CN114213241B - 一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过对莽草酸发酵液调节pH值后，依次进行微滤、顶洗、浓缩、甲醇溶解提纯、脱色、冷冻结晶等步骤，得到莽草酸。所得莽草酸的纯度达到99％以上，含量达98.5％以上，提取收率达75％以上。本发明提供的提取方法不需要使用离子交换树脂，提取方法简单方便，对环境友好，且所得莽草酸的提取率和纯度均较高。

Description

一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法。

背景技术

莽草酸，化学名(3R,4S,5R)-(-)-3,4,5-三羟基-1-环己烯羧酸，成品外观表现为白色固体。莽草酸主要用于合成抗病毒药物达菲。莽草酸目前的主要生产途径为八角提取和微生物发酵。微生物发酵液中由于含有大量的盐分，莽草酸的提取过程需要多次上离子交换树脂柱除盐，由于树脂的再生需要用到大量的酸液和碱液，因此会产生大量的废水。

中国专利CN102584571A公开了一种发酵液中莽草酸的提取工艺中，发酵液通过陶瓷膜微滤，超滤膜超滤后，所得滤液用阴离子交换树脂交换吸附，接着用乙酸溶液洗脱，洗脱液再依次经浓缩、脱色、冷冻结晶、晶体洗涤和干燥后得莽草酸成品。该专利工艺需要使用阴离子树脂纯化莽草酸，由于莽草酸微滤液中含有大量的盐分，会导致树脂分离效率下降，树脂再生时需要用到大量的酸液和碱液，会产生大量的含盐废水，对环境不友好，而且该工艺整个流程比较复杂，生产操作不够简便。

中国专利CN109721487A公开了一种利用连续离子交换技术高效纯化莽草酸的工艺，将发酵液固液分离得到发酵滤液，发酵滤液再经过阳离子交换树脂预纯化得到预纯化液A；预纯化液A再经过连续离子交换系统进行预纯化得到预纯化液B；最后预纯化液B经过精纯和喷雾干燥得到莽草酸。该专利工艺需要由于使用连续离子交换系统，生产效率较高，但是该工艺会产生大量的含盐废水，对环境不友好，而且该工艺对工人和设备的要求较高，一般的企业不容易实现产业化生产。

上述公开的方案中均用到了离子交换树脂，莽草酸发酵液中含有的大量盐分会导致树脂分离效率下降，而树脂再生需要耗费大量的资源和能量，对换将不友好。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法，本发明提供的提取方法不需要使用离子交换树脂，提取方法简单方便，对环境友好，且所得莽草酸的提取率和纯度均较高。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法，包括以下步骤：

1)将莽草酸发酵液的pH值调节至4～5，进行微滤，得到微滤液和微滤浓缩液；

2)将所述步骤1)中得到的微滤浓缩液与第一顶洗液混合进行第一顶洗，得到第一顶洗滤液和第一顶洗浓缩液；

3)将所述步骤2)得到的第一顶洗浓缩液与第二顶洗液混合进行第二顶洗，得到低单位顶洗滤液和第二顶洗浓缩液；

4)将所述步骤1)中得到的微滤液与所述步骤2)得到的第一顶洗滤液混合，将所得混合液进行第一浓缩，得到第一固体；

5)将所述步骤4)得到的第一固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第二浓缩，得到第二固体；

6)将所述步骤5)得到的第二固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第三浓缩，得到第三固体；

7)将所述步骤6)得到的第三固液与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸粗品；

8)将所述步骤7)得到的莽草酸粗品与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸。

优选地，所述步骤1)中莽草酸发酵液中含有以下质量百分含量的组分：

优选地，所述步骤1)中微滤所用微滤膜的孔径为20～1000nm；所述微滤膜为陶瓷微滤膜、钛棒过滤器或中空纤维微滤膜。

优选地，所述微滤浓缩液的体积为发酵液体积的1/4～1/3。

优选地，所述步骤2)中的第一顶洗液和所述步骤3)中的第二顶洗液独立地为水或低单位顶洗滤液；所述第一顶洗液与微滤浓缩液的体积比为2～3:1；所述第二顶洗液与第一顶洗浓缩液的体积比为2～3：1。

优选地，所述步骤4)中第一浓缩的温度为60～100℃，第一浓缩的压力为-0.1～-0.8MPa。

优选地，所述步骤5)中混合的温度和所述步骤6)中混合的温度独立地为50～60℃。

优选地，所述步骤6)中混合的温度为50～80℃。

优选地，所述步骤7)中混合的温度为50～60℃。

优选地，所述步骤7)中的冷冻结晶温度和所述步骤8)中的冷冻结晶温度独立地为-10～-5℃。

有益技术效果：本发明提供了一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法，本发明通过对莽草酸发酵液调节pH值后，依次进行微滤、顶洗、浓缩、甲醇溶解提纯、脱色、冷冻结晶等步骤，得到莽草酸。所得莽草酸的纯度达到99％以上，含量达98.5％以上，提取收率达75％以上。本发明提供的提取方法不需要使用离子交换树脂，提取方法简单方便，对环境友好，且所得莽草酸的提取率和纯度均较高。

附图说明

图1：实施例1中所得莽草酸成品HPLC检测图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法，包括以下步骤：

1)将莽草酸发酵液的pH值调节至4～5，进行微滤，得到微滤液和微滤浓缩液；

2)将所述步骤1)中得到的微滤浓缩液与第一顶洗液混合进行第一顶洗，得到第一顶洗滤液和第一顶洗浓缩液；

3)将所述步骤2)得到的第一顶洗浓缩液与第二顶洗液混合进行第二顶洗，得到低单位顶洗滤液和第二顶洗浓缩液；

4)将所述步骤1)中得到的微滤液与所述步骤2)得到的第一顶洗滤液混合，将所得混合液进行第一浓缩，得到第一固体；

5)将所述步骤4)得到的第一固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第二浓缩，得到第二固体；

6)将所述步骤5)得到的第二固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第三浓缩，得到第三固体；

7)将所述步骤6)得到的第三固液与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸粗品；

8)将所述步骤7)得到的莽草酸粗品与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸。

本发明将莽草酸发酵液的pH值调节至4～5，进行微滤，得到微滤液和微滤浓缩液。

在本发明中，所述莽草酸发酵液中优选含有以下质量百分含量的组分：

在本发明中，所述pH值调节剂优选为硫酸、盐酸或醋酸；所述微滤所用微滤膜的孔径优选为20～1000nm，更优选为50～500nm，最优选为100～250nm；所述微滤膜为陶瓷微滤膜、钛棒过滤器或中空纤维微滤膜。本发明通过微滤祛除莽草酸发酵液中菌丝体和不溶物颗微粒。

在本发明中，所述微滤浓缩液的体积优选为发酵液体积的1/4～1/3。

得到微滤液和微滤浓缩液后，本发明将得到的微滤浓缩液与第一顶洗液混合进行第一顶洗，得到第一顶洗滤液和第一顶洗浓缩液。

在本发明中，所述第一顶洗液优选为水或低单位顶洗滤液，所述第一顶洗液与微滤浓缩液的体积比为2～3:1。本发明通过顶洗提高滤液中莽草酸的含量，从而提高收率。

得到第一顶洗滤液和第一顶洗浓缩液后，本发明将得到的第一顶洗浓缩液与第二顶洗液混合进行第二顶洗，得到低单位顶洗滤液和第二顶洗浓缩液。

在本发明中，所述第二顶洗液优选为水或低单位顶洗滤液；所述第二顶洗液与第一顶洗浓缩液的体积比优选为1～3：1，更优选为1.5～2.5：1；所述低单位顶洗滤液可作为第一顶洗液和第二顶洗液套用，目的在于提高收率，同时减少含有低浓度莽草酸的微滤液，降低提取成本；所述第二顶洗浓缩液排至污水处理部分处理。

本发明将上述得到的微滤液与第一顶洗滤液混合，将所得混合液进行第一浓缩，得到第一固体。

在本发明中，所述第一浓缩优选采用多效浓缩器或高效浓缩器将所得混合液浓缩至粘稠状，再用反应釜浓缩至干。

在本发明中，所述第一浓缩的温度优选为60～100℃，更优选为70～80℃；所述第一浓缩的压强优选为-0.1～-0.8MPa，更优选为-0.3～-0.5MPa。本发明通过第一浓缩除去水分。

得到第一固体后，本发明将得到的第一固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第二浓缩，得到第二固体。

在本发明中，所述第一固体与甲醇混合的温度优选为40～60℃，更优选为45～55℃，最优选为50℃；所述甲醇与第一固体的体积比优选为5～10:1，更优选为7～8:1；所述第二浓缩的温度优选为60～70，更优选为65～70。本发明所述甲醇对盐分的溶解度较小，通过甲醇对第一固体进行溶解，使大部分的盐分保留在滤渣中，从而除去莽草酸发酵液中的大部分废盐。

得到第一固体后，本发明将得到的第二固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第三浓缩，得到第三固体。

在本发明中，所述第二固体与甲醇混合的温度优选为40～60℃，更优选为55℃；所述甲醇与第二固体的的体积比优选为5～10:1，更优选为7～8:1；所述第三浓缩的温度优选为60～70，更优选为65～70。本发明通过甲醇再次溶解第二固体，进一步除去莽草酸发酵液中的盐分。

得到第三固体后，本发明将到的第三固液与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸粗品。

在本发明中，所述第三固液与水混合的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃，最优选为65℃；所述第三固体与水的体积比优选为1:3～5，更优选为1:4。

在本发明中，所述脱色优选为将所述混合液与活性炭混合进行脱色，将所得脱色后的混合液过滤，得到脱色后的滤液。在本发明中，所述脱色的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃，最优选为65℃；所述活性炭的重量优选为第三固体重量的0.5～4％，更优选为1～3％。

在本发明中，所述冷冻结晶优选为将脱色后的滤液浓缩至粘稠状，将所得粘稠物与甲醇混合后冷冻结晶，得到莽草酸粗品。

在本发明中，所述甲醇体积优选为粘稠物体积的5～10倍，更优选为6～8倍；所述混合的温度优选为50～60℃，更优选为55℃；所述冷冻结晶的温度优选为-10～-5℃，更优选为-8℃。

在本发明中，所述冷冻结晶后还包括固液分离，所述固液分离的方法优选为离心或过滤。在本发明中所述粗品结晶母液脱色后套用至下一批的微滤液，套用3～5次后作为废液排掉。

得到莽草酸粗品后，本发明将得到的莽草酸粗品与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸。

在本发明中，所述莽草酸粗品与水混合的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃，最优选为65℃；所莽草酸粗品与水的体积比优选为1:3～5，更优选为1:4。

在本发明中，所述脱色优选为将所述混合液与活性炭混合进行脱色，将所得脱色后的混合液过滤，得到脱色后的滤液。在本发明中，所述脱色的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃，最优选为65℃；所述活性炭的重量优选为莽草酸粗品重量的0.5～4％，更优选为1～3％。

在本发明中，所述冷冻结晶优选为将脱色后的滤液浓缩至粘稠状，将所得粘稠物与甲醇混合后调节pH值至2～3冷冻结晶，得到莽草酸。

在本发明中，所述甲醇的用量优选为粘稠物体积的3～5倍，更优为4倍；所述混合的温度优选为50～60℃，更优选为55℃；所述pH值调节剂优选为盐酸、硫酸或醋酸；所述冷冻结晶的温度优选为-10～-5℃，更优选为-8℃。

在本发明中，所述冷冻结晶后还依次包括固液分离和干燥。

在本发明中，所述固液分离优选为离心或过滤；所述干燥的温度优选为真空干燥，所述真空干燥的温度优选为50～80℃，更优选为60～70℃；所述真空干燥的真空度优选为-0.1～-0.8MPa，更优选为-0.3～-0.5Mpa。

在本发明中，所述莽草酸结晶母液脱色后套用至下一批的微滤液，母液套用3～5次后作为废液排掉。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

1)取莽草酸发酵液30L，用硫酸调pH至4，陶瓷膜微滤后得到莽草酸滤液20L和微滤浓缩液10L；

上述用到的莽草酸通过大肠杆菌发酵得到，发酵液中含有1％氯化钠、0.5％磷酸二氢钾、0.5％磷酸氢二钾、0.7％硫酸镁、7～8％莽草酸、各种色素和有机杂质；

2)加入20L饮用水顶洗陶瓷膜微滤浓缩液，得到20L顶洗滤液和10L顶洗浓缩液；

3)继续用20L饮用水顶洗步骤2)中的顶洗浓缩液，得到20L低单位顶洗滤液和顶洗浓缩液；

4)合并步骤1)中的莽草酸滤液和步骤2)中的顶洗滤液，采用多效浓缩器浓缩至粘稠状，再将所得粘稠物置于减压浓缩反应釜中浓缩至干，得到496g固体；

5)在步骤4)中得到的固体中加入4.5L甲醇，加热至50℃搅拌溶解，过滤得滤液，再用350mL甲醇淋洗滤饼，得滤液，将滤液合并浓缩至干，得到318g固体；

6)在步骤5)得到的固体中再次加入4.5L甲醇，加热至50℃搅拌溶解，过滤得滤液，再用350mL甲醇淋洗滤饼，得滤液，将滤液合并浓缩至干，得到302g固体；

7)在步骤6)得到的固体中加入1000mL饮用水，加热至50℃搅拌溶解，加入5g活性炭脱色，过滤得脱色液，脱色液浓缩至400mL左右时，加入3200mL甲醇，加热搅拌15min后，冷却至-5℃结晶，离心得到295g莽草酸粗品；

8)步骤7)中得到的莽草酸粗品用1200mL纯化水溶解后，加入4g活性炭脱色，过滤得脱色液，脱色液浓缩至400mL左右时，加入3200mL甲醇，加入醋酸将pH调至2.5，加热搅拌15min后，冷却至-5℃结晶，离心、干燥得到237g莽草酸成品。结晶母液作为套用液待用。

采用HPLC对所得莽草酸成品进行检测，高效液相色谱的色谱条件如下：

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：C18色谱柱，5μm，250×4.6mm

流动相：乙腈-1％醋酸水溶液＝5：95(V/V)

流速：0.8ml/min

检测波长：213nm

柱温：30℃

采用HPLC对所得莽草酸成品进行检测如图1和表1所示

表1实施例1中采用HPLC对所得莽草酸成品进行检测的结果

由上述检测结果可知，莽草酸成品的纯度为99.6％；

按照HPLC方法对上述得到的莽草酸成品进行检测，根据与已知含量的标准品进行对照可知莽草酸成品中莽草酸的含量为99.2％(折干)；

由成品与发酵液效价计算其收率，可知其收率为71.8％。

实施例2

1)取莽草酸发酵液30L，用硫酸调pH至4，陶瓷膜微滤后得到莽草酸滤液20L和微滤浓缩液10L；

上述用到的莽草酸通过大肠杆菌发酵得到，发酵液中含有1％氯化钠、0.5％磷酸二氢钾、0.5％磷酸氢二钾、0.7％硫酸镁、7～8％莽草酸、各种色素和有机杂质；

2)加入实施例1步骤3)中得到的低单位顶洗滤液20L顶洗陶瓷膜微滤的浓缩液，得到20L顶洗滤液和顶洗浓缩液；

3)继续用饮用水顶洗步骤2)中的顶洗浓缩液，得到低单位顶洗滤液和顶洗浓缩液；

4)合并步骤1)得到的莽草酸滤液和步骤2)得到的顶洗滤液采用多效浓缩器浓缩至粘稠状，再将所得粘稠物置于减压浓缩反应釜中浓缩至干，得到得到522g固体；

5)在步骤4)中得到的固体中加入5L甲醇，加热至50℃搅拌溶解，过滤得滤液，再用500mL甲醇淋洗滤饼，将滤液浓缩至干，得到374g固体；

6)在步骤5)得到的固体中再加入3.7L甲醇，加热至50℃搅拌溶解，过滤得滤液，再用350mL甲醇淋洗滤饼，将滤液浓缩至干，得到337g固体；

7)在步骤6)得到的固体中加入1100mL饮用水，加热至50℃搅拌溶解，加入5g活性炭脱色，过滤得脱色液，脱色液浓缩至400mL左右时，加入3200mL甲醇，加热搅拌15min后，冷却至-5℃结晶，离心得到316g莽草酸粗品；

8)在步骤7)得到的莽草酸粗品中加入1200mL纯化水溶解后，加入4g活性炭脱色，过滤得脱色液，脱色液浓缩至400mL左右时，加入3200mL甲醇，加入醋酸将pH调至2.5，加热搅拌15min后，冷却至-5℃结晶，离心、干燥后得到251g莽草酸成品，结晶母液作为套用液待用。按照实施例1中的检测和技术方法，可知所得莽草酸成品的纯度为99.2％，含量为99.1％，提取收率为70.5％。

实施例3

1)取莽草酸发酵液65L，用硫酸调pH至4，陶瓷膜微滤后得到莽草酸滤液47L和微滤浓缩液18L；

上述用到的莽草酸通过大肠杆菌发酵得到，发酵液中含有1％氯化钠、0.5％磷酸二氢钾、0.5％磷酸氢二钾、0.7％硫酸镁、7～8％莽草酸、各种色素和有机杂质；

2)加入实施例1步骤3)中得到的低单位顶洗滤液40L顶洗陶瓷膜微滤的浓缩液，得到40L顶洗滤液和顶洗浓缩液；

3)继续用饮用水顶洗步骤2)中的顶洗浓缩液，得到低单位顶洗滤液和顶洗浓缩液；

4)合并步骤1)得到的莽草酸滤液和步骤2)得到的顶洗滤液采用多效浓缩器浓缩至粘稠状，再将所得粘稠物置于减压浓缩反应釜中浓缩至干，得到得到812g固体；

5)在步骤4)中得到的固体中加入7L甲醇，加热至50℃搅拌溶解，过滤得滤液，再用1000mL甲醇淋洗滤饼，将滤液浓缩至干，得到724g固体；

6)在步骤5)得到的固体中再加入4.5L甲醇，加热至50℃搅拌溶解，过滤得滤液，再用600mL甲醇淋洗滤饼，将滤液浓缩至干，得到657g固体；

7)在步骤6)得到的固体中加入2400mL饮用水，加热至50℃搅拌溶解，加入15g活性炭脱色，过滤得脱色液，脱色液浓缩至800mL左右时，加入7000mL甲醇，加热搅拌15min后，冷却至-5℃结晶，离心得到602g莽草酸粗品；

8)在步骤7)得到的莽草酸粗品中加入2500mL纯化水溶解后，加入8g活性炭脱色，过滤得脱色液，脱色液浓缩至700mL左右时，加入6000mL甲醇，加入醋酸将pH调至2.5，加热搅拌15min后，冷却至-5℃结晶，离心、干燥后得到568g莽草酸成品，结晶母液作为套用液待用。按照实施例1中的检测和技术方法，可知所得莽草酸成品的纯度为99.4％，含量为99.2％，提取收率为73.6％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从莽草酸发酵液中提取莽草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将莽草酸发酵液的pH值调节至4～5，进行微滤，得到微滤液和微滤浓缩液；

2)将所述步骤1)中得到的微滤浓缩液与第一顶洗液混合进行第一顶洗，得到第一顶洗滤液和第一顶洗浓缩液；

3)将所述步骤2)得到的第一顶洗浓缩液与第二顶洗液混合进行第二顶洗，得到低单位顶洗滤液和第二顶洗浓缩液；

4)将所述步骤1)中得到的微滤液与所述步骤2)得到的第一顶洗滤液混合，将所得混合液进行第一浓缩，得到第一固体；

5)将所述步骤4)得到的第一固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第二浓缩，得到第二固体；

6)将所述步骤5)得到的第二固体与甲醇混合后过滤，将所得滤液进行第三浓缩，得到第三固体；

7)将所述步骤6)得到的第三固体与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸粗品；

8)将所述步骤7)得到的莽草酸粗品与水混合，将所得混合液依次进行脱色、冷冻结晶，得到莽草酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中莽草酸发酵液中含有以下质量百分含量的组分：

莽草酸 7～8％；

氯化钠 0.5～1.5％；

磷酸二氢钾 0.2～1％；

磷酸氢二钾 0.5～1.5％；

色素 0.3～2％；

有机杂质 0.5～1.5％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中微滤所用微滤膜的孔径为100～1000nm；所述微滤膜为陶瓷微滤膜、钛棒过滤器或中空纤维微滤膜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中微滤浓缩液的体积为发酵液体积的1/4～1/3。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的第一顶洗液和所述步骤3)中的第二顶洗液独立地为水或低单位顶洗滤液；所述第一顶洗液与微滤浓缩液的体积比为2～3:1；所述第二顶洗液与第一顶洗浓缩液的体积比为2～3：1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中第一浓缩的温度为60～100℃，第一浓缩的压力为-0.1MPa。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中混合的温度和所述步骤6)中混合的温度独立地为50～60℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)中混合的温度为50～80℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤7)中混合的温度为50～60℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤7)中的冷冻结晶温度和所述步骤8)中的冷冻结晶温度独立地为-10～-5℃。