CN116283553A - 一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中提取3,4‑二羟基苯甲酸的方法，涉及3,4‑二羟基苯甲酸提取技术领域。该方法包括将含3,4‑二羟基苯甲酸的发酵液pH调节至5.0‑6.0；过滤获得清液；将清液通过模拟移动床色谱连续分离获得高纯度的提取液；其中，模拟移动床色谱为四区段SMB系统，四个区段依次串联，每个区段均包括2个及以上相同的色谱柱串联，色谱柱内的固定相为氢氧型弱碱性阴离子交换树脂D301；洗脱液为质量分数0.8‑1.2％的稀盐酸溶液；将提取液进行浓缩后结晶、固液分离即得3,4‑二羟基苯甲酸纯品。本申请实现对3,4‑二羟基苯甲酸的连续高效分离，节省了酸碱等原料试剂的消耗，可实现规模化，自动化的连续生产。

Description

一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法

技术领域

本发明涉及3,4-二羟基苯甲酸提取技术领域，具体而言，涉及一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法。

背景技术

3,4-二羟基苯甲酸，又名原儿茶酸，是一种重要的天然多酚类化合物，广泛存在于无梗五加、荭草、苦味叶下珠等常用中草药中。现代医学研究结果表明3,4-二羟基苯甲酸及其衍生物具有很高的生理活性价值，例如具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、提高心肌耐氧能力、减慢心率、抑菌、镇痛等药理活性，还具有抗氧化、抗肿瘤和神经保护作用，因此被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。

目前针对3,4-二羟基苯甲酸的工业化生产报道鲜有所闻，随着其市场需求量与日俱增，其生产方式也逐渐由传统植物提取发展为现代生物酶催化。前者的优势在于3,4-二羟基苯甲酸在自然资源中的广泛存在性，从含量丰富的中草药材中提取3,4-二羟基苯甲酸，极大地提高了相关药材的综合利用价值，例如CN107266308A公开了一种利用龙眼壳制备3,4-二羟基苯甲酸的工艺，CN104098465A公开了一种从滇桂艾纳香中提取3,4-二羟基苯甲酸的工艺，CN114573446A公开了一种从桑黄药材中制备3,4-二羟基苯甲酸的方法，但是植物资源的匮乏导致了以植物提取3,4-二羟基苯甲酸的工业规模化生产较难实现，且后期纯化工艺繁琐，需消耗较大量的有机试剂，对环境也存在较大的负面影响。后者以生物工程技术构建的工程菌为核心，将目标化合物在短期内大量转化为3,4-二羟基苯甲酸，极大程度解决了植物资源的限制性，为3,4-二羟基苯甲酸的提取来源提供了稳定保障，例如发明CN113717994A在大肠杆菌中导入quiC基因制备全细胞催化剂，并应用于富含3-脱氢莽草酸的发酵液中转化得到3,4-二羟基苯甲酸，由其公开数据可知，其全细胞转化液中3,4-二羟基苯甲酸的含量达到88.5g/L，这为3,4-二羟基苯甲酸的工业化生产奠定了重要的基础。但是细胞发酵过程与全细胞催化剂的引入导致转化液成分复杂，一定程度上加大了后端分离提取的难度，且3-脱氢莽草酸在有氧状态下容易被磷酸盐催化形成没食子酸，导致3,4-二羟基苯甲酸纯度不够，无法满足市场需求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，包括如下步骤：

将含有3,4-二羟基苯甲酸的发酵液的pH调节至5.0-6.0；

去除所述发酵液中的难溶性杂质和大分子物质获得清液；

将所述清液通过模拟移动床色谱连续分离，获得高纯度的提取液；其中，所述模拟移动床色谱为四区段SMB系统，四个所述区段依次串联，每个区段均包括2个及以上相同的色谱柱串联，所述色谱柱内的固定相为氢氧型弱碱性阴离子交换树脂D301；每个所述区段之间依次开设有进料口、提余液出口、洗脱液进口和提取液出口；所述清液从所述进料口进入，所述洗脱液从所述洗脱液进口进入，所述洗脱液为质量分数0.8-1.2％的稀盐酸溶液；所述进料口、所述提余液出口、所述洗脱液进口和所述提取液出口按照顺时针方向进行周期性切换直至所述清液进料结束；

将所述提取液进行浓缩后结晶，随后固液分离获得3,4-二羟基苯甲酸成品。

在可选的实施方式中，所述进料口的流速V1为0-100mL/min，所述提余液出口的流速V2为1-1000mL/min；所述洗脱液进口的流速V3为1-1000mL/min，所述提取液出口的流速V4为1-1000mL/min，所述周期性切换的切换时间为10-20min；

优选地，V3≥V2﹢V4﹣V1。

在可选的实施方式中，在所述清液从所述进料口进料之前，先设置所述洗脱液进口、所述提取液出口和所述提余液出口按照设定值运行20-40min。

在可选的实施方式中，在所述清液从所述进料口进料结束之后，还包括以纯水代替所述清液持续运行20-40min。

在可选的实施方式中，经所述模拟移动床色谱分离后，所述提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分含量为≥99.5％。

在可选的实施方式中，所述发酵液中所述3,4-二羟基苯甲酸的浓度为60-85g/L，纯度为95％-98％，所述发酵液的体系pH为5.0-9.0。

在可选的实施方式中，去除所述发酵液中的难溶性杂质和大分子物质获得清液包括：先采用陶瓷膜对所述发酵液进行分离以去除菌体等难溶性杂质，随后采用纳滤膜对滤液进行过滤，去除所述过滤清液中的可溶性蛋白、糖类、色素物质以及氧化成分等。

在可选的实施方式中，所述陶瓷膜的孔径为80-120nm，所述纳滤膜平均分子量为250-500Da。

在可选的实施方式中，对所述提取液进行浓缩后结晶，随后固液分离包括：先对所述提取液采用真空浓缩至质量分数为20％-30％，接着转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度小于等于15℃，随后固液分离并真空干燥。

在可选的实施方式中，所述真空浓缩时真空度不高于100pa，水浴温度90-100℃，物料温度不低于40℃。

本发明具有以下有益效果：

本申请提供的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，各步骤协同作用提高了3,4-二羟基苯甲酸的纯度，而且目标产物收率高。本发明中，模拟移动床色谱固定相为氢氧型弱碱性阴离子交换树脂D301，洗脱液为质量分数0.8-1.2％的稀盐酸溶液，能够初步分离成品与未转化完全的3-脱氢莽草酸以及其副产物(如没食子酸等)，同时起到将3,4-二羟基苯甲酸组分进行酸化的目的。

本发明方法实现了对3,4-二羟基苯甲酸的连续高效分离，节省了酸碱等原料试剂的消耗，有利于3,4-二羟基苯甲酸规模化，自动化的连续生产，极大提高了其工业生产效率，为其规模化的工业生产奠定了重要的理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请提供的模拟移动床色谱的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，包括如下步骤：

S1、发酵液。

本发明的发酵液中，3,4-二羟基苯甲酸的浓度为60-80g/L，液相纯度为95％至98％，发酵液的体系pH为5.0-9.0。

以大肠杆菌为工程菌种制得的含有3,4-二羟基苯甲酸的发酵液均可以作为本申请的发酵液，发酵液中3,4-二羟基苯甲酸的浓度为60-80g/L，纯度为95％至98％，发酵液的体系pH为5.0-9.0。其中，以大肠杆菌为工程菌种制得含有3,4-二羟基苯甲酸的发酵液的方法可参阅现有常规技术；比如可以针对发明CN113717994A中的发酵液进行提取，得到目标产物3,4-二羟基苯甲酸。

当然其他工程菌制得的含有3,4-二羟基苯甲酸的发酵液也可以作为本申请的发酵液。

S2、调节体系pH。

调节体系的pH调节至5.0-6.0，使体系处于弱酸性环境，3,4-二羟基苯甲酸结构中包含邻苯二酚的结构，其苯环上3位和4位的酚羟基在碱性条件下较易氧化或形成醌类物质，通过调节pH改变体系为弱酸性可保证其一定程度上稳定。

调节时采用酸或者碱进行调节，酸包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸等种类；碱包含但不限于氢氧化钠，其配制浓度为100-300g/L。

S3、过滤。

将发酵液中的难溶性杂质和大分子物质去除获得清液；本申请中依次通过陶瓷膜和纳滤膜对发酵液进行过滤，具体地，先采用孔径为80-120nm的陶瓷膜对发酵液进行分离以去除菌体，随后采用平均分子量为250-500Da的纳滤膜对滤液进行过滤，去除过滤清液中的可溶性蛋白、与生物催化所产生的色素物质以及少量的3,4-二羟基苯甲酸氧化成分，经研究发现，省略纳滤膜过滤的步骤后，会导致纯度偏低，颜色偏淡黄色。

S4、模拟移动床色谱连续分离。

将清液通过模拟移动床色谱连续分离，获得高纯度的提取液。

其中，请参阅图1，模拟移动床色谱为四区段SMB系统，四个区段依次串联，每个区段均包括2-4个相同的色谱柱串联，色谱柱内的固定相为氢氧型弱碱性阴离子交换树脂D301；每个区段之间依次开设有进料口、提余液出口、洗脱液进口和提取液出口；清液从进料口进入，洗脱液从洗脱液进口进入，洗脱液为质量分数0.8-1.2％的稀盐酸溶液；被酸化后的3,4-二羟基苯甲酸组分与盐类从提余液出口流出，其它杂质组分从提余液和提取液两个出口流出，进料口、提余液出口、洗脱液进口和提取液出口按照顺时针方向进行周期性切换直至清液进料结束。

进料口的流速V1为0-100mL/min，提余液出口的流速V2为1-1000mL/min；洗脱液进口的流速V3为1-1000mL/min，提取液出口的流速V4为1-1000mL/min，周期性切换的切换时间为10-20min；

优选地，V3≥V2﹢V4﹣V1。

在清液从进料口进料之前，先设置洗脱液进口、提取液出口和提余液出口按照设定值运行20-40min。

在清液从进料口进料结束之后，还包括以纯水代替清液持续运行20-40min。

经模拟移动床色谱分离后，提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分含量为99.5％-99.9％。

S5、浓缩、结晶、固液分离。

将提取液进行浓缩后结晶，随后固液分离获得3,4-二羟基苯甲酸成品。具体地，先对提取液采用真空浓缩至质量分数为20％-30％，真空浓缩时真空度不高于100pa，水浴温度90-100℃，物料温度不低于40℃。接着转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度小于等于15℃，随后固液分离并真空干燥。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其包括如下步骤：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为80g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，依次经孔径为100nm的陶瓷膜与平均分子量为250Da的纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.9％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为95％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，此过程中观察到大部分3,4-二羟基苯甲酸以较规则晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约722g，质量纯度为101.2％。通过HPLC检测其液相纯度为99.97％，成品回收率90.25％。

实施例2

本实施例提供了一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其包括如下步骤：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为60g/L，用浓盐酸将其pH调节至6.0，依次经孔径为100nm的陶瓷膜与平均分子量为250Da的纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为100mL/min，洗脱液流速1000mL/min，提取液流速500mL/min，提余液流速510mL/min，设定切换时间为10min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.85％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为97％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为20％，此过程中观察到大部分3,4-二羟基苯甲酸以较规则晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为10℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约549g，通过HPLC检测其液相纯度为99.90％，成品回收率91.5％，质量纯度为100.6％。

实施例3

本实施例提供了一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其包括如下步骤：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液20L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为82g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，依次经孔径为100nm的陶瓷膜与平均分子量为250Da的纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为100mL/min，洗脱液流速800mL/min，提取液流速450mL/min，提余液流速450mL/min，设定切换时间为10min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.89％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为96.5％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为30％，此过程中观察到大部分3,4-二羟基苯甲酸以较规则晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为10℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约1505g，通过HPLC检测其液相纯度为99.95％，质量纯度为100.8％，成品回收率91.76％。

实施例4

本实施例提供了一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其包括如下步骤：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液20L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为82g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，依次经孔径为120nm的陶瓷膜与平均分子量为500Da的纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为50mL/min，洗脱液流速500mL/min，提取液流速275mL/min，提余液流速300mL/min，设定切换时间为30min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.86％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为96.8％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为20％，此过程中观察到大部分3,4-二羟基苯甲酸以较规则晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为10℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约1488g，通过HPLC检测其液相纯度为99.93％，质量纯度为101.5％成品回收率90.73％。

对比例1

与本发明所设计方案相比，对比例1依次采用陶瓷膜分离，纳滤膜过滤，酸化结晶分离粗品，纯水复溶重结晶等工艺进行3,4-二羟基苯甲酸的分离提取，具体操作与实验结果如下：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液20L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为80g/L，经HPLC检测，其中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为98％，依次经陶瓷膜与纳滤膜过滤分离获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液后，使用浓盐酸调节其体系pH值至1.0，待3,4-二羟基苯甲酸近完全析出后，降低温度至15℃，通过固液分离获得3,4-二羟基苯甲酸的粗品若干。

按质量分数30％，使用纯水在80-100℃温度范围内将提取所获粗品完全溶解，之后在磁力搅拌以及水浴条件下，以5℃/h速率缓慢降温至15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约1288g，通过HPLC检测后，其液相纯度为99.20％，质量纯度为100.8％，成品回收率80.5％。

本对比例通过结晶与重结晶的方式获取了较高纯度的3,4-二羟基苯甲酸成品，相较本发明所设计方案，结果差异明显。由于未涉及柱层析过程对杂质的初次分离，所获3,4-二羟基苯甲酸质量与产品回收率均有较大差异，具体表现为成品液相纯度降低，成品回收率由90％左右显著降低至80％。

对比例2

与本发明所设计方案相比，对比例2采用单柱层析代替SMB色谱分离系统进行3,4-二羟基苯甲酸的分离提取，具体操作与实验结果如下：

取膜分离后的3,4-二羟基苯甲酸过滤清液1L备用，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为75g/L，经HPLC检测，其中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为95％。

取氢氧型弱碱性阴离子交换树脂D301若干，采取单柱装填的模式，树脂床体积为800mL。将3,4-二羟基苯甲酸过滤清液经层析柱由上至下，按1BV/h流速匀速缓慢穿出，通过HPLC检测穿出液中3,4-二羟基苯甲酸浓度发现，当穿出液为1L时，开始出现3,4-二羟基苯甲酸的检测信号。之后通过质量分数为1％的稀盐酸对被吸附的3,4-二羟基苯甲酸进行洗脱，洗脱速度2BV/h，洗脱体积4BV。收集洗脱液备用，通过HPLC检测3,4-二羟基苯甲酸的组分占比为99.95％，其总量回收率约为90％。

将上述洗脱液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，此过程中观察到大部分3,4-二羟基苯甲酸以较规则晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约62.5g，通过HPLC检测其液相纯度为99.98％，成品回收率83.3％。

本对比例通过单柱层析的方式对3,4-二羟基苯甲酸进行了分离提纯，并获得了纯度极高的3,4-二羟基苯甲酸成品，相较本发明所设计方案，两种方式均能获取高纯度的3,4-二羟基苯甲酸成品，其区别在于，使用单柱层析的树脂利用率大大降低，根据对比例2的实验结果可知，单位体积同型号树脂对3,4-二羟基苯甲酸的处理量约为93.75g每公斤湿树脂，而采用SMB色谱分离系统，根据实施例1-4的结果，其处理量至少可达到400g每公斤湿树脂，且单柱柱层析需消耗较大量的酸碱溶液来进行树脂再生与回收以满足后续的生产过程。

从结论上来看，SMB色谱分离一方面将树脂利用率最大化，减少了酸碱试剂的消耗，另一方面其连续工作的优势，极大保障了3,4-二羟基苯甲酸连续生成的可行性。

对比例3

与本发明所设计方案相比，对比例3中在进行膜分离前未调节体系pH值至弱酸性，其他实施方式与实施例1相同，具体操作与实验结果如下：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为80g/L，初始pH值8.2，依次经陶瓷膜与纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.85％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为94.8％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，无晶体析出，但是随着浓缩程度增加，晶体开始缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约751g，通过HPLC检测其液相纯度为99.93％，质量纯度为95.6％。3,4-二羟基苯甲酸净含量收率为89.75％，烘干后呈较浅的淡黄色。

由于未调节pH值，导致体系偏弱碱性，其邻苯二酚的结构在该条件下呈现一定程度的不稳定性，致使3,4-二羟基苯甲酸成品颜色变深。同时，由于原料液酸化程度不够，导致一部分3,4-二羟基苯甲酸仍以金属盐的形式存在，在浓缩结晶的过程中3,4-二羟基苯甲酸结晶时间延后，且最终产品回收率以及液相纯度、质量纯度降低。当加大酸洗液浓度后虽然酸化彻底，但是部分杂质被洗脱穿出，导致液相纯度与质量纯度偏低。

对比例4

与本发明所设计方案相比，对比例4中将模拟移动床填料更换为常规的十八烷基硅烷键合硅胶ODS为固定相，相应地更换洗脱剂为50％乙醇水溶液，其他实施方式与实施例1相同，具体操作与实验结果如下：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为78g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，依次经陶瓷膜与纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂为50％乙醇水溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.95％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为95.6％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至其中的乙醇溶剂完全挥发，再向其中缓慢滴加37％浓盐酸至体系pH值为3.0左右，继续真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，晶体开始缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约717.6g，通过HPLC检测其液相纯度为99.98％，质量纯度为100.5％。3,4-二羟基苯甲酸净含量收率为92％，烘干后呈纯白色晶体。

从最终结果来看，使用十八烷基硅烷键合硅胶ODS作为固定相，50％乙醇水溶液作为洗脱剂同样可获得纯度较高的3,4-二羟基苯甲酸成品。但是，十八烷基硅烷键合硅胶ODS填料成本较高，且洗脱相需要使用乙醇、甲醇等有机试剂，容易引起安全与环境方面的隐患，对于后端处理设备的投入与要求极高。而本发明中采用D301树脂作为固定相，1％浓度稀盐酸作为洗脱剂，一方面避免了有机试剂的引入，更加环保，而且大大降低了纯化设备的投入成本，另一方面D301树脂相较十八烷基硅烷键合硅胶ODS的原料成本更低，在本发明所述技术方案的基础上也可以获得同等质量水平的3,4-二羟基苯甲酸产品。

对比例5

与本发明所设计方案相比，本对比例5中未使用纳滤膜对陶瓷分离清液进行过滤分离，具体操作与实验结果如下：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为80g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，经陶瓷膜分离获得含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，3,4-二羟基苯甲酸陶瓷膜清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.71％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为96.5％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品，通过HPLC检测其液相纯度为99.85％，质量纯度为96.5％。3,4-二羟基苯甲酸净含量收率为91.67％，烘干后呈淡黄色晶体。

本对比例中去除纳滤膜过滤流程之后，对后续模拟移动床色谱分离结果影响较小，但是由于原料液中可溶性蛋白与生物催化色素无法通过其它工序被有效去除，导致最终成品的质量纯度偏低，晶体颜色变深为淡黄色。

对比例6

与本发明所设计方案相比，对比例6中将模拟移动床流程前置于陶瓷膜与纳滤膜分离之间，具体操作与实验结果如下：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为70g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，经陶瓷膜分离获得含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min，之后调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min，之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为98.0％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为96.2％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液通过纳滤膜过滤后，使用真空浓缩将其浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品，通过HPLC检测其液相纯度为99.1％，质量纯度为99.86％。3,4-二羟基苯甲酸净含量收率为91.5％，烘干后呈纯白色晶体。

本对比例中将模拟移动床分离步骤置于陶瓷膜与纳滤膜分离中间后，由于陶瓷膜分离清液中蛋白、盐等杂质较多，导致模拟移动床分离效果变差，相同条件下分离液中3,4-二羟基苯甲酸HPLC纯度变低，虽然结晶后产品质量纯度与颜色均达到标准要求(标准为结晶后产品质量纯度99.8％-102％，颜色为纯白色晶体)，但是所得3,4-二羟基苯甲酸结晶的液相纯度仅99.1％，无法满足生产需求(满足生产要求的液相纯度大于99.7％)。

对比例7

与本发明所设计方案相比，对比例7中模拟移动床也为8个色谱柱，但是每4个色谱柱形成一个SMB系统，共计进行2次SMB分离，具体操作与实验结果如下：

取3,4-二羟基苯甲酸发酵液10L，测定其中3,4-二羟基苯甲酸含量为80g/L，用浓盐酸将其pH调节至5.0，依次经孔径为100nm的陶瓷膜与平均分子量为250Da的纳滤膜过滤获取含有3,4-二羟基苯甲酸的过滤清液备用。

模拟移动床进料前，设定进料液流速为0，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速100mL/min，洗脱剂质量分数1％的稀盐酸溶液由洗脱液入口泵入系统，按设定值运行30min。

之后进行第一次SMB分离，调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，3,4-二羟基苯甲酸纳滤清液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min。

将提取液作为原料作为第二次SMB分离的进料液，调整进料速度为20mL/min，洗脱液流速200mL/min，提取液流速100mL/min，提余液流速120mL/min，设定切换时间为15min，提取液由进料入口泵入系统进料结束后以纯水代替料液持续运行30min。

之后通过高效液相色谱检测提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分纯度为99.65％，其中3,4-二羟基苯甲酸总量的回收率为92％，收集3,4-二羟基苯甲酸提取液备用。

将上述提取液真空浓缩至3,4-二羟基苯甲酸质量分数为25％，此过程中观察到大部分3,4-二羟基苯甲酸以较规则晶体缓慢析出，获取3,4-二羟基苯甲酸固液混合液后将其转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度为15℃，通过固液分离与真空干燥后得到3,4-二羟基苯甲酸成品约680.14g，质量纯度为100.8％。通过HPLC检测其液相纯度为99.97％，成品回收率85.17％。

将模拟移动床按对比例提供的方法拆分为2套SMB系统后，实验结果表明在达到相同实验结果的条件下，拆分后导致耗水量增加，最终色谱分离料液中3,4-二羟基苯甲酸的浓度被大幅度稀释，需要更多的能源和浓缩时间，从工业生产节约资源的角度来看，2套SMB系统导致设备投入和生产成本均大幅度增加。且拆分之后，3,4-二羟基苯甲酸的损失量随色谱分离次数增多而显著增大，导致最终成品回收率一定程度降低，仅为85.17％。

综上所述，本申请提供的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，采用模拟移动床色谱连续分离实现了对3,4-二羟基苯甲酸的连续高效分离，节省了酸碱等原料试剂的消耗，有利于3,4-二羟基苯甲酸规模化，自动化的连续生产，极大提高了其工业生产效率，为其规模化的工业生产奠定了重要的理论基础。本发明中，模拟移动色谱的作用为初步分离成品与未转化完全的3-脱氢莽草酸以及其副产物(如没食子酸等)，同时起到将3,4-二羟基苯甲酸组分进行酸化的目的。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将含有3,4-二羟基苯甲酸的发酵液的pH调节至5.0-6.0；

去除所述发酵液中的难溶性杂质和大分子物质获得清液；

将所述清液通过模拟移动床色谱连续分离，获得高纯度的提取液；其中，所述模拟移动床色谱为四区段SMB系统，四个所述区段依次串联，每个区段均包括2个及以上相同的色谱柱串联，所述色谱柱内的固定相为氢氧型弱碱性阴离子交换树脂D301；每个所述区段之间依次开设有进料口、提余液出口、洗脱液进口和提取液出口；所述清液从所述进料口进入，所述洗脱液从所述洗脱液进口进入，所述洗脱液为质量分数0.8-1.2％的稀盐酸溶液；所述进料口、所述提余液出口、所述洗脱液进口和所述提取液出口按照顺时针方向进行周期性切换直至所述清液进料结束；

将所述提取液进行浓缩后结晶，随后固液分离获得3,4-二羟基苯甲酸成品。

2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，所述进料口的流速V1为0-100mL/min，所述提余液出口的流速V2为1-1000mL/min；所述洗脱液进口的流速V3为1-1000mL/min，所述提取液出口的流速V4为1-1000mL/min，所述周期性切换的切换时间为10-20min；

优选地，V3≥V2﹢V4﹣V1。

3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，在所述清液从所述进料口进料之前，先设置所述洗脱液进口、所述提取液出口和所述提余液出口按照设定值运行20-40min。

4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，在所述清液从所述进料口进料结束之后，还包括以纯水代替所述清液持续运行20-40min。

5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，经所述模拟移动床色谱分离后，所述提取液中3,4-二羟基苯甲酸组分含量≥99.5％。

6.根据权利要求1-5任一项所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，所述发酵液中所述3,4-二羟基苯甲酸的浓度为60-85g/L，纯度为95％-98％，所述发酵液的体系pH为5.0-9.0。

7.根据权利要求1-5任一项所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，去除所述发酵液中的难溶性杂质和大分子物质获得清液包括：先采用陶瓷膜对所述发酵液进行分离，随后采用纳滤膜对滤液进行过滤。

8.根据权利要求7所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为80-120nm，所述纳滤膜平均分子量为250-500Da。

9.根据权利要求1-5任一项所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，对所述提取液进行浓缩后结晶，随后固液分离包括：先对所述提取液采用真空浓缩至质量分数为20％-30％，接着转移至结晶容器中，降温搅拌至料液温度小于等于15℃，随后固液分离并真空干燥。

10.根据权利要求9所述的从发酵液中提取3,4-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于，所述真空浓缩时真空度不高于100pa，水浴温度90-100℃，物料温度不低于40℃。

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