CN115286678B - 一种生物转化牛磺熊去氧胆酸的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物转化牛磺熊去氧胆酸的纯化方法，属于生物化工分离技术领域。本发明将生物转化得到的牛磺熊去氧胆酸钠经醇沉、一步大孔树脂除杂，获得牛磺熊去氧胆酸钠的粗品，再经硅胶柱层析或者C18柱层析精制，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；然后经阳离子树脂转化，重结晶、干燥，最终获得高纯度的牛磺熊去氧胆酸成品。本发明可以有效除杂，获得熊去氧胆酸的纯化收率可以达到80％以上，得到的纯化后的牛磺熊去氧胆酸纯度在98.5％以上。本发明稳定可控、成本较低，可以满足使用禽胆粉进行生物转化制备牛磺熊去氧胆酸工艺的纯化需求，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物转化牛磺熊去氧胆酸的纯化方法，属于生物化工分离技术领域。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)是熊胆汁的主要有效成分，也是化药滔罗特(Taurolite)的药效成分，临床上主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发胆汁性肝硬化、胆汁郁积性肝病、慢性肝炎(乙肝、丙肝等)、酒精性脂肪肝。临床研究表明，牛磺熊去氧胆酸相比熊去氧胆酸，具有溶石速度更快，全溶率更高，且无明显不良反应的优势。
近年来，有关牛磺熊去氧胆酸的研究一直比较活跃，主要有化学合成法、提取法、生物酶转化法。化学合成法主要以熊去氧胆酸为原料，采用混合酸酐法、酰氯法、缩合剂法、活性硫酯法等来合成牛磺熊去氧胆酸，化学合成法因为步骤繁琐、收率低，且需要使用大量有机试剂，不利于分离纯化得到无毒害的产物。人工提取法主要从熊胆汁中提取牛磺熊去氧胆酸为主要途径，纯度不高，且不人道，也无法大规模生产。禽胆粉生物合成法，主要是利用禽胆粉中广泛存在的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)作为起始原料，直接以含7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的大肠杆菌菌体，通过生物酶转化获得TUDCA。该方法使用廉价易得的禽胆粉为原料，采用温和的酶发酵法，成本较低，对环境友好。但是该方法主要困难点在于禽胆粉中TCDCA主要以钠盐存在，且杂质较多，无法纯化获得高纯度的TUDCA。
专利CN107287272A披露了一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，是采用生物酶发酵禽胆粉，该专利着重于表达7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)基因的工程菌的构建，对发酵产物的纯化提及很少，终产品的纯度和得率问题都没有涉及。
专利CN1357551披露了一种牛磺熊去氧胆酸的禽胆制取法，是采用化学方法，从禽胆粉制备TUDCA-Na。该方法大量使用有机试剂，其中许多还是管制试剂，且终产品的纯度不高，得率也偏低。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有制备牛磺熊去氧胆酸的方法存在产物难纯化、纯度不高、得率低、成本高、污染环境的问题。
[技术方案]
本发明提供一种生物转化牛磺熊去氧胆酸的纯化方法，包括以下步骤：
(1)将分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶的重组菌的菌体作为转化用酶，催化禽胆粉，使得禽胆粉中的牛磺鹅去氧胆酸钠被转化为牛磺熊去氧胆酸钠；
催化反应结束后，将反应体系投入搅拌罐中，加入有机试剂并静置，离心，然后取上清液进行浓缩，将所得浓缩液泵入装填非极性多孔吸附树脂的树脂柱中，采用第一水溶性有机溶剂洗脱除杂，再用浓度高于第一水溶性有机溶剂的第二水溶性有机溶剂洗脱，收集第二水溶性有机溶剂的洗脱液，减压浓缩、干燥，获得牛磺熊去氧胆酸钠的粗品；
(2)硅胶层析柱纯化：将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品投入硅胶层析柱中，采用乙酸乙酯-甲醇或二氯甲烷-甲醇进行等度洗脱，收集高纯度牛磺熊去氧胆酸钠洗脱部位，浓缩至一定体积，析晶、过滤、干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；
或者，C18高压制备色谱纯化：将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品溶解后投入C18高压制备色谱仪中，采用第三水溶性有机溶剂洗脱除杂，采用浓度高于第三水溶性有机溶剂的第四水溶性有机溶剂富集目标物质，收集第四水溶性有机溶剂的洗脱部位，减压浓缩，干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；
(3)将高纯度牛磺熊去氧胆酸钠采用水溶解，然后经阳离子树脂吸附，水洗脱，将收集的水洗脱液浓缩，加入丙酮进行重结晶，过滤、干燥，最终获得高纯度的牛磺熊去氧胆酸成品。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述第一水溶性有机溶剂是乙醇水溶液或甲醇水溶液；所述第二水溶性有机溶剂是乙醇水溶液或甲醇水溶液。例如，第一水溶性有机溶剂是体积分数为5％-20％的乙醇水溶液或甲醇水溶液，第二水溶性有机溶剂是体积分数为30％-60％的乙醇水溶液或甲醇水溶液。
在本发明的一种实施方式中，包括以下步骤：
(1)将分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌的菌体作为转化用酶，来催化禽胆粉，使得禽胆粉中的牛磺鹅去氧胆酸钠被转化为牛磺熊去氧胆酸钠；
反应结束后，将反应体系投入搅拌罐中，加入反应体系6～8倍体积的有机试剂并静置2-4h，离心，然后取上清液浓缩至干物质含量为15％～30％，将所得浓缩液泵入装填非极性多孔吸附树脂的树脂柱中，采用体积分数为5％-20％的水溶性有机溶剂洗脱3倍柱体积除杂，再用体积分数为30％-60％的水溶性有机溶剂的洗脱，洗脱3倍柱体积，收集30％-60％水溶性有机溶剂的洗脱液，减压浓缩、干燥，获得牛磺熊去氧胆酸钠的粗品；
(2)硅胶层析柱纯化：将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品投入硅胶层析柱中，采用乙酸乙酯-甲醇或二氯甲烷-甲醇进行等度洗脱，收集高纯度牛磺熊去氧胆酸钠洗脱部位，浓缩至一定体积，析晶、过滤、干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；
或者，C18高压制备色谱纯化：将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品溶解后投入C18高压制备色谱中，采用体积百分数为10％-20％的水溶性有机溶剂洗脱除杂，采用体积百分数为30％-50％的水溶性有机溶剂富集目标物质，收集30％-50％水溶性有机溶剂洗脱部位，减压浓缩，干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；
所述高纯度牛磺熊去氧胆酸钠的牛磺熊去氧胆酸钠的纯度为95％～98％；
(3)将高纯度牛磺熊去氧胆酸钠采用水溶解，然后经阳离子树脂吸附，水洗脱至流出液pH值为6，停止洗脱，将收集的水洗脱液在80℃以下浓缩至一定体积，加入丙酮进行重结晶，过滤、干燥，最终获得高纯度的牛磺熊去氧胆酸成品；
所述高纯度的牛磺熊去氧胆酸成品的牛磺熊去氧胆酸的纯度为98.5％～99％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)、乳酸脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)、葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌的宿主是BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述禽胆粉与7α-HSDH酶菌体的质量比例是10:0.25；禽胆粉与乳酸脱氢酶菌体的质量比例是10:0.125；禽胆粉与7β-HSDH酶菌体的质量比例是10:5；禽胆粉与葡萄糖脱氢酶菌体的质量比例是10:1.25。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述催化禽胆粉是在25℃条件下进行12-18h时间。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述有机试剂为乙醇、甲醇或丙酮。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述有机试剂的添加倍数为反应体系体积的6倍。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述非极性多孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101、XAD、AB-8、HZ-03、H103、JK-1中的一种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述体积分数为5％-20％的水溶性有机溶剂是乙醇的水溶液，或甲醇的水溶液。所述体积分数为30％-60％的水溶性有机溶剂是乙醇的水溶液，或甲醇的水溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述干燥是80℃下真空干燥。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)硅胶层析柱纯化时，所述乙酸乙酯-甲醇是将乙酸乙酯、甲醇按照体积比(14:4)～(15:5)混合得到的。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)采用硅胶层析柱纯化时，所述二氯甲烷-甲醇是将二氯甲烷、甲醇按照体积比(20:3)～(20:6)混合得到的。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)采用C18高压制备色谱纯化时，所述体积百分数为10％-20％的水溶性有机溶剂是甲醇的水溶液，或乙醇的水溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)采用C18高压制备色谱纯化时，所述体积百分数为30％-50％的水溶性有机溶剂是甲醇的水溶液，或乙醇的水溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述阳离子树脂是强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂一种，如001*7、732或734等。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述水洗脱液的浓缩温度为80℃以下。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)加入丙酮进行重结晶时，浓缩液与丙酮的体积比例为(1:9)～(1:15)。
[有益效果]
1、本发明提供的一种生物转化牛磺熊去氧胆酸的纯化方法，起始原料是禽胆粉，一般是屠宰场弃去的废料，原料廉价易得。采用禽胆粉直接进行全细胞生物转化，克服了化学合成法以高纯度熊去氧胆酸为原料制备牛磺熊去氧胆酸所导致的试剂昂贵、综合成本高的问题(熊去氧胆酸本身也是一种原料药，合成成本较高)。
2、本发明对全细胞转化液静置、离心后，将上清液浓缩并采用大孔树脂进行分离纯化，可以高通量一步将牛磺熊去氧胆酸钠含量26％的全细胞反应液纯化为牛磺熊去氧胆酸钠含量80％以上的牛磺熊去氧胆酸钠粗品，回收率达80％以上，减轻后续纯化的处理量，降低了后续柱层析成本。同时水溶性有机溶剂可回收利用，节约试剂。
3、禽胆粉中的胆酸类杂质，以及全细胞反应液中大量的核酸、蛋白、无机盐离子等杂质，是后续纯化的难点。本发明方法采用硅胶柱层析，使用低毒试剂乙酸乙酯-甲醇或者二氯甲烷-甲醇体系，可将牛磺熊去氧胆酸钠粗品进一步纯化以获得牛磺熊去氧胆酸钠含量达到95％以上的牛磺熊去氧胆钠精品，回收率90％以上。
4、本发明以禽胆粉为原料，通常禽胆粉中的胆汁酸主要是钠盐，因此全细胞催化禽胆粉后的反应液经纯化得到的产物是牛磺熊去氧胆酸钠，但是，牛磺熊去氧胆酸才是工业需要的原料药。本发明采用阳离子树脂，将牛磺熊去氧胆酸钠转化成牛磺熊去氧胆酸，并通过重结晶，进一步将牛磺熊去氧胆酸的含量提高到98.5％以上，牛磺鹅去氧胆酸含量则小于0.5％。而其他以禽胆粉为原料的生物化学反应，包括部分纯化学合成反应，都只能获得牛磺熊去氧胆酸钠。
附图说明
图1牛磺熊去氧胆酸的HPLC图谱。
具体实施方式
以下实施例中所用的分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌，可以采用常规的重组大肠杆菌构建方法构建得到，例如从现有技术中选择编码酶的基因以大肠杆菌为宿主，采用常规的表达策略进行表达。
在实施例1～4及对比例中采用的重组大肠杆菌，参照CN109402212A披露的方法进行构建：用来源于Campylobacter hyointestinalis的7α-羟基类固醇脱氢酶基因构建重组表达质粒pETDuet-1-7α-HSDH；用来源于Human的乳酸脱氢酶基因构建重组表达质粒pETDuet-1-LDH；用来源于Collinsella aerofaciens ATCC 25986的7β-羟基类固醇脱氢酶基因的突变子构建重组表达质粒pETDuet-1-7β-HSDH；用来源于Bacillus subtilis 168的葡萄糖脱氢酶基因构建重组表达质粒pETDuet-1-GDH；将上述四种酶的重组表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，将筛选得到的阳性克隆进行发酵培养，使得酶在重组大肠杆菌中表达，发酵结束后，将四种重组大肠杆菌的发酵液分别离心，获得分别表达四种酶的重组大肠杆菌菌体，作为下述转化用全细胞菌体。
以下牛磺熊去氧胆酸钠、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸含量检测均采用HPLC外标法定量。以下牛磺熊去氧胆酸钠与牛磺熊去氧胆酸区分，采用药典(2020版)火焰光度法测定钠离子含量。
实施例1
(1)将900g鸡胆粉溶解于2.5L水中，加入NAD+至终浓度为0.25mM/L，加入丙酮酸钠至终浓度为60g/L，加入表达7α-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌菌体22.5g和表达乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体11.25g，补加水至4.5L，用5M/L NaOH调节pH至7.5，25℃，反应12h。加入葡萄糖至终浓度100g/L，加入表达7β-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体450g和表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌菌悬液112.5g，用5M/L NaOH调节pH至7.5。25℃，反应18h，获得牛磺熊去氧胆酸钠的反应物。
将前述反应体系投入搅拌罐中，加入6倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，在20℃下静置4h，离心，取上清液浓缩至干物质含量约25％，所得浓缩液的总质量约3600g；将D101树脂装入直径为15.9cm、高为168cm的层析柱中，装填体积为30L；在室温下，将浓缩液3600g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，用体积百分数为10％的乙醇水溶液，以3BV/h的流速洗脱3BV，除去水溶性和低极性杂质，再以体积百分数为30％的乙醇水溶液洗脱3BV，最后用1mol/L氢氧化钠溶液再生3BV，水洗至中性，完成一个纯化周期，待进入下个纯化周期；
将10％乙醇水溶液的洗脱液和30％乙醇水溶液的洗脱液分别浓缩，回收乙醇，烘干得到低纯度粗品41.5g和高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠242.2g，HPLC检测高纯粗品中牛磺熊去氧胆酸钠的含量为82.02％；
(2)将100g高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠用200ml甲醇溶解，加入200g硅胶，搅拌均匀，于60℃挥干除去溶剂，待用；将200-300目硅胶装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；在室温下，将含有熊去氧胆酸钠的硅胶装入层析柱上层，再用乙酸乙酯-甲醇(体积比14:4)进行等度洗脱10个柱体积，获得多个含有牛磺熊去氧胆酸钠的洗脱液，收集第5～10柱体积流出液，浓缩至原体积的80％，0-4℃析晶4-6h，过滤，滤饼80℃下真空干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠75.6g，HPLC检测含量为96.21％。
(3)合并两批(2)中获得的高纯度牛磺熊去氧胆酸钠样品，取150g，加入2倍体积水溶解，待用。将732阳离子树脂装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；将上样液450g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，水洗脱并收集洗脱液，待洗脱流出液pH值为6，停止洗脱。将收集的水洗脱液在80℃以下浓缩至250ml，加入丙酮22ml搅拌均匀，在-2～0℃重结晶24h，过滤，80℃以下真空干燥，最终获得牛磺熊去氧胆酸成品134.3g，HPLC检测含量为98.65％，牛磺鹅去氧胆酸含量0.41％，钠离子含量0.017％。
实施例2
(1)将1500g鸡胆粉溶解于4.2L水中，加入NAD+至终浓度为0.25mM/L，加入丙酮酸钠至终浓度60g/L，加入表达7α-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体37.5g和表达乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体18.75g，补加水至7.5L，用5M/L NaOH调节pH至7.5。25℃，反应12h。加入葡萄糖至终浓度100g/L，加入表达7β-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体750g和表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体187.5g，用5M/L NaOH调节pH至7.5。25℃，反应10h，获得牛磺熊去氧胆酸钠的反应物，投入搅拌罐中，加入6倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，在20℃下静置4h，离心，取上清液浓缩至干物质含量约30％，所得浓缩液的总质量约5000g；
将华HZ-03树脂装入直径为15.9cm、高为168cm的层析柱中，装填体积为30L；在室温下，将浓缩液5000g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，用体积百分数为7％的甲醇水溶液，以3BV/h的流速洗脱3BV，除去水溶性和低极性杂质，再以体积百分数为35％的甲醇水溶液洗脱3BV，最后用1mol/L氢氧化钠溶液再生3BV，水洗至中性，完成一个纯化周期，待进入下个纯化周期；将7％甲醇水溶液洗脱液和35％甲醇水溶液洗脱液分别浓缩，回收甲醇，烘干得到低纯度粗品80.4g和高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠417.5g，HPLC检测高纯粗品中牛磺熊去氧胆酸钠的含量为84.02％；
(2)将100g高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠用200ml甲醇溶解，加入200g硅胶，搅拌均匀，于60℃挥干除去溶剂，待用；将200-300目硅胶装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；在室温下，将含有熊去氧胆酸钠的硅胶装入层析柱上层，再用二氯甲烷-甲醇(体积比20:6)进行等度洗脱，获得多个含有牛磺熊去氧胆酸钠的洗脱液，收集含有高纯度牛磺熊去氧胆酸钠流出液，浓缩至原体积的82％，0-4℃析晶4-6h，过滤，滤饼80℃下真空干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠72.6g，HPLC检测含量为98.41％。
(3)合并三批(2)中获得的高纯度牛磺熊去氧胆酸钠样品，取200g，加入2倍体积水溶解，待用。将732阳离子树脂装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；将上样液450g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，水洗脱并收集洗脱液，待洗脱流出液pH值为6，停止洗脱。收集水洗脱液在80℃以下浓缩至300ml，加入丙酮20ml搅拌均匀，在-2～0℃重结晶24h，过滤，80℃以下真空干燥，最终获得牛磺熊去氧胆酸成品177.7g，HPLC检测含量为99.13％，牛磺鹅去氧胆酸含量0.49％，钠离子含量0.015％。
实施例3
(1)将2000g鸡胆粉溶解于5.6L水中，加入NAD+至终浓度为0.25mM/L，加入丙酮酸钠至终浓度为60g/L，加入表达7α-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体37.5g和表达乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体18.75g，补加水至10L，用5M/L NaOH调节pH至7.5。25℃，反应14h。加入葡萄糖至终浓度100g/L，加入表达7β-羟基类固醇脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体750g和表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌菌菌体187.5g，用5M/L NaOH调节pH至7.5。25℃，反应8h，获得牛磺熊去氧胆酸钠的反应物，投入搅拌罐中，加入6倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，在20℃下静置4h，离心，取上清液浓缩至干物质含量约35％，所得浓缩液的总质量约6000g；
将AB-8树脂装入直径为15.9cm、高为168cm的层析柱中，装填体积为30L；在室温下，将浓缩液6000g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，用体积百分数为7％的乙醇水溶液，以3BV/h的流速洗脱3BV，再以体积百分数为35％的乙醇水溶液洗脱3BV，最后用1mol/L氢氧化钠溶液再生3BV，水洗至中性，完成一个纯化周期，待进入下个纯化周期；
将7％乙醇洗脱液和35％乙醇洗脱液分别浓缩，回收乙醇，烘干得到低纯度粗品135.3g和高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠563.8g，HPLC检测高纯粗品中牛磺熊去氧胆酸钠的含量为83.42％；
(2)将100g高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠用200ml甲醇溶解，加入200g硅胶，搅拌均匀，于60℃挥干除去溶剂，待用；将200-300目硅胶装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；在室温下，将含有熊去氧胆酸钠的硅胶装入层析柱上层，再用乙酸乙酯-甲醇(体积比15:5)进行等度洗脱，获得多个含有牛磺熊去氧胆酸钠的洗脱液，收集含有高纯度牛磺熊去氧胆酸钠的流出液，浓缩至原体积的80％，0-4℃析晶6h，过滤，滤饼80℃下真空干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠74.6g，HPLC检测纯度为95.24％。
(3)合并四批(2)中获得的高纯度牛磺熊去氧胆酸钠样品，取高纯度牛磺熊去氧胆酸钠250g，加入2倍体积水溶解，待用。将732阳离子树脂装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；将上样液450g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，水洗脱并收集洗脱液，待洗脱流出液pH值为6，停止洗脱。收集水洗脱液在80℃以下浓缩至350ml，加入丙酮24ml搅拌均匀，在2～0℃重结晶24h，过滤，80℃以下真空干燥，最终获得牛磺熊去氧胆酸成品215.2g，HPLC检测含量为98.87％，牛磺鹅去氧胆酸含量0.32％，钠离子含量0.018％。
实施例4
(1)按照实施例2制备牛磺熊去氧胆酸钠转化物粗品5000g，将XAD树脂装入直径为15.9cm、高为168cm的层析柱中，装填体积为30L；在室温下，将浓缩液6000g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，用体积百分数为10％的甲醇水溶液，以3BV/h的流速洗脱3BV，再以体积百分数为50％的甲醇水溶液洗脱3BV，最后用1mol/L氢氧化钠溶液再生3BV，水洗至中性，完成一个纯化周期，待进入下一个纯化周期；将10％甲醇洗脱液和50％甲醇洗脱液分别浓缩，回收甲醇，烘干得到低纯度粗品80.4g和高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠417.5g，HPLC检测高纯粗品中牛磺熊去氧胆酸钠的纯度为84.02％；
(2)将100g高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠用2倍体积水溶解，待用；将C18填料装入直径为8cm，高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；在室温下，将上样液以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，用体积百分数为20％的甲醇溶液，以3BV/h的流速洗脱3BV，再以体积百分数为35％的甲醇洗脱3BV，最后用95％乙醇溶液再生3BV，完成一个纯化周期，待进入下个纯化周期；将35％甲醇洗脱液减压回收，溶液烘干得到高纯粗品牛磺熊去氧胆酸钠80.3g，HPLC检测含量为93.51％；
(3)合并三批(2)中获得的高纯度牛磺熊去氧胆酸钠样品，取200g，加入2倍体积水溶解，待用。将732阳离子树脂装入直径为8cm、高为80cm的层析柱中，装填体积为3000ml；将上样液450g以2BV/h流速上样至层析柱；上样完毕后，水洗脱并收集洗脱液，待洗脱流出液pH值为6，停止洗脱。收集水洗脱液在80℃以下浓缩至80ml，加入丙酮22ml搅拌均匀，在2～0℃重结晶24h，过滤，80℃以下真空干燥，最终获得牛磺熊去氧胆酸成品137.7g，HPLC检测含量为99.13％，牛磺鹅去氧胆酸含量0.45％，钠离子含量0.014％。
对比例1
具体实施方式参照实施例2，区别在于第一步纯化将HZ-03填料改成HZ818填料，其他步骤与实施例2一致。
最终获得牛磺熊去氧胆酸成品118.5g，相比实施例2获得牛磺熊去氧胆酸177.7g，产品得率降低明显。HPLC检测含量为98.6％，牛磺鹅去氧胆酸含量0.41％，钠离子含量0.016％。
对比例2
具体实施方式参照实施例2，区别在于最后一步过完离子交换树脂，不经过重结晶，洗脱液直接60℃以下减压浓缩后，于80℃真空干燥，最终获得牛磺熊去氧胆酸成品180.5g，HPLC检测含量为97.87％，牛磺鹅去氧胆酸含量0.51％，钠离子含量0.016％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.纯化生物转化所得牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶的重组菌的菌体作为转化用酶，催化禽胆粉，使得禽胆粉中的牛磺鹅去氧胆酸钠被转化为牛磺熊去氧胆酸钠；
催化反应结束后，将反应体系投入搅拌罐中，加入有机试剂并静置，离心，然后取上清液进行浓缩，将所得浓缩液泵入装填非极性多孔吸附树脂的树脂柱中，采用第一水溶性有机溶剂洗脱除杂，再用浓度高于第一水溶性有机溶剂的第二水溶性有机溶剂洗脱，收集第二水溶性有机溶剂的洗脱液，减压浓缩、干燥，获得牛磺熊去氧胆酸钠的粗品，所述非极性多孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101、XAD、AB-8、HZ-03、H103或JK-1中的一种；
(2)硅胶层析柱纯化：将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品投入硅胶层析柱中，采用乙酸乙酯-甲醇或二氯甲烷-甲醇进行等度洗脱，收集高纯度牛磺熊去氧胆酸钠洗脱部位，浓缩至一定体积，析晶、过滤、干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；
或者，C18高压制备色谱纯化：将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品溶解后投入C18高压制备色谱仪中，采用第三水溶性有机溶剂洗脱除杂，采用浓度高于第三水溶性有机溶剂的第四水溶性有机溶剂富集目标物质，收集第四水溶性有机溶剂的洗脱部位，减压浓缩，干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠；
(3)将高纯度牛磺熊去氧胆酸钠采用水溶解，然后经阳离子树脂吸附，水洗脱至流出液pH值为6，停止洗脱，将收集的水洗脱液在80℃以下浓缩至一定体积，加入丙酮进行重结晶，过滤、干燥，最终获得高纯度的牛磺熊去氧胆酸成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，催化反应结束后，将反应体系投入搅拌罐中，加入反应体系6～8倍体积的有机试剂并静置2-4h，离心，然后取上清液浓缩至干物质含量为15％～30％，将所得浓缩液泵入装填非极性多孔吸附树脂的树脂柱中，采用体积分数为5％-20％的第一水溶性有机溶剂洗脱除杂，再用体积分数为30％-60％的第二水溶性有机溶剂的洗脱，收集30％-60％水溶性有机溶剂的洗脱液，减压浓缩、干燥，获得牛磺熊去氧胆酸钠的粗品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述加入有机试剂并静置时采用的有机试剂为乙醇、甲醇或丙酮。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一水溶性有机溶剂是乙醇水溶液或甲醇水溶液；所述第二水溶性有机溶剂是乙醇水溶液或甲醇水溶液。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，C18高压制备色谱纯化，是将牛磺熊去氧胆酸钠的粗品溶解后投入C18高压制备色谱中，采用体积百分数为10％-20％的乙醇水溶液或甲醇水溶液洗脱除杂，采用体积百分数为30％-50％的乙醇水溶液或甲醇水溶液富集目标物质，收集30％-50％的乙醇水溶液或甲醇水溶液的洗脱部位，减压浓缩，干燥，获得高纯度牛磺熊去氧胆酸钠。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用硅胶层析柱纯化时，所述二氯甲烷-甲醇是将二氯甲烷、甲醇按照体积比(20:3)～(20:6)混合得到的，所述乙酸乙酯-甲醇是将乙酸乙酯、甲醇按照体积比(14:4)～(15:5)混合得到的。
7.根据权利要求1或2或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述阳离子树脂是强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌是重组大肠杆菌或重组枯草芽孢杆菌。
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