱 잘 이해하도록 하기 위하여, 아래 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 본 출원에 대하여 진일보로 상세한 설명을 진행하도록 한다. 여기에 기재된 구체적인 실시예는 단지 본 출원의 해석에 불과하고 본 출원을 제한하는 것이 아님을 이해하여야 할 것이다.
용어 "제1", "제2"는 단지 설명의 편리를 위한 것이고, 상대적인 중요성을 암시하거나 또는 지시하는 기술 특징의 수량을 암시하는 것이 아니다. 특별한 설명이 없는 한, "다수"는 두 개 또는 두 개 이상을 뜻한다.
본 출원의 실시예 명세서에 언급된 관련 성분의 중량은 단지 각 구성 성분의 구체적인 함량을 가리킬 수 있고, 또한 각 구성 성분 간 중량의 비례 관계를 표시할 수 있기 때문에, 본 출원 실시예 명세서 관련 구성 성분의 함량을 비례에 따라 확대 또는 축소시키는 것은 모두 본 발명의 실시예 명세서가 공개한 범위에 속한다. 구체적으로 말하면, 본 출원 실시예 명세서 중의 상기 중량은 μg, mg, g, kg 등 화공 분야 공지의 질량 단위일 수 있다.
본 출원의 상기 기술방안을 설명하기 위하여, 아래 구체적인 도면 및 실시예를 참조하여 상세하게 설명하도록 한다.
제1 방면으로, 본 출원의 일부 실시예에서 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 유전자 코돈 최적화 단계, 엔지니어링 박테리아 구성 단계, 엔지니어링 박테리아 배양 단계, 기질 전환 및 생성물 제조 단계를 포함하며; 이 때 상기 엔지니어링 박테리아는 발효에 의해 효소를 발현하고, 발현된 효소는 기질을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시키며; 상기 기질은 타우로케노데옥시콜산이고, 상기 엔지니어링 박테리아는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아 계열에서 선택된다.
본 출원의 실시예에서 제공하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법의 유익한 효과는 하기와 같다.
(1) 본 출원에서 제공하는 생물 전환 방법을 사용하면, 전환시키고자 하는 기질 농도를 높을 있어, 기질 농도가 250g/L로 높을 수 있고, 반응 시간이 짧으며, 기질에 대한 전환율은 98% 이상으로 높을 수 있고, 취득한 제품 순도는 99% 이상이며;
(2) 상기 특정 발현의 대장간균을 사용하여 생물 엔지니어링 박테리아로 하면, 생물 전환 과정에서 반응 중간물 타우린 7-케톤리토콜린산이 타우로우루소데옥시콜산으로 전환되는 효율이 높고, 최종 제품에 거의 부산물이 포함되지 않으며;
(3) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 및 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 사용하여, 반응계에서 NAD+는 순환 재생되어, 보호 효소 NAD+의 사용량을 크게 낮추고, 효소 촉매 반응의 원가가 낮아지며, 산업 확대에 유리하며;
(4) 히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 보호 효소 재생 효소를 연성 폴리펩티드 서열을 통하여 한데 연결시켜 융합 단백질 폴리머를 구성하여, 기질 및 보조 효소와의 결합 거리가 더욱 가깝고, 전환 반응의 진행에 더욱 유리하며, 산업화 생산에서, 발효의 회수를 줄이고, 공정을 간략화시키며, 시간 원가와 원료 원가를 절약하며;
(5) 본 출원은 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 및 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 전세포를 사용하여 타우로우루소데옥시콜산의 전환을 진행할 수 있어, 세포 파쇄, 세포액 정화, 효소의 친화 정제 등 산업 원가가 큰 단계를 피하여, 대량의 원가를 절감하고, 또한 과정이 간단하고 제어가능하다.
도1에 도시된 바와 같이, 본 출원에서 제공하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법의 원리는, 타우로우루소데옥시콜산을 기질로 하여, 유전 공학 수단 조작 후의 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 사용하는 것을 통하여, 타우린 7-케톤리토콜린산으로 전환시키고, 아울러 공동 발현 또는 융합 발현의 젖산 데히드로게나아제가 피루브산 나트륨이 존재하는 상황 하에서, 보조 효소 NAD+를 순환 재생시키며; 그 후 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제가 타우린 7-케톤리토콜린산을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시키고, 아울러 공동 발현 또는 융합 발현의 포도당 데히드로게나아제가 포도당이 존재하는 상황 하에서 NAD+ 순환 재생시킨다. 상기 방법 중에서 융합 발현 단백질은 히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 보호 효소 재생 효소를 연성 폴리펩티드 서열을 통하여 한데 연결시켜 융합 단백질 폴리머를 구성하여, 기질과 보조 효소의 결합 거리가 더욱 가깝고, 전환 반응의 진행에 더욱 유리하도록 하여, 고수율, 고순도 타우로우루소데옥시콜산의 제조를 구현할 수 있다.
상기 엔지니어링 박테리아는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아 계열에서 선택된다는 것은, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 네 가지 효소는 반드시 동일한 엔지니어링 박테리아 중에서 완전하게 발현하는 것이 아니고, 두 개 또는 두 개 이상의 엔지니어링 박테리아가 형성하는 엔지니어링 박테리아 계열을 통하여 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 중의 한 가지 또는 여러 가지를 발현시킬 수 있어, 최종적으로 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 네 가지 효소의 발현을 구현하는 것을 가리킨다. 또한 대부분 상황 하에서, 두 개 또는 두 개 이상의 엔지니어링 박테리아가 형성하는 엔지니어링 박테리아 계열을 통하여 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 네 가지 효소의 발현을 구현한다. 상기 엔지니어링 박테리아 계열 중의 다수의 엔지니어링 박테리아는 동일한 유형의 엔지니어링 박테리아일 수 있음은 물론이다. 일부 실시예에서, 엔지니어링 박테리아에는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아, 및 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아가 포함된다. 엔지니어링 박테리아 계열 중의 엔지니어링 박테리아의 구성 방식은 이에 제한되지 않으며, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있기만 하면 물론인 것을 이해할 것이다. 또한 상기 일부 실시예에서, 상기 효소를 발현시키는 엔지니어링 박테리아는 대장간균일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 상기 젖산 데히드로게나아제의 발현 효소는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 단일 발현 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체융합 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 젖산 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 효소로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
일부 실시예에서, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 발현 효소는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 단일 발현 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 포도당 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 효소로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
일부 실시예에서, 상기 엔지니어링 박테리아는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 단일 발현 효소, 또는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 또는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소, 또는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 젖산 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 또는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 효소를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아로부터 선택되며; 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 단일 발현 효소, 또는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 또는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 4합체 융합 효소, 또는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 4합체 융합 효소와 포도당 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 또는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 4합체 융합 효소와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 효소를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아로부터 선택된다.
본 출원의 실시예에서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:1이고, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:3이며, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:5이고, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:7이다.
일부 실시예에서, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 A78및 V116 사이트에서 돌연변이가 일어난 것이다.
본 출원의 실시예에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:2이고, 상기 젖산 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:4이며, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:6이고, 상기 포도당 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:8이다.
본 출원의 실시예에서, 상기 원리를 사용하여 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조할 때, 엔지니어링 박테리아가 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시키는 유전자를 구성하고, 또한 유전자 코돈 최적화를 진행하여야 한다.
일부 실시예에서, 상기 유전자 코돈 최적화의 방법은, 유전자 서열에 대하여 대장간균 발현 코돈 최적화를 진행하고, 친화 태그를 추가하며, 또한 전장 유전자 합성을 진행하는 단계로서, 여기서 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7α-HSDH로, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자 LDH로, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7β-HSDH로, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 GDH로 표기한다.
유전자 코돈을 최적화한 후, 최적화 코돈 유전자가 포함된 엔지니어링 박테리아를 구성하고, 구성된 발현 벡터를 각각 대장간균 BL21(DE3)의 수용성 세포에 형질전환시켜 엔지니어링 박테리아를 취득하고, 또한 이에 대하여 배양을 진행한다.
일부 실시예에서, 상기 엔지니어링 박테리아 구성의 방법에는,
유전자 발현 벡터를 구성하고, 구성하여 취득한 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 유전자 발현 벡터를 대장간균 BL21의 수용성 세포에 형질전환시켜 엔지니어링 박테리아를 취득하는 단계가 포함된다.
일부 실시예에서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자를 7α-HSDH로 표기하고, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자를 LDH로 표기하며, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자를 7β-HSDH로 표기하며, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자를 GDH로 표기하며, 상기 유전자 발현 벡터를 구성하는 방법은,
7α-HSDH, LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH, pETDuet-1-LDH, pETDuet-1-7β-HSDH, pETDuet-1-GDH를 취득하는 단계; 또는
7α-HSDH와 LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 이중 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH/LDH, pETDuet-1-7β-HSDH/GDH를 취득하는 단계; 또는
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH), pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)를 취득하는 단계; 또는
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH, pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH를 취득하는 단계; 또는
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH를 취득하는 단계;를 포함하는 것이다.
일부 실시예에서, 상기 7α-HSDH는 캄필로박터 하이인테스틴날이스 (Campylobacter hyointestinalis)(UniProt: CDQ67_02445)에서 유래한 것이고, 상기 LDH는 인간(Human)(UniProt: P00338)에서 유래한 것이며, 상기 7β-HSDH는 콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) ATCC 25986(UniProt: A4ECA9)에서 유래한 것이고, 상기 GDH는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(균주 168) (UniProt: P12310)에서 유래한 것이다.
일부 실시예에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:9이고, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:11이다.
일부 실시예에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자에 의해 암호화되는 단백질 서열은 SEQ ID NO:10이고, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자에 의해 암호화되는 단백질 서열은 SEQ ID NO:12이다.
상기 엔지니어링 박테리아를 구성 완료한 후, 이에 대하여 배양을 진행하여, 대량으로 발효 및 발현되도록 한다. 일부 실시예에서, 상기 엔지니어링 박테리아 배양에는 엔지니어링 박테리아 소량 발효 및 발현 단계와 엔지니어링 박테리아 대량 발효 및 발현 단계가 포함된다. 그 중에서, 엔지니어링 박테리아 소량 발효 및 발현의 방법은, 엔지니어링 박테리아 균액을 암피실린 내성의 LB 플레이트에 도포하고, 단일 클론을 선택하여, 암파실린이 포함된 5mL의 LB 배지에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 배양을 진행하며, OD값이 0.8-1.2일 때, 1mM IPTG를 2h 동안 첨가하여 유도하고, SDS-PAGE로 발현량을 검사하여, 발현량이 높은 클론을 선택하여 균종 보존을 진행하며; 20μL의 균종을 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시키고, OD 값이 2.5-4.0일 때, 2mL 배양액을 취하여 암파실린 내성 배지에 접종시켜 배양시키고, OD 값이 1일 때, IPTG를 첨가하여 하루 밤 동안 발현을 유도하고, 균체를 수집하는 단계를 포함한다. 엔지니어링 박테리아 대량 발효 발현 및 방법은, 엔지니어링 박테리아를 선택하여 암파실린 내성 LB 배지의 1L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며, OD600값이 2.5-4.0일 때, 각각 20mL 배양액을 취하여 10개 1L 암파실린 내성 배지가 포함된 3L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며; 10L의 종자액을 200L의 대장간균 고밀도 발효 배지가 담긴 발효 탱크에 접종시키고, 기체를 통과시키고 가스를 통과시키면서 37℃에서 8시간 배양시킨 후, 발효 탱크에 최종 농도가 0.1mM인 IPTG 용액을 첨가하여 유도를 진행하고, 10-12h 유도 후 발효를 종료하고 액체를 배출하며, 원심 분리하여 균체를 수집하고 또한 4℃에서 보존하며, 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하는 단계를 포함하는 것이다.
엔지니어링 박테리아가 배양 및 대량 발효 발현 후, 엔지니어링 박테리아가 발현시킨 효소에 대하여 활성 측정을 진행할 수 있다.
본 실시예에서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법은, 타우로우루소데옥시콜산을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.97mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 최종 농도가 0.5mM인 타우로우루소데옥시콜산, 10μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.5mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 증가를 측정하는 단계이다.
본 출원의 실시예에서, 젖산 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법은, 피루브산 나트륨을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.7mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 0.2mL의 100mM 피루브산 나트륨, 50μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.2mM인 NADH를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 감소를 측정하는 것이다.
본 출원의 실시예에서, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법은, 타우로케노데옥시콜산을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.97mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 최종 농도가 0.5mM인 타우로케노데옥시콜산, 10μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.5mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 증가를 측정하는 것이다.
본 출원의 실시예에서, 포도당 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법은, 포도당을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.7mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 0.2mL의 1.5M 포도당, 50μL의 희석 효소액, 최종 농도가 2mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 2min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 증가를 측정하는 것이다.
본 출원의 실시예에서, 엔지니어링 박테리아가 안정적으로 목표 효소를 발현시킬 수 있을 때까지 배양된 후, 엔지니어링 박테리아를 사용하여 직접 기질을 전환시켜 타우로우루소데옥시콜산을 제조한다. 상기 기질은 타우로케노데옥시콜산이다. 일부 실시예에서, 상기 기질의 농도는 20g/L-250g/L이다. 상기 기질은 저농도 반응 시, 반응 체적이 크고, 보조 효소 사용량이 많다. 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 사용량을 최적화시키는 것을 통하여, 기질 농도를 250g/L로 향상시켜, 반응계 체적과 보조 효소의 사용량을 감소시켰다. 상기 기질 농도가 계속 증가하여 250g/L을 초과할 때, 기질 용해 성능이 떨어져, 기질의 전환이 불충분하다.
일부 실시예에서, 상기 타우로케노데옥시콜산을 기질로 사용하여, 엔지니어링 박테리아로 직접 기질을 전환시키는 방법에는,
타우로케노데옥시콜산을 20-100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.01-0.8mM NAD+를 첨가하며, 5-60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 최종 체적까지 20-100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하며, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계; 1.8-100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하고, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계;가 포함된다.
본 출원의 실시예에서, 기질 전환이 종료된 후, 엔지니어링 박테리아 중의 생성물 타우로우루소데옥시콜산을 추출한다. 일부 실시예에서, 상기 타우로우루소데옥시콜산의 제조 방법에는, 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 2-10배의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 원심 분리 또는 필터링으로 침전을 제거하고, 상청액을 건조시키면 타우로우루소데옥시콜산을 취득하며, 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 고성능 액체 제조 장치를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼에 주입하며; 그 후 서로 다른 농도의 메탄올-물 유동상으로 단계별 용리를 진행하고, 수집된 용리액을 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 단계가 포함된다.
일부 실시예에서, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법에는 하기 단계가 포함된다.
(1) 유전자 코돈 최적화
유전자 서열에 대하여 대장간균 발현 코돈 최적화를 진행하고, 친화 태그를 추가하며, 또한 전장 유전자 합성을 진행하는 단계로서, 각각 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7α-HSDH로, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 LDH로, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7β-HSDH로, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 GDH로 각각 표기되는 것인 단계;
(2) 엔지니어링 박테리아 구성
유전자 발현 벡터를 구성하고, 구성하여 취득한 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 유전자 발현 벡터를 대장간균 BL21의 수용성 세포에 형질전환시켜 엔지니어링 박테리아를 취득하는 단계;
(3) 엔지니어링 박테리아 배양
엔지니어링 박테리아를 소량 발효 및 발현시키는 단계로서: 엔지니어링 박테리아 균액을 암피실린 내성의 LB 플레이트에 도포하고, 단일 클론을 선택하여, 암파실린이 포함된 5mL의 LB 배지에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 배양을 진행하며, OD값이 0.8-1.2일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 2h 동안 유도하고, SDS-PAGE로 발현량을 검사하여, 발현량이 높은 클론을 선택하여 균종 보존을 진행하며; 20μL의 균종을 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시키고, OD 값이 2.5-4.0일 때, 2mL 배양액을 취하여 암파실린 내성 배지에 접종시켜 배양시키고, OD 값이 1일 때, IPTG를 첨가하여 하루 밤 동안 발현을 유도하고, 균체를 수집하는 단계;
엔지니어링 박테리아를 대량 발효 및 발현시키는 단계로서: 엔지니어링 박테리아를 선택하여 암파실린 내성 LB 배지의 1L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며, OD600값이 2.5-4.0일 때, 각각 20mL 배양액을 취하여 10개 1L 암파실린 내성 배지가 포함된 3L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며; 10L의 종자액을 200L의 대장간균 고밀도 발효 배지가 담긴 발효 탱크에 접종시키고, 기체를 통과시키고 가스를 통과시키면서 37℃에서 8시간 배양시킨 후, 발효 탱크에 최종 농도가 0.1mM인 IPTG 용액을 첨가하여 유도를 진행하고, 10-12h 유도 후 발효를 종료하고 액체를 배출하며, 원심 분리하여 균체를 수집하고 또한 4℃에서 보존하며, 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하는 단계;
(4) 기질 전환
타우로케노데옥시콜산 용액을 20-100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.01-0.8mM NAD+를 첨가하며, 5-60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 최종 체적까지 20-100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하며, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계; 및 1.8-100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하고, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계;
(5) 생성물 제조
(4) 단계에서의 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 2-10배의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 생성된 혼합물을 원심 분리 또는 필터링하여 침전을 제거하고, 상청액을 건조시켜 타우로우루소데옥시콜산을 취득하며, 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 고성능 액체 제조 장치를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼에 주입하며; 그 후 서로 다른 농도의 메탄올-물 유동상으로 단계별 용리를 진행하고, 용리액을 수집하고 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, (2) 단계 후, 상기 유전자 발현 벡터를 구성하는 방법은,
7α-HSDH, LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH, pETDuet-1-LDH, pETDuet-1-7β-HSDH, pETDuet-1-GDH를 취득하는 단계; 또는
7α-HSDH와 LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 이중 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH/LDH, pETDuet-1-7β-HSDH/GDH를 취득하는 단계; 또는
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH), pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)를 취득하는 단계; 또는
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH, pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH를 취득하는 단계; 또는
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH를 취득하는 단계이다.
본 출원의 실시예에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:1이고, 상기 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:3이며, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:5이고, 상기 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:7이다.
본 출원의 실시예에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 상기 젖산 데히드로게나아제, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 상기 포도당 데히드로게나아제는 독립적으로 액체 효소 또는 고정화 효소로부터 선택되고, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 상기 젖산 데히드로게나아제, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 상기 포도당 데히드로게나아제는 독립적으로 전세포, 정제를 거치지 않은 효소 또는 정제를 거친 효소로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 생물 전환법의 구체적인 단계는 하기와 같다.
(1) 유전자 코돈 최적화
유전자 서열에 대하여 대장간균 발현 코돈 최적화를 진행하고, 친화 태그를 추가하며, 또한 전장 유전자 합성을 진행하는 단계로서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7α-HSDH로, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 LDH로, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7β-HSDH로, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 GDH로 각각 표기되는 것인 단계;
(2) 단일 유전자 발현 벡터 구성
7α-HSDH, LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-7α-HSDH, pETDuet-1-LDH, pETDuet-1-7β-HSDH, pETDuet-1-GDH를 취득하는 단계;
(3) 이중 유전자 발현 벡터 구성
7α-HSDH와 LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-7α-HSDH/LDH, pETDuet-1-7β-HSDH/GDH를 취득하는 단계;
(4) 단일 유전자 융합 단백질 발현 벡터 구성
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH), pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)를 취득하는 단계;
(5) 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 구성
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH, pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH를 취득하는 단계;
(6) 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 구성
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH를 취득하는 단계;
(7) 엔지니어링 박테리아 구성
(2)-(6) 단계에서 구성한 모든 발현 벡터를 각각 대장간균 BL21(DE3)의 수용성 세포에 형질전환시켜 엔지니어링 박테리아를 취득하는 단계;
(8) 엔지니어링 박테리아의 소량 발효 및 발현
엔지니어링 박테리아 균액을 암피실린 내성의 LB 플레이트에 도포하고, 단일 클론을 선택하여, 암파실린이 포함된 5mL의 LB 배지에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 배양을 진행하며, OD값이 0.8-1.2일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 2h 동안 유도하고, SDS-PAGE로 발현량을 검사하여, 발현량이 높은 클론을 선택하여 균종 보존을 진행하며; 20μL의 균종을 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시키고, OD 값이 2.5-4.0일 때, 2mL 배양액을 취하여 암파실린 내성 배지에 접종시켜 배양시키고, OD 값이 1일 때, IPTG를 첨가하여 하루 밤 동안 발현을 유도하고, 균체를 수집하는 단계;
(9) 엔지니어링 박테리아의 대량 발효 및 발현
엔지니어링 박테리아를 선택하여 암파실린 내성 LB 배지의 1L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며, OD600값이 2.5-4.0일 때, 각각 20mL 배양액을 취하여 10개 1L 암파실린 내성 배지가 포함된 3L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며; 10L의 종자액을 200L의 대장간균 고밀도 발효 배지가 담긴 발효 탱크에 접종시키고, 기체를 통과시키고 가스를 통과시키면서 37℃에서 8시간 배양시킨 후, 발효 탱크에 최종 농도가 0.1mM인 IPTG 용액을 첨가하여 유도를 진행하고, 10-12h 동안 유도 후 발효를 종료하고 액체를 배출하며, 원심 분리하여 균체를 수집하고 또한 4℃에서 보존하며, 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하는 단계;
(10) 효소 활성 측정
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 타우로우루소데옥시콜산을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.97mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 최종 농도가 0.5mM인 타우로우루소데옥시콜산, 10μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.5mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 증가를 측정하는 단계;
젖산 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 피루브산 나트륨을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.7mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 0.2mL의 100mM 피루브산 나트륨, 50μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.2mM인 NADH를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 감소를 측정하는 단계;
7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 타우로케노데옥시콜산을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.97mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 최종 농도가 0.5mM인 타우로케노데옥시콜산, 10μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.5mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안반응시키며, 340nm 위치에서 흡광값 증가를 측정하는 단계;
포도당 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 포도당을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.7mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 0.2mL의 1.5M 포도당, 50μL의 희석 효소액, 최종 농도가 2mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 2min 동안 반응시키며, 340nm 위치에서 흡광값 증가를 측정하는 단계;
(11) 타우로케노데옥시콜산을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환
타우로케노데옥시콜산 용액을 20-100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.01-0.8mM NAD+를 첨가하며, 5-60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하며, 최종 체적까지 20-100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하며, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계; 1.8-100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하며, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하고, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계;
(12) 타우로우루소데옥시콜산의 제조
(11) 단계에서의 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 2-10배의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 원심 분리 또는 필터링으로 침전을 제거하고, 상청액을 건조시키면 타우로우루소데옥시콜산을 취득하며, 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 고성능 액체 제조 장치를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼에 주입하며; 그 후 서로 다른 농도의 메탄올-물 유동상으로 단계별 용리를 진행하고, 수집된 용리액을 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 것인 단계이다.
제2 방면으로, 본 출원의 실시예에서는 상기 방법의 우루소데옥시콜산 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시예에서 제공하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 응용의 유익한 효과라면, 생물 전환으로 제조된 타우로우루소데옥시콜산 전환액 중에서, 알칼리 분해를 진행하여 우루소데옥시콜산을 제조하여, 화학법으로 우루소데옥시콜산을 제조할 때 대량의 유기 용제를 사용하는 것을 피하며; 또한 방법은 반응 시간이 짧고, 반응이 온화하고 제어가능하며, 조작이 간단하다.
일부 실시예에서, 상기 우루소데옥시콜산 제조 과정은 하기의 단계를 포함하는 것인 바, 전환 생성된 타우로우루소데옥시콜산 용액 중에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 8-11로 조정하고, 80-100℃로 승온시켜 18-24h 동안 반응시키며, 10-15℃로 온도를 낮추고 염산을 첨가하여 pH를 3-5로 조정하여, 우루소데옥시콜산을 석출하는 단계이다. 생물 전환법으로 제조된 타우로우루소데옥시콜산 전환액 중에서, 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 8-11로 조정하여 알칼리 분해를 진행하고, 그 후 염산을 첨가하여 중화시켜 우루소데옥시콜산을 석출하여, 화학법으로 우루소데옥시콜산을 제조할 때 대량의 유기 용제를 사용하는 것을 피하며; 반응 시간이 짧고, 반응이 온화하고 제어가능하며, 조작이 간단하다.
상기 생물 전환 반응 과정에서 기질의 농도는 20-250g/L이다.
상기 모든 효소는 모두 액체 효소 또는 고체 효소일 수 있고, 또한 전세포, 정제를 거치지 않은 효소 또는 정제된 효소일 수 있다.
아래, 구체적인 실시예를 참조하여 설명을 진행하도록 한다
하기 구체적인 실시예에서, 재조합 플라스미드의 구성 방법은 구체적으로 하기와 같다.
1. 단일 유전자 발현 벡터의 구성
a) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-7α-HSDH의 제조
캄필로박터 하이인테스틴날이스(Campylobacter hyointestinalis)에서 비롯된 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자(DNA 서열: SEQ ID NO:1, 엔코딩된 단백질 서열: SEQ ID NO:2)를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:13)5´-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:14)5´-CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, BamH I과 EcoR I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. BamH I과 EcoR I를 사용하여 pETDuet-1 벡터를 효소 절단한다. 연결 효소를 사용하여 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
b) 젖산 데히드로게나아제 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-LDH의 제조
인간(Human)에서 비롯된 젖산 데히드로게나아제 유전자(DNA 서열: SEQ ID NO:3, 엔코딩된 단백질 서열: SEQ ID NO:4)를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:16)5´-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. pETDuet-1 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 젖산 데히드로게나아제 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
c) 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-7β-HSDH의 제조
콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) ATCC 25986에서 비롯된 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자의 뮤톤(A78C, V116C)(DNA 서열: SEQ ID NO:5, 엔코딩된 단백질 서열: SEQ ID NO:6)를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:17)5´-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:18)5´-CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, BamH I과 EcoR I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. BamH I과 EcoR I를 사용하여 pETDuet-1 벡터를 효소 절단한다. 연결 효소를 사용하여 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
d) 포도당 데히드로게나아제 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-GDH의 제조
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (균주 168)에서 비롯된 포도당 데히드로게나아제 유전자(DNA 서열: SEQ ID NO:7, 엔코딩된 단백질 서열: SEQ ID NO:8)를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:19)5´-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. pETDuet-1 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 젖산 데히드로게나아제 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
2. 이중 유전자 공동 발현 벡터의 구성
a) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-7α-HSDH/LDH의 제조
인간(Human)에서 비롯된 젖산 데히드로게나아제 유전자를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:16)5´-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. 상기 시퀀싱이 정확한 pETDuet-1-7α-HSDH 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 젖산 데히드로게나아제 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
b) 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-7β-HSDH/GDH의 제조
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (균주 168)에서 비롯된 포도 데히드로게나아제 유전자를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:19)5´-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. 상기 시퀀싱이 정확한 pETDuet-1-7β-HSDH 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 젖산 데히드로게나아제 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
3. 단일 유전자 발현 융합 단백질 벡터의 구성
a) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자 재조합 플라스미드 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)의 제조
7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자(DNA 서열: SEQ ID NO:9, 엔코딩된 단백질 서열: SEQ ID NO:10)를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:14)5´-CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, BamH I과 EcoR I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. BamH I과 EcoR I를 사용하여 pETDuet-1 벡터를 효소 절단한다. 연결 효소를 사용하여 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
b) 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자 재조합 플라스미드 pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)의 제조
7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자(DNA 서열: SEQ ID NO:11, 엔코딩된 단백질 서열: SEQ ID NO:12)를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:18)5´-GAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, BamH I과 EcoR I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. BamH I과 EcoR I를 사용하여 pETDuet-1 벡터를 효소 절단한다. 연결 효소를 사용하여 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
4. 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터의 구성
a) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 유전자가 공동 발현이 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH의 제조
Human에서 비롯된 젖산 데히드로게나아제 유전자를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:16)5´-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH) 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 젖산 데히드로게나아제 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
b) 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 유전자가 공동 발현이 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH의 제조
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (균주 168)에서 비롯된 포도 데히드로게나아제 유전자를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:19)5´-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH) 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 포도당 데히드로게나아제 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
5. 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터의 구성
a) 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 유전자가 공동 발현이 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH의 제조
캄필로박터 하이인테스틴날이스(Campylobacter hyointestinalis)에서 비롯된 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자를 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:20)5´-TCCCTCGAGTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH) 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 유전자 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
b) 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 유전자가 공동 발현이 포함된 재조합 플라스미드 pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH의 제조
콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) ATCC 25986에서 비롯된 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 뮤톤(A78C, V116C)을 프라이머 쌍 (SEQ ID NO:15)5´-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3´와(SEQ ID NO:21)5´-TCCCTCGAGTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3´를 사용하여 PCR를 통하여 확장을 진행하고, Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단을 진행하며, Dpn I 효소를 사용하여 템플릿을 소화한다. pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH) 플라스미드를 Nde I과 Ava I를 사용하여 효소 절단하고, 연결 효소를 사용하여 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 토막과 벡터를 연결시킨다. 연결 생성물을 DH5α로 전환시키고, 암파실린 내성의 LB 플레이트에 도포하여 선별을 진행한다. 단일 클론을 선택하여 5mL LB에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시킨다. 균체를 수집하고, TIANGEN 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 시퀀싱을 진행한다. 시퀀싱이 정확한 플라스미드를 보존한다.
실시예1 재조합 플라스미드가 포함된 대장간균의 삼각플라스크에서의 발효 및 발현
재조합 플라스미드가 포함된 20μL의 대장간균 BL21(DE3) 균종을 취하여, 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시키고, OD600 값이 2.5-4.0이 될 때까지 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시킨다. 20mL 배양액을 취하여 1L의 암파실린 내성 배양지에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 3시간 동안 배양시키며, OD600값이 1일 때, 0.5mM IPTG를 첨가하여 하루 밤 동안 발현을 유도한다. 원심 분리시켜 균체를 수집한다. 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하다. 기술방안 중의 방법에 따라 효소 활성을 측정한다.
실시예2 재조합 플라스미드가 포함된 대장간균의 발효 탱크에서의 발효 및 발현
재조합 플라스미드가 포함된 20μL의 대장간균 BL21(DE3) 균종을 취하여, 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시키고, OD600 값이 2.5-4.0이 될 때까지 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시킨다. 20mL 배양액을 취하여 1L의 암파실린 내성 배양지에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 하루 밤 동안 배양시킨다. 10L의 종자액을 200L의 대장간균 고밀도 발효 배지가 담긴 발효 탱크에 접종시키고, 37℃, 기체를 통과시키면서 8시간 배양시킨다. 대장간균 고밀도 발효 배지에는, 18g/L의 이수소칼륨 인산 도데카하이드레이트, 6.8g/L의 인산이수소칼륨, 0.7g/L의 무수황산나트륨, 0.48g/L의 황산마그네슘, 2.25g/L의 글리세신, 2.5g/L의 효모 분말, 5g/L의 펩톤이 포함된다. 가스를 통과시키면서 8시간 배양시킨 후, 발효 탱크에 최종 농도가 0.1mM인 IPTG 용액을 첨가하여 유도를 진행하고, 10-12h 유도 후 발효를 종료하고 액체를 배출하며, 원심 분리하여 균체를 수집하고 또한 4℃에서 보존한다. 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하다. 기술방안 중의 방법에 따라 효소 활성을 측정한다.
실시예3 1L 반응계에서 단일 유전자 발현 단백질을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산 전환
250g의 타우로케노데옥시콜산을 700mL의 100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.25mM의 NAD+를 첨가하며, 60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제(순수 효소 대략 5g 포함)와 젖산 데히드로게나아제(순수 효소 대략 2g 포함)를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 1L까지 100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제(순수 효소 대략 5g 포함)와 포도당 데히드로게나아제(순수 효소 대략 2g 포함)를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃, 6-18h 반응시킨다. 기질 전환율이 98% 이상이고, 완성품 함량이 96.8% 이상이며, 수율이 85% 이상이다.
실시예4 1L 반응계에서 이중 유전자 공동 발현 단백질을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산 전환
250g의 타우로케노데옥시콜산을 700mL의 100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.25mM의 NAD+를 첨가하며, 60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제(효소 함량 총 대략 10g)를 공동-발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 1L까지 100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제(효소 함량 총 대략 10g)를 공동-발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 기질 전환율이 98% 이상이고, 완성품 함량이 96.8% 이상이며, 수율이 85% 이상이다.
실시예5 1L 반응계에서 단일 유전자 발현 융합 단백질을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산 전환
250g의 타우로케노데옥시콜산을 700mL의 100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.25mM의 NAD+를 첨가하며, 60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제(효소 함량 대략 5g)를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 1L까지 100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제(효소 함량 대략 5g)를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 기질 전환율이 99.7% 이상이고, 완성품 함량이 96.8% 이상이며, 수율이 85% 이상이다.
실시예6 1L 반응계에서 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 단백질을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산 전환
250g의 타우로케노데옥시콜산을 700mL의 100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.20mM의 NAD+를 첨가하며, 60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제(효소 함량 총 대략 7g)를 공동-발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 1L까지 100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제(효소 함량 총 대략 7g)를 공동-발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 기질 전환율이 98.5% 이상이고, 완성품 함량이 96.8% 이상이며, 수율이 85% 이상이다.
실시예7 1L 반응계에서 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 단백질을 사용하여 타우로우루소데옥시콜산 전환
250g의 타우로케노데옥시콜산을 700mL의 100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.50mM의 NAD+를 첨가하며, 60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제(효소 함량 총 대략 7g)를 공동-발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 1L까지 100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제(효소 함량 총 대략 7g)를 공동-발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 기질 전환율이 99.5% 이상이고, 완성품 함량이 96.8% 이상이며, 수율이 85% 이상이다.
실시예8 100L 반응계에서 단일 유전자 발현 융합 단백질로 타우로우루소데옥시콜산 전환
25Kg의 타우로케노데옥시콜산을 70L의 100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.25mM의 NAD+를 첨가하며, 60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제(효소 함량 대략 500g)를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 100L까지 100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제(효소 함량 대략 500g)를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 5M의 NaOH로 pH를 7.5로 조정한다. 25℃에서, 6-18h 동안 반응시킨다. 기질 전환율이 99.5% 이상이고, 완성품 함량이 96.8% 이상이며, 수율이 85% 이상이다.
실시예3-8에서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제의 사용량, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 사용량, NAD+ 첨가량 및 기질 전환율은 하기 표1에 표시된 바와 같다.
7α-HSDH+LDH 효소 사용량(g/L) 7β-HSDH+GDH 효소 사용량(g/L) NAD+ 첨가량(mM) 기질 전환율
실시예3 7 7 0.25 98%
실시예4 10 10 0.25 98%
실시예5 5 5 0.25 99.7%
실시예6 7 7 0.20 98.5%
실시예7 7 7 0.50 99.5%
실시예8 5 5 0.25 99.5%
실시예9 타우로우루소데옥시콜산의 제조
상기 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 10배 체적의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 원심 분리 또는 필터링으로 침전을 제거한다. 상청액을 건조시켜 타우로우루소데옥시콜산을 취득한다. 반응 후의 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 HPLC를 사용하여 C18 실리카 겔 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼(칼럼 규격은 15*255mm)에 주입하며; 그 후 30% 메탄올-수용액으로 조제한 유동상A를 스테인레스 칼럼에 주입하여 용리를 진행하는 바, 용리 속도는 240mL/h이고, 용리 시간은 175분이며, 용리액1을 수집하며; 다시 유동상 구배를 50분 내에 선형으로 50% 유동상B(80% 메탄올-수용액)로 향상시켜 용리를 진행하고, 50% 유동상B를 유지하면서 75분 동안 용리시켜 용리액2를 수집하며; 유동상 구배를 40분 내에 선형으로 100% 유동상B로 향상시켜 용리를 진행하고, 100% 유동상B를 유지하면서 70분 동안 용리시켜 용리액3를 수집하며; 수집된 용리액을 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 바, 그 중에서 용리액1 중의 타우로우루소데옥시콜산 함량은 5.77%이고, 회수율은 8.2%이며, 용리액2 중의 타우로우루소데옥시콜산 함량은 99.3%이고, 회수율은 81.5%이며, 용리액3 중의 타우로우루소데옥시콜산 함량은 14.9%이고, 회수율은 10.3%이다. 실시예9에서 제조하여 취득한 타우로우루소데옥시콜산의 HPLC 스펙트럼을 도3에 도시된 바와 같다.
실시예10 우루소데옥시콜산의 제조
상기 전환 완성된 반응액에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 10으로 조정하고, 100℃로 승온시켜 24h 반응시키며, 10℃로 온도를 낮추고 염산을 첨가하여 pH를 4로 조정하여, 우루소데옥시콜산을 석출한다. 그리하면 우루소데옥시콜산 조생성물을 취득한다.
이상에서는 본 발명을 선택가능한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였다. 당업계의 기술인원들로 놓고 말하면 본 발명은 여러 가지 개변과 변화를 가질 수 있다. 본 출원의 기본사상과 원칙 범위 내에서 이루어지는 수정, 등가 대체, 개선 등은 모두 본 출원의 청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVABAND BIOMEDICAL TECHNOLOGY INC. <120> METHOD FOR PREPARING TAUROURSODEOXYCHOLIC ACID BY BIOTRANSFORMATION AND APPLICATION THEREOF <130> PKR204577-1-APC-2020-0328 <150> CN 201811446689.5 <151> November 29, 2018 <160> 21 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> Campylobacter hyointestinalis <400> 1 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgagttgc 60 tataacgatg agtttaaagg taaaaccctg gttattagcg gtggcacccg cggtattggt 120 cgcgccattg ttctggaatt tgccaatgca ggtgcaaata ttgcattcac ttttaatagc 180 aacaaggaaa tggccgaaga acaggcccgt gaactggaaa ataagtttgg tattaaggcc 240 cgcgcctatg cactgaatat tctggaaccg gaaagttata aagaactgtt tctgcagatt 300 gatgaagatt ttgatcgtgt ggatttcttt attagcaatg ccattattag cggccgtgcc 360 gttgcaggcg gttataccaa attcatgaaa ctgaaaccgc gcggtattaa taatattttt 420 accgccaccg tgaatgcatt tgtttgcggt acacaggaag ccgccaaacg tatggaaaaa 480 gttggtggtg gtagcgttat tagtctgagc agtaccggca atctggtgta tattgaacat 540 tatagcggcc atggcaccgc caaagcagca gtggaagcca tggcccgcta tgcagcaacc 600 gaactgggcg ataaaaatat tcgtgttaat gttgttagcg gcggtccgat tgaaaccgat 660 gcactgcgtg cctttaccaa ttatgaagaa gtgcgcgatg caaccgcagc cctgagcccg 720 ctgggtcgta tgggccagcc gaccgatctg gccggcgcat gtctgtttct gtgtagcagc 780 aaagccagtt gggtgaccgg tcataccttt attattgatg gtggcaccac ctttaaataa 840 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> Campylobacter hyointestinalis <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Met Ser Cys Tyr Asn Asp Glu Phe Lys Gly Lys Thr Leu Val Ile 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Arg Gly Ile Gly Arg Ala Ile Val Leu Glu Phe Ala 35 40 45 Asn Ala Gly Ala Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asn Ser Asn Lys Glu Met 50 55 60 Ala Glu Glu Gln Ala Arg Glu Leu Glu Asn Lys Phe Gly Ile Lys Ala 65 70 75 80 Arg Ala Tyr Ala Leu Asn Ile Leu Glu Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu 85 90 95 Phe Leu Gln Ile Asp Glu Asp Phe Asp Arg Val Asp Phe Phe Ile Ser 100 105 110 Asn Ala Ile Ile Ser Gly Arg Ala Val Ala Gly Gly Tyr Thr Lys Phe 115 120 125 Met Lys Leu Lys Pro Arg Gly Ile Asn Asn Ile Phe Thr Ala Thr Val 130 135 140 Asn Ala Phe Val Cys Gly Thr Gln Glu Ala Ala Lys Arg Met Glu Lys 145 150 155 160 Val Gly Gly Gly Ser Val Ile Ser Leu Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val 165 170 175 Tyr Ile Glu His Tyr Ser Gly His Gly Thr Ala Lys Ala Ala Val Glu 180 185 190 Ala Met Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Glu Leu Gly Asp Lys Asn Ile Arg 195 200 205 Val Asn Val Val Ser Gly Gly Pro Ile Glu Thr Asp Ala Leu Arg Ala 210 215 220 Phe Thr Asn Tyr Glu Glu Val Arg Asp Ala Thr Ala Ala Leu Ser Pro 225 230 235 240 Leu Gly Arg Met Gly Gln Pro Thr Asp Leu Ala Gly Ala Cys Leu Phe 245 250 255 Leu Cys Ser Ser Lys Ala Ser Trp Val Thr Gly His Thr Phe Ile Ile 260 265 270 Asp Gly Gly Thr Thr Phe Lys 275 <210> 3 <211> 1050 <212> DNA <213> human <400> 3 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catggcaacc 60 ctgaaagatc agctgatcta taatctgctg aaagaagaac agaccccgca gaataagatt 120 accgtggtgg gcgtgggtgc agtgggcatg gcctgcgcaa ttagcattct gatgaaagat 180 ctggcagatg aactggcact ggtggatgtg attgaagata aactgaaagg cgaaatgatg 240 gatctgcagc atggtagtct gtttctgcgt accccgaaaa ttgtgagtgg taaagattat 300 aatgtgaccg caaatagcaa actggttatt attaccgcag gcgcccgtca gcaggaaggt 360 gaaagtcgtc tgaatctggt gcagcgtaat gtgaatattt ttaaattcat catccctaac 420 gtggttaaat atagcccgaa ttgcaaactg ctgattgtga gcaatccggt ggatattctg 480 acctatgttg cctggaaaat tagtggtttt ccgaaaaatc gtgttattgg cagcggctgt 540 aatctggata gtgcacgttt tcgctatctg atgggcgaac gtctgggcgt tcatccgctg 600 agttgccacg gttgggtgct gggtgaacat ggtgacagca gcgttccggt ttggagcggc 660 atgaatgtgg ccggtgttag tctgaaaacc ctgcatccgg atctgggtac agataaagat 720 aaagaacagt ggaaagaagt tcataaacag gtggttgaaa gtgcatacga agtgattaag 780 ctgaaaggct ataccagctg ggcaattggt ctgagcgttg cagatctggc agaaagtatt 840 atgaaaaatc tgcgccgtgt gcatccggtt agcaccatga ttaagggcct gtatggtatt 900 aaggatgatg tgtttctgag cgtgccgtgc attctgggcc agaatggtat tagtgatctg 960 gttaaagtta ccctgaccag tgaagaagaa gcacgtctga aaaaatctgc agataccctg 1020 tggggcattc agaaagaact gcagttttaa 1050 <210> 4 <211> 349 <212> PRT <213> human <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val 35 40 45 Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu 50 55 60 Leu Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met 65 70 75 80 Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser 85 90 95 Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr 100 105 110 Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln 115 120 125 Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr 130 135 140 Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu 145 150 155 160 Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile 165 170 175 Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly 180 185 190 Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly 195 200 205 Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Met Asn Val Ala 210 215 220 Gly Val Ser Leu Lys Thr Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Lys Asp 225 230 235 240 Lys Glu Gln Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr 245 250 255 Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser 260 265 270 Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His 275 280 285 Pro Val Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Asp Val 290 295 300 Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Leu 305 310 315 320 Val Lys Val Thr Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser 325 330 335 Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 340 345 <210> 5 <211> 843 <212> DNA <213> Collinsella aerofaciens <400> 5 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgaacctg 60 cgtgaaaaat acggtgaatg gggtctgatc ctgggtgcta ccgaaggtgt tggtaaagct 120 ttctgcgaaa aaatcgctgc tggtggtatg aacgttgtta tggttggtcg tcgtgaagaa 180 aaactgaacg ttctggctgg 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Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ala Gly 35 40 45 Gly Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Asn Val 50 55 60 Leu Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu Thr Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Phe Cys Ala 85 90 95 Thr Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu His 100 105 110 Ser Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met 115 120 125 Ile Asn Val Asn Cys Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe His His Tyr Met 130 135 140 Arg Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser 145 150 155 160 Met Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly 165 170 175 Lys Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Cys Glu 180 185 190 Gly Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr 195 200 205 Pro Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val 210 215 220 Met Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp Glu Ala Phe Glu 225 230 235 240 Lys Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln Arg Asn Lys Asp 245 250 255 Ser Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile Arg 260 265 270 Tyr Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp 275 280 <210> 7 <211> 837 <212> DNA <213> 고초균(Bacillus subtilis) <400> 7 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgtacccg 60 gatctgaaag gcaaagttgt tgcaattacc ggtgccgcca gtggcctggg caaagccatg 120 gcaattcgtt ttggcaaaga acaggccaaa gtggttatta attattatag caacaagcag 180 gacccgaatg aagttaaaga agaagtgatt aaggccggtg gtgaagcagt tgttgttcag 240 ggtgacgtga ccaaagaaga agatgttaaa aatatcgtgc agaccgccat taaggaattt 300 ggcaccctgg atattatgat taataatgcc ggcctggaaa atccggttcc gagccatgaa 360 atgccgctga aagattggga taaagttatt ggcaccaatc tgaccggcgc atttctgggt 420 agtcgtgaag ccattaagta ttttgtggaa aatgatatta agggcaacgt tattaacatg 480 agcagcgtgc atgaagtgat tccgtggccg ctgtttgttc attatgcagc aagcaaaggt 540 ggtattaagc tgatgaccga aaccctggca ctggaatatg caccgaaagg tattcgcgtg 600 aataatattg gcccgggtgc cattaatacc ccgattaatg cagaaaaatt cgccgatccg 660 aaacagaaag cagatgtgga aagtatgatt ccgatgggct atattggtga accggaagaa 720 attgccgcag tggcagcatg gctggcaagc aaagaagcaa gctatgttac cggtattacc 780 ctgtttgcag atggcggtat gacccagtat ccgagctttc aggccggtcg tggttaa 837 <210> 8 <211> 278 <212> PRT <213> 고초균(Bacillus subtilis) <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala 20 25 30 Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln 35 40 45 Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu 50 55 60 Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln 65 70 75 80 Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu 100 105 110 Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys 115 120 125 Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala 130 135 140 Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met 145 150 155 160 Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu 180 185 190 Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile 195 200 205 Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala 210 215 220 Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu 225 230 235 240 Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val 245 250 255 Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser 260 265 270 Phe Gln Ala Gly Arg Gly 275 <210> 9 <211> 1881 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 9 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catggcaacc 60 ctgaaagatc agctgatcta taatctgctg aaagaagaac agaccccgca gaataagatt 120 accgtggtgg gcgtgggtgc agtgggcatg gcctgcgcaa ttagcattct gatgaaagat 180 ctggcagatg aactggcact ggtggatgtg attgaagata aactgaaagg cgaaatgatg 240 gatctgcagc atggtagtct gtttctgcgt accccgaaaa ttgtgagtgg taaagattat 300 aatgtgaccg caaatagcaa actggttatt attaccgcag gcgcccgtca gcaggaaggt 360 gaaagtcgtc tgaatctggt gcagcgtaat gtgaatattt ttaaattcat catccctaac 420 gtggttaaat atagcccgaa ttgcaaactg ctgattgtga gcaatccggt ggatattctg 480 acctatgttg cctggaaaat tagtggtttt ccgaaaaatc gtgttattgg cagcggctgt 540 aatctggata gtgcacgttt tcgctatctg atgggcgaac gtctgggcgt tcatccgctg 600 agttgccacg gttgggtgct gggtgaacat ggtgacagca gcgttccggt ttggagcggc 660 atgaatgtgg ccggtgttag tctgaaaacc ctgcatccgg atctgggtac agataaagat 720 aaagaacagt ggaaagaagt tcataaacag gtggttgaaa gtgcatacga agtgattaag 780 ctgaaaggct ataccagctg ggcaattggt ctgagcgttg cagatctggc agaaagtatt 840 atgaaaaatc tgcgccgtgt gcatccggtt agcaccatga ttaagggcct gtatggtatt 900 aaggatgatg tgtttctgag cgtgccgtgc attctgggcc agaatggtat tagtgatctg 960 gttaaagtta ccctgaccag tgaagaagaa gcacgtctga aaaaatctgc agataccctg 1020 tggggcattc agaaagaact gcagtttggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 1080 ggcggcggca gcatgagttg ctataacgat gagtttaaag gtaaaaccct ggttattagc 1140 ggtggcaccc gcggtattgg tcgcgccatt gttctggaat ttgccaatgc aggtgcaaat 1200 attgcattca cttttaatag caacaaggaa atggccgaag aacaggcccg tgaactggaa 1260 aataagtttg gtattaaggc ccgcgcctat gcactgaata ttctggaacc ggaaagttat 1320 aaagaactgt ttctgcagat tgatgaagat tttgatcgtg tggatttctt tattagcaat 1380 gccattatta gcggccgtgc cgttgcaggc ggttatacca aattcatgaa actgaaaccg 1440 cgcggtatta ataatatttt taccgccacc gtgaatgcat ttgtttgcgg tacacaggaa 1500 gccgccaaac gtatggaaaa agttggtggt ggtagcgtta ttagtctgag cagtaccggc 1560 aatctggtgt atattgaaca ttatagcggc catggcaccg ccaaagcagc agtggaagcc 1620 atggcccgct atgcagcaac cgaactgggc gataaaaata ttcgtgttaa tgttgttagc 1680 ggcggtccga ttgaaaccga tgcactgcgt gcctttacca attatgaaga agtgcgcgat 1740 gcaaccgcag ccctgagccc gctgggtcgt atgggccagc cgaccgatct ggccggcgca 1800 tgtctgtttc tgtgtagcag caaagccagt tgggtgaccg gtcatacctt tattattgat 1860 ggtggcacca cctttaaata a 1881 <210> 10 <211> 626 <212> PRT <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 10 Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val 35 40 45 Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu 50 55 60 Leu Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met 65 70 75 80 Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser 85 90 95 Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr 100 105 110 Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln 115 120 125 Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr 130 135 140 Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu 145 150 155 160 Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile 165 170 175 Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly 180 185 190 Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly 195 200 205 Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Met Asn Val Ala 210 215 220 Gly Val Ser Leu Lys Thr Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Lys Asp 225 230 235 240 Lys Glu Gln Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr 245 250 255 Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser 260 265 270 Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His 275 280 285 Pro Val Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Asp Val 290 295 300 Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Leu 305 310 315 320 Val Lys Val Thr Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser 325 330 335 Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe Gly Gly Gly 340 345 350 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Cys Tyr 355 360 365 Asn Asp Glu Phe Lys Gly Lys Thr Leu Val Ile Ser Gly Gly Thr Arg 370 375 380 Gly Ile Gly Arg Ala Ile Val Leu Glu Phe Ala Asn Ala Gly Ala Asn 385 390 395 400 Ile Ala Phe Thr Phe Asn Ser Asn Lys Glu Met Ala Glu Glu Gln Ala 405 410 415 Arg Glu Leu Glu Asn Lys Phe Gly Ile Lys Ala Arg Ala Tyr Ala Leu 420 425 430 Asn Ile Leu Glu Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu Phe Leu Gln Ile Asp 435 440 445 Glu Asp Phe Asp Arg Val Asp Phe Phe Ile Ser Asn Ala Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Arg Ala Val Ala Gly Gly Tyr Thr Lys Phe Met Lys Leu Lys Pro 465 470 475 480 Arg Gly Ile Asn Asn Ile Phe Thr Ala Thr Val Asn Ala Phe Val Cys 485 490 495 Gly Thr Gln Glu Ala Ala Lys Arg Met Glu Lys Val Gly Gly Gly Ser 500 505 510 Val Ile Ser Leu Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Tyr Ile Glu His Tyr 515 520 525 Ser Gly His Gly Thr Ala Lys Ala Ala Val Glu Ala Met Ala Arg Tyr 530 535 540 Ala Ala Thr Glu Leu Gly Asp Lys Asn Ile Arg Val Asn Val Val Ser 545 550 555 560 Gly Gly Pro Ile Glu Thr Asp Ala Leu Arg Ala Phe Thr Asn Tyr Glu 565 570 575 Glu Val Arg Asp Ala Thr Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Arg Met Gly 580 585 590 Gln Pro Thr Asp Leu Ala Gly Ala Cys Leu Phe Leu Cys Ser Ser Lys 595 600 605 Ala Ser Trp Val Thr Gly His Thr Phe Ile Ile Asp Gly Gly Thr Thr 610 615 620 Phe Lys 625 <210> 11 <211> 1671 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 11 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgtacccg 60 gatctgaaag gcaaagttgt tgcaattacc ggtgccgcca gtggcctggg caaagccatg 120 gcaattcgtt ttggcaaaga acaggccaaa gtggttatta attattatag caacaagcag 180 gacccgaatg aagttaaaga agaagtgatt aaggccggtg gtgaagcagt tgttgttcag 240 ggtgacgtga ccaaagaaga agatgttaaa aatatcgtgc agaccgccat taaggaattt 300 ggcaccctgg atattatgat taataatgcc ggcctggaaa atccggttcc gagccatgaa 360 atgccgctga aagattggga taaagttatt ggcaccaatc tgaccggcgc atttctgggt 420 agtcgtgaag ccattaagta ttttgtggaa aatgatatta agggcaacgt tattaacatg 480 agcagcgtgc atgaagtgat tccgtggccg ctgtttgttc attatgcagc aagcaaaggt 540 ggtattaagc tgatgaccga aaccctggca ctggaatatg caccgaaagg tattcgcgtg 600 aataatattg gcccgggtgc cattaatacc ccgattaatg cagaaaaatt cgccgatccg 660 aaacagaaag cagatgtgga aagtatgatt ccgatgggct atattggtga accggaagaa 720 attgccgcag tggcagcatg gctggcaagc aaagaagcaa gctatgttac cggtattacc 780 ctgtttgcag atggcggtat gacccagtat ccgagctttc aggccggtcg tggtggcggc 840 ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca tgaacctgcg tgaaaaatac 900 ggtgaatggg gtctgatcct gggtgctacc gaaggtgttg gtaaagcttt ctgcgaaaaa 960 atcgctgctg gtggtatgaa cgttgttatg gttggtcgtc gtgaagaaaa actgaacgtt 1020 ctggctggtg aaatccgtga aacctacggt gttgaaacca aagttgttcg tgctgacttc 1080 tctcagccgg gtgctgctga aaccgttttc tgcgctaccg aaggtctgga catgggtttc 1140 atgtcttacg ttgcttgcct gcactctttc ggtaaaatcc aggacacccc gtgggaaaaa 1200 cacgaagcta tgatcaacgt taactgcgtt accttcctga aatgcttcca ccactacatg 1260 cgtatcttcg ctgctcagga ccgtggtgct gttatcaacg tttcttctat gaccggtatc 1320 tcttcttctc cgtggaacgg tcagtacggt gctggtaaag ctttcatcct gaaaatgacc 1380 gaagctgttg cttgcgaatg cgaaggtacc ggtgttgacg ttgaagttat caccctgggt 1440 accaccctga ccccgtctct gctgtctaac ctgccgggtg gtccgcaggg tgaagctgtt 1500 atgaaaatcg ctctgacccc ggaagaatgc gttgacgaag ctttcgaaaa actgggtaaa 1560 gaactgtctg ttatcgctgg tcagcgtaac aaagactctg ttcacgactg gaaagctaac 1620 cacaccgaag acgaatacat ccgttacatg ggttctttct accgtgacta a 1671 <210> 12 <211> 556 <212> PRT <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 12 Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala 20 25 30 Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln 35 40 45 Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu 50 55 60 Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln 65 70 75 80 Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu 100 105 110 Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys 115 120 125 Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala 130 135 140 Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met 145 150 155 160 Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu 180 185 190 Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile 195 200 205 Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala 210 215 220 Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu 225 230 235 240 Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val 245 250 255 Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser 260 265 270 Phe Gln Ala Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly 290 295 300 Leu Ile Leu Gly Ala Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys 305 310 315 320 Ile Ala Ala Gly Gly Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu 325 330 335 Lys Leu Asn Val Leu Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu 340 345 350 Thr Lys Val Val Arg Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr 355 360 365 Val Phe Cys Ala Thr Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val 370 375 380 Ala Cys Leu His Ser Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys 385 390 395 400 His Glu Ala Met Ile Asn Val Asn Cys Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe 405 410 415 His His Tyr Met Arg Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile 420 425 430 Asn Val Ser Ser Met Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln 435 440 445 Tyr Gly Ala Gly Lys Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala 450 455 460 Cys Glu Cys Glu Gly Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly 465 470 475 480 Thr Thr Leu Thr Pro Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln 485 490 495 Gly Glu Ala Val Met Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp 500 505 510 Glu Ala Phe Glu Lys Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln 515 520 525 Arg Asn Lys Asp Ser Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp 530 535 540 Glu Tyr Ile Arg Tyr Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp 545 550 555 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 13 cgggatccat gggcagcagc catcatca 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 14 cggaattctt atttaaaggt ggtgcca 27 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 15 ggaattccat atgggcagca gccatcatca 30 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 16 tccctcgagt taaaactgca gttctttct 29 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 17 cgggatccat gggcagcagc catcatca 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 18 cggaattctt agtcacggta gaaagaac 28 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 19 tccctcgagt taaccacgac cggcctgaaa gct 33 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 20 tccctcgagt tatttaaagg tggtgcca 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> 인공 시퀀스(Artificial Sequence) <400> 21 tccctcgagt tagtcacggt agaaagaac 29

Claims (20)

  1. 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법으로서, 유전자 코돈 최적화 단계, 엔지니어링 박테리아 구성 단계, 엔지니어링 박테리아 배양 단계, 기질 전환 및 생성물 제조 단계를 포함하고;
    이 때 상기 엔지니어링 박테리아는 발효에 의해 효소를 발현하고 발현된 효소는 기질을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환시키며;
    상기 기질은 타우로케노데옥시콜산이고, 상기 기질의 농도는 20g/L-250g/L이며;
    상기 엔지니어링 박테리아는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아, 및 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현시킬 수 있는 엔지니어링 박테리아를 포함하고,
    상기 기질 전환 단계는 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 정제된 또는 부분적으로 정제된 엔지니어링 박테리아 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하고, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 정제된 또는 부분적으로 정제된 엔지니어링 박테리아 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 상기 젖산 데히드로게나아제의 발현 효소는 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 단일 발현 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 젖산 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 효소로 이루어진 군에서 선택되는 것이며;
    상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 발현 효소는 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 단일 발현 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 쌍 4합체융합 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 포도당 데히드로게나아제 공동 발현 효소, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제 쌍 4합체 융합 효소와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 효소로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 DNA 서열은 SEQ ID NO:1이고, 젖산 데히드로게나아제의 DNA 서열은 SEQ ID NO:3이며, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 DNA 서열은 SEQ ID NO:5이고, 포도당 데히드로게나아제의 DNA 서열은 SEQ ID NO:7인 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제는 이의 단백질 서열 내의 A78 및 V116 사이트에서 돌연변이가 일어난 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:2이고, 상기 젖산 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:4이며, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:6이고, 상기 포도당 데히드로게나아제의 단백질 서열은 SEQ ID NO:8인 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 엔지니어링 박테리아 구성 단계는,
    유전자 발현 벡터를 구성하는 단계, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 유전자 발현 벡터를 각각 대장간균 BL21의 수용성 세포에 형질전환하여 엔지니어링 박테리아를 취득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 발현시키는 유전자를 7α-HSDH로 표기하고, 젖산 데히드로게나아제를 발현시키는 유전자를 LDH로 표기하며, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 발현시키는 유전자를 7β-HSDH로 표기하며, 포도당 데히드로게나아제를 발현시키는 유전자를 GDH로 표기하며; 상기 유전자 발현 벡터를 구성하는 단계는,
    7α-HSDH, LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH, pETDuet-1-LDH, pETDuet-1-7β-HSDH, pETDuet-1-GDH를 취득하는 단계; 또는
    7α-HSDH와 LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 이중 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH/LDH, pETDuet-1-7β-HSDH/GDH를 취득하는 단계; 또는
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH), pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)를 취득하는 단계; 또는
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH, pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH를 취득하는 단계; 또는
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH를 취득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 7α-HSDH는 캄필로박터 하이인테스틴날이스(Campylobacter hyointestinalis)(UniProt: CDQ67_02445)에서 유래한 것이고, 상기 LDH는 인간(Human)(UniProt: P00338)에서 유래한 것이며, 상기 7β-HSDH는 콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) ATCC 25986(UniProt: A4ECA9)에서 유래한 것이고, 상기 GDH는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(균주 168) (UniProt: P12310)에서 유래한 것임을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:9이고, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:11인 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자에 의해 암호화되는 단백질 서열은 SEQ ID NO:10이고, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자에 의해 암호화되는 단백질 서열은 SEQ ID NO:12인 것을 특징으로 하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 기질 전환의 단계는,
    타우로케노데옥시콜산을 20-100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.01-0.8mM NAD+를 첨가하며, 5-60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하며, 최종 체적까지 20-100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하며, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계; 및 1.8-100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하며, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하고, 25℃, 6-18h 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 타우로우루소데옥시콜산의 제조 단계는, 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 2-10배의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 생성된 혼합물을 원심 분리 또는 필터링하여 침전을 제거하고, 상청액을 건조시켜 타우로우루소데옥시콜산을 취득하며, 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 고성능 액체 제조 장치를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼에 주입하며; 그 후 서로 다른 농도의 메탄올-물 유동상으로 단계별 용리를 진행하고, 용리액을 수집하고 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는 것인, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법:
    (1) 유전자 코돈 최적화
    유전자 서열에 대하여 대장간균 발현 코돈 최적화를 진행하고, 친화 태그를 추가하며, 또한 전장 유전자 합성을 진행하는 단계로서, 여기서 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7α-HSDH로, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 LDH로, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7β-HSDH로, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 GDH로 각각 표기되는 것인 단계;
    (2) 엔지니어링 박테리아 구성
    유전자 발현 벡터를 구성하고, 구성하여 취득한 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 젖산 데히드로게나아제, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제의 유전자 발현 벡터를 대장간균 BL21의 수용성 세포에 형질전환시켜 엔지니어링 박테리아를 취득하는 단계;
    (3) 엔지니어링 박테리아 배양
    엔지니어링 박테리아를 소량 발효 및 발현시키는 단계로서: 엔지니어링 박테리아 균액을 암피실린 내성의 LB 플레이트에 도포하고, 단일 클론을 선택하여, 암파실린이 포함된 5mL의 LB 배지에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 배양을 진행하며, OD값이 0.8-1.2일 때, 1mM IPTG를 2h 동안 첨가하여 유도하고, SDS-PAGE로 발현량을 검사하고, 발현된 클론을 선택하여 균종 보존을 진행하며; 20μL의 균종을 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시키고, OD 값이 2.5-4.0일 때, 2mL 배양액을 취하여 암파실린 내성 배지에 접종시켜 배양시키고, OD 값이 1일 때, IPTG를 첨가하여 하루 밤 동안 발현을 유도하고, 균체를 수집하는 단계;를 포함하는 단계;
    엔지니어링 박테리아를 대량 발효 및 발현시키는 단계로서: 엔지니어링 박테리아를 선택하여 암파실린 내성 LB 배지의 1L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며, OD600값이 2.5-4.0일 때, 각각 20mL 배양액을 취하여 10개 1L 암파실린 내성 배지가 포함된 3L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며; 10L의 종자액을 200L의 대장간균 고밀도 발효 배지가 담긴 발효 탱크에 접종시키고, 기체를 통과시키고 가스를 통과시키면서 37℃에서 8시간 배양시킨 후, 발효 탱크에 최종 농도가 0.1mM인 IPTG 용액을 첨가하여 유도를 진행하고, 10-12h 유도 후 발효를 종료하고 액체를 배출하며, 원심 분리하여 균체를 수집하고 또한 4℃에서 보존하며, 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하는 단계;를 포함하는 단계;
    (4) 기질 전환
    타우로케노데옥시콜산을 20-100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.01-0.8mM NAD+를 첨가하며, 5-60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 최종 체적까지 20-100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하며, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계; 및 1.8-100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 세포 재현탁액을 첨가하며, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하고, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계;
    (5) 생성물 제조
    (4) 단계에서의 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 2-10배의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 원심 분리 또는 필터링으로 침전을 제거하고, 상청액을 건조시켜 타우로우루소데옥시콜산을 취득하며, 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 고성능 액체 제조 장치를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼에 주입하며; 그 후 서로 다른 농도의 메탄올-물 유동상으로 단계별 용리를 진행하고, 용리액을 수집하여 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유전자 발현 벡터를 구성하는 단계는 하기의 단계를 포함하는 것인, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법:
    7α-HSDH, LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH, pETDuet-1-LDH, pETDuet-1-7β-HSDH, pETDuet-1-GDH를 취득하는 단계; 또는
    7α-HSDH와 LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 이중 유전자 발현 벡터 pETDuet-1-7α-HSDH/LDH, pETDuet-1-7β-HSDH/GDH를 취득하는 단계; 또는
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH), pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)를 취득하는 단계; 또는
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH, pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH를 취득하는 단계; 또는
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, 각각 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH를 취득하는 단계.
  15. 제1항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:1이고, 상기 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:3이며, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:5이고, 상기 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:7인 것을 특징으로 하는 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 상기 젖산 데히드로게나아제, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 상기 포도당 데히드로게나아제는 독립적으로 액체 효소 또는 고정화 효소로부터 선택되고, 상기 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제, 상기 젖산 데히드로게나아제, 상기 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 상기 포도당 데히드로게나아제는 독립적으로 전세포, 정제를 거치지 않은 효소 또는 정제를 거친 효소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 생물 전환은 구체적으로 하기의 단계를 포함하는 것인, 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법:
    (1) 유전자 코돈 최적화
    유전자 서열에 대하여 대장간균 발현 코돈 최적화를 진행하고, 친화 태그를 추가하며, 또한 전장 유전자 합성을 진행하는 단계로서, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7α-HSDH로, 젖산 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 LDH로, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 7β-HSDH로, 포도당 데히드로게나아제를 암호화하는 유전자는 GDH로 각각 표기되는 것인 단계;
    (2) 단일 유전자 발현 벡터 구성
    7α-HSDH, LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-7α-HSDH, pETDuet-1-LDH, pETDuet-1-7β-HSDH, pETDuet-1-GDH를 취득하는 단계;
    (3) 이중 유전자 발현 벡터 구성
    7α-HSDH와 LDH, 7β-HSDH와 GDH를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-7α-HSDH/LDH, pETDuet-1-7β-HSDH/GDH를 취득하는 단계;
    (4) 단일 유전자 융합 단백질 발현 벡터 구성
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH), pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)를 취득하는 단계;
    (5) 단일 유전자 융합 단백질과 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 구성
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH, pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH를 취득하는 단계;
    (6) 단일 유전자 융합 단백질과 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 공동 발현 벡터 구성
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 젖산 데히드로게나아제 단일 유전자와 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 융합 포도당 데히드로게나아제 단일 유전자와 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 단일 유전자를 각각 pETDuet-1 벡터 중에 구성하여, pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH를 취득하는 단계;
    (7) 엔지니어링 박테리아 구성
    (2)-(6) 단계에서 구성한 모든 발현 벡터를 각각 대장간균 BL21(DE3)의 수용성 세포에 형질전환시켜 엔지니어링 박테리아를 취득하는 단계;
    (8) 엔지니어링 박테리아의 소량 발효 및 발현
    엔지니어링 박테리아 균액을 암피실린 내성의 LB 플레이트에 도포하고, 단일 클론을 선택하여, 암파실린이 포함된 5mL의 LB 배지에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 배양을 진행하며, OD값이 0.8-1.2일 때, 1mM IPTG를 첨가하여 2h 동안 유도하고, SDS-PAGE로 발현량을 검사하고, 발현된 클론을 선택하여 균종 보존을 진행하며; 20μL의 균종을 200mL의 암파실린 내성 LB 배지에 접종시켜 하루 밤 동안 배양시키고, OD 값이 2.5-4.0일 때, 2mL 배양액을 취하여 암파실린 내성 배지에 접종시켜 배양시키고, OD 값이 1일 때, IPTG를 첨가하여 하루 밤 동안 발현을 유도하고, 균체를 수집하는 단계;
    (9) 엔지니어링 박테리아의 대량 발효 및 발현
    엔지니어링 박테리아를 선택하여 암파실린 내성 LB 배지의 1L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 220rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며, OD600값이 2.5-4.0일 때, 각각 20mL 배양액을 취하여 10개 1L 암파실린 내성 배지가 포함된 3L 삼각플라스크에 접종시키고, 37℃에서, 140rpm으로 하루 밤 동안 배양시키며; 10L의 종자액을 200L의 대장간균 고밀도 발효 배지가 담긴 발효 탱크에 접종시키고, 기체를 통과시키고 가스를 통과시키면서 37℃에서 8시간 배양시킨 후, 발효 탱크에 최종 농도가 0.1mM인 IPTG 용액을 첨가하여 유도를 진행하고, 10-12h 동안 유도 후 발효를 종료하고 액체를 배출하며, 원심 분리하여 균체를 수집하고 또한 4℃에서 보존하며, 소량의 균체를 취하여 재차 100mM 인산염 완충액에 현탁시키고, 초음파로 파쇄시켜 조효소액을 취득하는 단계;
    (10) 효소 활성 측정
    7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 타우로우루소데옥시콜산을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.97mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 최종 농도가 0.5mM인 타우로우루소데옥시콜산, 10μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.5mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 증가를 측정하는 단계;
    젖산 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 피루브산 나트륨을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.7mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 0.2mL의 100mM 피루브산 나트륨, 50μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.2mM인 NADH를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 감소를 측정하는 단계;
    7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 타우로케노데옥시콜산을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.97mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 최종 농도가 0.5mM인 타우로케노데옥시콜산, 10μL의 희석 효소액, 최종 농도가 0.5mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 1min 동안 반응시키며, 340nm 위치에서 흡광값 증가를 측정하는 단계;
    포도당 데히드로게나아제의 효소 활성 측정 방법으로서: 포도당을 기질로 하여, 하나의 3mL의 반응계 중에 2.7mL의 100mM 인산 완충액(pH8.0), 0.2mL의 1.5M 포도당, 50μL의 희석 효소액, 최종 농도가 2mM인 NADP+를 첨가하고, pH8.0과 25℃에서 2min 동안 반응시키며, 340nm에서 흡광값 증가를 측정하는 단계;
    (11) 타우로케노데옥시콜산을 타우로우루소데옥시콜산으로 전환
    타우로케노데옥시콜산을 20-100mM 글리신 완충액에 용해시키고, 0.01-0.8mM NAD+를 첨가하며, 5-60g/L의 피루브산 나트륨을 첨가하고, 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 젖산 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하며, 최종 체적까지 20-100mM 글리신 완충액을 보충 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하며, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계; 및 1.8-100g/L의 포도당을 첨가하고, 7β-히드록시스테로이드 데히드로게나아제와 포도당 데히드로게나아제를 발현하는 것인 정제된 또는 부분적으로 정제된 대장간균 균체, 또는 이의 세포 용해액, 또는 이의 균체 재현탁액을 첨가하며, 수산화나트륨으로 pH를 6.5-8.5로 조정하고, 25℃에서, 6-18h 동안 반응시키는 단계;
    (12) 타우로우루소데옥시콜산의 제조
    (11) 단계에서의 전환 완성된 반응액을 페이스트 형태로 회전 증발시키고, 2-10배의 무수 에탄올 또는 95% 에탄올을 첨가하며, 원심 분리 또는 필터링으로 침전을 제거하고, 상청액을 건조시키면 타우로우루소데옥시콜산을 취득하며, 타우로우루소데옥시콜산 조생성물을 아세토니트릴을 사용하여 용해시키고, 0.22um 여과막으로 필터링시켜 불용성 물질을 제거하여 칼럼 공급 용액을 형성하며; 상기 칼럼 공급 용액을 제조형 고성능 액체 제조 장치를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피 필러가 장입된 고압 스테인리스 칼럼에 주입하며; 그 후 서로 다른 농도의 메탄올-물 유동상으로 단계별 용리를 진행하고, 수집된 용리액을 회전 증발기에 부어 걸쭉하게 될 때까지 회전 증발시키며, 아울러 메탄올을 회수하며; 그 후 진공 건조 오븐에 넣고 건조시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플 중의 타우로우루소데옥시콜산의 순도를 측정하는 것인 단계.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 타우로우루소데옥시콜산을 전환액 중에서 알칼리 분해를 진행하는 것을 포함하여 우루소데옥시콜산을 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 우루소데옥시콜산 제조 방법은 하기의 단계를 포함하는 것인, 우루소데옥시콜산을 제조하는 방법: 전환 생성된 타우로우루소데옥시콜산 용액 중에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 8-11로 조정하고, 80-100℃로 승온시켜 18-24h 동안 반응시키며, 10-15℃로 온도를 낮추고 염산을 첨가하여 pH를 3-5로 조정하여, 우루소데옥시콜산을 석출하는 단계.
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