CN117050021B - 一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，所述方法包括：利用无机膜分离系统去除发酵液中的菌体、部分蛋白和色素，收集过滤液，将所述过滤液浓缩至四氢嘧啶浓度为100‑160g/L后，采用离子交换树脂吸附四氢嘧啶，解脱后得到四氢嘧啶洗脱液，所述四氢嘧啶洗脱液依次经过活性炭脱色、浓缩、结晶、重结晶，得到纯度99%以上的四氢嘧啶；其中，所述无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，其孔径为30‑80nm。本发明的提取方法节能环保，两次结晶纯度可以达到99%以上，操作简单且有效提高了产品纯度，克服现有生产工艺中存在的工艺路线复杂，能耗较多等问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法。
背景技术
四氢嘧啶（Ectoine, 1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸），其分子式为C6H10N2O2，是一种天然的氨基酸衍生物。它最早被Galinski等于1985年在外硫红螺菌属的光合紫细菌中发现，其分子结构上具有的一个氨基和一个羧基使其具有氨基酸的两性性质，分子表面电荷分布密集，具有很强的水分子络合能力。在高温高压、冷冻干燥和辐射等不利环境下，对细胞、蛋白质、酶和核酸的结构与功能起到保护作用。所以，近年来四氢嘧啶在生物保护、化妆品、酶工业、新能源应用及生物医药等领域的市场前景非常广阔。
CN115417822A公开了一种四氢嘧啶的提取纯化工艺，具体包括：首先将含四氢嘧啶发酵液离心除菌，获得清液，调pH后用大孔吸附树脂吸附脱色，再经离子交换树脂吸附，碱液洗脱后，经过浓缩、调酸、大孔吸附树脂吸附二次脱色、浓缩、结晶、离心、干燥等步骤得到四氢嘧啶成品。此种方法虽然成品的收率和纯度较高，但操作工艺复杂，前后需要过三次树脂柱，费时费力，大量生产成本较高。
CN105669560A公开了一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，该方法需采用双膜系统去除发酵液中的菌体、蛋白和色素，并采用醇沉结晶，工艺复杂，能耗较高，且醇沉结晶限制了四氢嘧啶的纯度，得不到99%以上的四氢嘧啶成品。
因此，本发明旨在提供一种工艺简单易行、分离成本低、成品纯度更高、设备投资更少、易于实现大规模生产的提取四氢嘧啶的方法。
发明内容
本发明提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，用以解决现有技术中工艺复杂、能耗高等缺陷，实现低成本、简单易行地大规模生产高纯度的四氢嘧啶。
本发明提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，包括：
利用无机膜分离系统去除发酵液中的菌体、部分蛋白和色素，收集过滤液，将所述过滤液浓缩至四氢嘧啶浓度为100-160g/L后，采用离子交换树脂吸附四氢嘧啶，解脱后得到四氢嘧啶洗脱液，所述四氢嘧啶洗脱液依次经过活性炭脱色、浓缩、结晶、重结晶，得到纯度99%以上的四氢嘧啶；
其中，所述无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，其孔径为30-80nm。
现有技术中，通常采用双膜系统去除发酵液中的菌体、蛋白和色素，即采用微滤膜和超滤膜的组合，或者是微滤膜和纳滤膜的组合。采用双膜系统明显工序复杂，且膜容易被堵塞，减少使用寿命，即增加成本。而本发明前期只采用一道特定孔径和材质的无机膜，可以有效去除发酵液中的菌体以及部分蛋白和色素，后续通过离子交换和脱色步骤可将蛋白和色素进一步去除，并通过结晶和重结晶步骤提高纯度。综合而言，本发明采用的膜系统处理发酵液，操作工艺简单，四氢嘧啶的损失较少，耗能较低。
其中，将过滤液浓缩至四氢嘧啶浓度为100-160g/L再采用离子交换树脂吸附四氢嘧啶也很重要，若不浓缩，直接进行离子交换树脂除杂会降低四氢嘧啶的吸附量，影响吸附效果，降低收率，除此之外，还会增加离子交换时长。
进一步地，所述二氧化钛滤膜的孔径优选为40-60nm。由于本发明只设置一道滤膜，因此孔径选择比较关键，孔径过大或过小都不能配合后续的步骤将杂质去除干净。
在本发明的一些实施例中，所述浓缩、结晶的步骤包括：将经过所述活性炭脱色的四氢嘧啶溶液先减压浓缩至固形物含量为60-70%（m/v），10℃/h梯度降温结晶，再抽滤分离获得四氢嘧啶粗品。
现有技术采用醇沉很难得到纯度较高的四氢嘧啶，本发明采用蒸发结晶再以特定梯度降温使晶体大量析出，且杂质含量较少，从而有利于实现收率和纯度的兼顾。
在本发明的一些实施例中，所述重结晶的步骤包括：将所述四氢嘧啶粗品溶解于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品。
常规重结晶操作一般在4℃下静置重结晶，本发明意外发现，针对本发明的体系，10℃下静置重结晶并采用冷冻干燥有利于获得品质高的四氢嘧啶成品。
在本发明的一些实施例中，利用所述无机膜分离系统过程中，操作温度为25-65℃，操作压力为0.05-0.2MPa。
在本发明的一些实施例中，收集过滤液过程中，当过滤液中固形物含量低于1.0g/d L时停止收集。
在本发明的一些实施例中，所述离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂，所述强酸性阳离子交换树脂为凝胶型离子交换树脂或大孔型离子交换树脂。
优选地，所述强酸性阳离子交换树脂的型号为D001。
在本发明的一些实施例中，采用离子交换树脂吸附四氢嘧啶，解脱后得到四氢嘧啶洗脱液的步骤包括：
将浓缩至四氢嘧啶浓度为100-160g/L的过滤液泵入离子交换树脂吸附，进样流速为0.5-2BV/h，吸附饱和后采用1-10%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为0.5-2BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶洗脱液。
在本发明的一些实施例中，所述活性炭脱色的步骤包括：向所述四氢嘧啶洗脱液中加入1-3%（m/v）的活性炭溶液，在温度50-70℃下搅拌脱色0.5-1.5h后过滤。
进一步地，搅拌脱色后，过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤。
在本发明的一些实施例中，从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，具体包括以下步骤：
a、取富含四氢嘧啶的发酵液泵入无机膜分离系统，收集过滤液，当过滤液中固形物含量低于1.0g/d L时停止收集；所述无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，其孔径为30-80nm；
b、将步骤a获得的过滤液进行旋蒸浓缩，得到浓缩液，其中四氢嘧啶浓度为100-160g/L；优选地，旋蒸浓缩的温度为50-80℃，真空度为0.080-0.098MPa；
c、将步骤b获得的浓缩液泵入离子交换柱，经强酸阳离子交换树脂吸附，进样流速为0.5-2BV/h，吸附饱和后采用1-10%（w/w）的氨水洗脱，洗脱流速为0.5-2BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶高流分洗脱液；
d、将步骤c获得的高流分洗脱液加入1-3%（m/v）的活性炭脱色，温度50-70℃，搅拌脱色0.5-1.5 h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；
e、将步骤d获得的脱色液旋蒸浓缩至固形物含量60-70%（m/v）时，10℃/h梯度降温结晶，进行抽滤分离获得四氢嘧啶粗品；
f、将步骤e获得的四氢嘧啶粗品溶解于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品。
其中，所述富含四氢嘧啶的发酵液由产四氢嘧啶的菌种经微生物发酵法制备得到。所述富含四氢嘧啶的发酵液中四氢嘧啶的含量优选为60g/L以上。从富含四氢嘧啶的发酵液中提取四氢嘧啶，与化学合成法、酶催化法等方法相比，原料成本低、操作简单、产品纯度高、易于工业化生产。
进一步地，重结晶之后得到的母液可回收到步骤c，与浓缩液合并泵入离子交换柱。
另一方面，本发明还提供高纯度四氢嘧啶作为生物医药原料或化妆品原料的应用，所述高纯度四氢嘧啶由上述从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法制备得到。
本发明提供了一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，利用特定孔径和材质的无机膜分离系统去除发酵液中的菌体、部分蛋白和色素，收集过滤液，浓缩至四氢嘧啶浓度为100-160g/L后，采用离子交换树脂吸附四氢嘧啶，解脱后将四氢嘧啶洗脱液依次经过活性炭脱色、浓缩、结晶、重结晶，得到纯度99%以上的四氢嘧啶。本发明的方法通过各步骤间的合理配合，特别是无机膜分离系统和后续两次结晶的设置，从而低成本的获得了高纯度的四氢嘧啶。本发明无需采用其它电渗析、大孔吸附树脂脱色、纳滤脱盐等措施，生产成本较低，四氢嘧啶纯度高，适用于工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例提供的提取四氢嘧啶的工艺流程图；
图2为本发明各实施例和对比例所得四氢嘧啶的收率结果；
图3为本发明各实施例和对比例所得四氢嘧啶的纯度结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “具体实施方式”、或“一些具体实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明实施例的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例中，所述四氢嘧啶成品纯度的检测，使用 Spursil高效液相色谱仪测定，色谱柱为 C18 色谱柱，柱温 35℃，流动相为2%乙腈，流速 0.2mL/min，紫外检测波长210nm。
实施例1
本实施例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，工艺流程图如图1所示，具体步骤如下：
a、取四氢嘧啶发酵液10L（四氢嘧啶含量67.0g/L）进入无机膜分离系统，收集过滤液；所述的无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，无机膜孔径为40nm，操作温度为30℃，操作压力为0.2MPa；
b、将步骤a获得的过滤液进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩的温度为50℃，真空度为0.098MPa，得到浓缩液，其中四氢嘧啶浓度为160g/L；
c、将步骤b获得的浓缩液泵入离子交换柱，经强酸阳离子交换树脂（D001）吸附，进样流速为1BV/h，吸附饱和后采用3BV2%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为1BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶高流分洗脱液；
d、将步骤c获得的高流分洗脱液加入3%( m/v )的活性炭溶液脱色，温度70℃，搅拌脱色0.5 h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；其中过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤；
e、将步骤d获得的脱色液旋蒸浓缩至固形物含量60%( m/v )时，以10℃/h梯度降温结晶，再抽滤分离获得四氢嘧啶粗品；
f、将步骤e获得的四氢嘧啶粗品溶于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品528.63g，收率为78.9%。
使用 Spursil高效液相色谱仪测定步骤f得到的四氢嘧啶，根据标准曲线计算四氢嘧啶的纯度为99.90%。
实施例2
本实施例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，步骤如下：
a、取四氢嘧啶发酵液10L（四氢嘧啶含量60.0g/L）进入无机膜分离系统，收集过滤液；所述的无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，无机膜孔径为50nm，操作温度为35℃，操作压力为0.15MPa；
b、将步骤a获得的过滤液进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩的温度为60℃，真空度为0.096MPa，得到浓缩液，其中四氢嘧啶浓度为100g/L；
c、将步骤b获得的浓缩液泵入离子交换柱，经强酸阳离子交换树脂（型号D001）吸附，进样流速为1BV/h，吸附饱和后采用3BV 4%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为0.5BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶高流分洗脱液；
d、将步骤c获得的高流分洗脱液加入2%（m/v）的活性炭溶液脱色，温度60℃，搅拌脱色1h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；其中过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤；
e、将步骤d获得的脱色液旋蒸浓缩至固形物含量65%（m/v）时，以10℃/h梯度降温结晶，再抽滤分离获得四氢嘧啶粗品；
f、将步骤e获得的四氢嘧啶粗品溶于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品492.6g，收率82.1%。
使用 Spursil高效液相色谱仪测定步骤f得到的四氢嘧啶，根据标准曲线计算四氢嘧啶的纯度为99.74%。
实施例3
本实施例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，步骤如下：
a、取四氢嘧啶发酵液10L（四氢嘧啶含量63.0g/L）进入无机膜分离系统，收集过滤液；所述的无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，无机膜孔径为60nm，操作温度为40℃，操作压力为0.1MPa；
b、将步骤a获得的过滤液进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩的温度为70℃，真空度为0.09MPa，得到浓缩液，其中四氢嘧啶浓度为130g/L；
c、将步骤b获得的浓缩液泵入离子交换柱，经强酸阳离子交换树脂（型号D001）吸附，进样流速为1BV/h，吸附饱和后采用3BV6%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶高流分洗脱液；
d、将步骤c获得的高流分洗脱液加入1%（m/v）的活性炭溶液脱色，温度50℃，搅拌脱色1.5 h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；其中过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤；
e、将步骤d获得的脱色液旋蒸浓缩至固形物含量70%（m/v）时，以10℃/h梯度降温结晶，再抽滤分离获得四氢嘧啶粗品；
f、将步骤e获得的四氢嘧啶粗品溶于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品527.94g，收率83.8%。
使用 Spursil高效液相色谱仪测定步骤f得到的四氢嘧啶，根据标准曲线计算四氢嘧啶的纯度为99.51%。
对比例1
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，具体步骤如下：
a、取四氢嘧啶发酵液10L（四氢嘧啶含量67.0g/L）进入微滤膜分离系统，收集过滤液；所述的无机膜分离系统采用中空纤维微滤膜，膜孔径为30nm，操作温度为30℃，操作压力为0.2MPa；
b、将步骤a获得的过滤液进行旋蒸浓缩，旋蒸浓缩的温度为50℃，真空度为0.098MPa，得到浓缩液，其中四氢嘧啶浓度为160g/L；
c、将步骤b获得的浓缩液泵入离子交换柱，经强酸阳离子交换树脂（型号D001）吸附，进样流速为1BV/h，吸附饱和后采用3BV2%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为1BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶高流分洗脱液；
d、将步骤c获得的高流分洗脱液加入3%( m/v )的活性炭溶液脱色，温度70℃，搅拌脱色0.5 h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；其中过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤；
e、将步骤d获得的脱色液旋蒸浓缩至固形物含量60%( m/v )时，以10℃/h梯度降温结晶，再抽滤分离获得四氢嘧啶粗品；
f、将步骤e获得的四氢嘧啶粗品溶于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品518.78g，收率75.4%。
使用 Spursil高效液相色谱仪测定步骤f得到的四氢嘧啶，根据标准曲线计算四氢嘧啶的纯度为99.27%。
对比例2
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，步骤如下：
a、取四氢嘧啶发酵液10L（四氢嘧啶含量60.0g/L）进入无机膜分离系统，收集过滤液；所述的无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，无机膜孔径为50nm，操作温度为35℃，操作压力为0.15MPa；
b、将步骤a获得的过滤液进行旋蒸浓缩，得到浓缩液，其中四氢嘧啶浓度为100g/L；
c、将步骤b获得的浓缩液泵入离子交换柱，经强酸阳离子交换树脂（型号D001）吸附，进样流速为1BV/h，吸附饱和后采用3BV 4%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为0.5BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶高流分洗脱液；
d、将步骤c获得的高流分洗脱液加入2%（m/v）的活性炭溶液脱色，温度60℃，搅拌脱色1h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；其中过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤；
e、将步骤d获得的脱色液旋蒸浓缩至原体积液的10%，加入乙醇沉淀获得四氢嘧啶粗品；
f、将步骤e获得的四氢嘧啶粗品溶于无水乙醇，搅拌后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品496.02g，收率82.7%。
使用 Spursil高效液相色谱仪测定步骤f得到的四氢嘧啶，根据标准曲线计算四氢嘧啶的纯度为97.15%。
对比例3
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例1的区别在于，步骤e中，以20℃/h梯度降温。
结果四氢嘧啶的收率为78.4%，纯度为98.50%。
对比例4
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例1的区别在于，步骤e中，以5℃/h梯度降温。
结果四氢嘧啶的收率为70.2%，纯度为99.01%。
对比例5
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例1的区别在于，步骤f中，搅拌后4℃下静置进行重结晶。
结果四氢嘧啶的收率为79.0%，纯度为98.80%。4℃条件下重结晶，晶体颗粒较细小，抽滤时晶体和母液难以分离，导致纯度降低。
对比例6
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例1的区别在于，步骤f中，搅拌后10℃下静置进行重结晶，将重结晶所得晶体在60℃下烘干得到四氢嘧啶成品。
结果四氢嘧啶的收率为79.3%，纯度为98.81%。烘干产品相比与冻干的成品，颗粒较大，易结块，流动性不好。
对比例7
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例1的区别在于，步骤c中，阳离子交换树脂的型号为001×7。
结果四氢嘧啶的收率为75.3%，纯度为98.01%。
对比例8
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例1的区别在于，步骤c中，阳离子交换树脂的型号为D061。
结果四氢嘧啶的收率为74.2%，纯度为98.21%。
对比例9
本对比例提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其与实施例3的区别在于，步骤a中，无机膜孔径为120nm。
结果四氢嘧啶的收率为84.1%，纯度为97.89%。
为了更直观的显示对比例与实施例的差距，将各组收率和纯度以柱状图形式展现，如图2和图3所示，其中小写字母a、b、c等反映显著差异水平，可以看出，在纯度方面，本发明实施例是显著高于对比例的；收率方面，实施例不是最高的，因为本发明目标是保证纯度的前提下兼顾收率，纯度的提高必然会造成收率的降低，但综合而言，本发明实施例所得四氢嘧啶优于对比例。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，包括：
利用无机膜分离系统去除发酵液中的菌体、部分蛋白和色素，收集过滤液，将所述过滤液浓缩至四氢嘧啶浓度为100-160g/L后，采用型号为D001的离子交换树脂吸附四氢嘧啶，解脱后得到四氢嘧啶洗脱液，所述四氢嘧啶洗脱液依次经过活性炭脱色、浓缩、结晶、重结晶，得到纯度99%以上的四氢嘧啶；
其中，所述无机膜分离系统采用二氧化钛滤膜，其孔径为30-80nm。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，所述浓缩、结晶的步骤包括：
将经过所述活性炭脱色的四氢嘧啶溶液先减压浓缩至固形物含量为60-70%（m/v），10℃/h梯度降温结晶，再抽滤分离获得四氢嘧啶粗品。
3.根据权利要求2所述的从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，所述重结晶的步骤包括：
将所述四氢嘧啶粗品溶解于超纯水，搅拌均匀后10℃下静置进行重结晶，冷冻干燥后得到四氢嘧啶成品。
4.根据权利要求1-3任一项所述的从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，利用所述无机膜分离系统过程中，操作温度为25-65℃，操作压力为0.05-0.2MPa；
和/或，收集过滤液过程中，当过滤液中固形物含量低于1.0g/d L时停止收集。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，采用型号为D001的离子交换树脂吸附四氢嘧啶，解脱后得到四氢嘧啶洗脱液的步骤包括：
将浓缩至四氢嘧啶浓度为100-160g/L的过滤液泵入离子交换树脂吸附，进样流速为0.5-2BV/h，吸附饱和后采用 1-10%（w/w)的氨水洗脱，洗脱流速为0.5-2BV/h，收集纯度70%以上的四氢嘧啶洗脱液。
6.根据权利要求1-3任一项所述的从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，所述活性炭脱色的步骤包括：
向所述四氢嘧啶洗脱液中加入1-3%（m/v）的活性炭溶液，在温度50-70℃下搅拌脱色0.5-1.5h后过滤。
7.根据权利要求6所述的从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，搅拌脱色后，过滤时采用硅藻土涂层的方式进行板框过滤。
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