CN116354890A - 一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺；能够制备出含量大于99％、纯度达到100％的四氢嘧啶产品，符合市场需求，并且该工艺分离纯化步骤简单、生产成本低，适合大规模工业生产及应用；含以下步骤：步骤(1)、膜过滤：将发酵液通过陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液；步骤(2)、离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过离子交换柱，吸附饱和后，先用纯水洗涤去除杂质；步骤(3)、浓缩：将四氢嘧啶洗脱液进行减压浓缩；步骤(4)、活性炭脱色；步骤(5)、浓缩结晶；步骤(6)、干燥；步骤(7)、成品检测：通过高效液相色谱法检测四氢嘧啶成品的含量及纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺及应用。
背景技术
四氢嘧啶又名依克多因，是一种小分子环状氨基酸衍生物，分子量为142.16，能够增强水分子之间的相互作用，稳定水分子的四面体结构，并在生物大分子周围形成一层水化层。在自然界中，许多极端环境微生物都能够自身合成四氢嘧啶，并将其作为应对恶劣环境的细胞和大分子保护屏障。自1985年被发现和报道后，对于四氢嘧啶的研究不断深入，研究表明四氢嘧啶可以帮助细胞对抗表面活性剂造成的细胞膜损伤，减轻紫外辐射造成的炎症反应以及表面活性剂造成的肌肤刺激和表皮水分流失，对肌肤具有长效保湿的作用。与此同时，四氢嘧啶作为化妆品原料和医药原料的市场应用也得到充分开发，并首先由德国的Bitop实现了规模化的原料生产。
四氢嘧啶已被收录于我国的《已使用化妆品原料目录》，备案名为四氢甲基嘧啶羧酸。近年来，随着消费者护肤理念的提升，四氢嘧啶在国内的应用受到重视，越来越多的化妆品开始以四氢嘧啶为功效成分，市场前景广阔。
目前四氢嘧啶的合成以微生物发酵法为主，要获取四氢嘧啶，必须使菌体细胞内的四氢嘧啶释放到溶液中。现有专利也公开了一种四氢嘧啶的提取工艺，将含有四氢嘧啶物质的粉碎后菌体按固液比1:5-15加入去离子水进行溶解搅拌，使四氢嘧啶物质溶出，然后静置，除去上层漂浮的菌体碎片，得到含四氢嘧啶物质的溶液。此方法一是采用将干燥菌体粉碎的机械方法，粉碎能耗高且不利于细胞内产物的充分提取，二是加水溶解，在后续处理的过程中，产生大量污水，既浪费水资源又对环境不利。
综上所述，对于四氢嘧啶的提取，如何开发下游分离纯化工艺，制备出高含量、高纯度的四氢嘧啶，是当前需要解决的技术难题。
发明内容
针对背景技术中提到的问题，本发明的目的是提供一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺；能够制备出含量大于99％、纯度达到100％的四氢嘧啶产品，符合市场需求，并且该工艺分离纯化步骤简单、生产成本低，适合大规模工业生产及应用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，包含以下步骤：
步骤(1)、膜过滤：将发酵液通过陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液；将微滤液通过纳滤膜设备处理，收集滤液，得到去除蛋白杂质和部分色素的四氢嘧啶纳滤液；
步骤(2)、离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过离子交换柱，吸附饱和后，先用纯水洗涤去除杂质，再用氨水溶液将四氢嘧啶从离子交换柱上洗脱下来，得到四氢嘧啶洗脱液；
步骤(3)、浓缩：将四氢嘧啶洗脱液进行减压浓缩；
步骤(4)、活性炭脱色：向四氢嘧啶浓缩液中加入活性炭，脱色后过滤获得四氢嘧啶脱色液；
步骤(5)、浓缩结晶：将四氢嘧啶脱色液进行减压浓缩至饱和，加入乙醇，降温结晶并过滤获得四氢嘧啶晶体；
步骤(6)、干燥：将四氢嘧啶晶体进行干燥，获得四氢嘧啶成品；
步骤(7)、成品检测：通过高效液相色谱法检测四氢嘧啶成品的含量及纯度。
作为优选，步骤(1)中，滤液作为发酵液的四氢嘧啶为胞外产物，陶瓷膜的规格为50nm-200nm，进出口压力为0.2-0.3MPa，温度为＜45℃，纳滤膜的规格为800D-1000D，进出口压力为0.8-1.0MPa，温度为＜45℃。
作为优选，步骤(2)中，离子交换所用树脂为732型强酸性阳离子交换树脂，进料速度为1-2BV/h，纯水洗涤速度为1-2BV/h，氨水溶液浓度为0.5-1M，洗脱速度为0.5-1.5BV/h。
作为优选，步骤(3)及步骤(5)中，减压浓缩温度为65℃-75℃。
作为优选，步骤(4)中，活性炭的添加量为0.5％-1.5％，脱色时间为0.5h-1.5h。
作为优选，步骤(5)中，乙醇添加量为浓缩液体积的2-3倍，结晶温度为4℃-8℃，结晶过滤后剩余的母液可在下一次结晶时进行套用。
作为优选，步骤(6)中，干燥温度为60℃-70℃，干燥时间为4h-6h。
作为优选，步骤(7)中，液相检测条件为色谱柱：C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：A相：超纯水，B相：纯乙腈；流动相配比：A：B＝95：5；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：紫外检测器，210nm；柱温箱：35℃。
作为优选，通过该工艺制备的四氢嘧啶成品可作为化妆品原料、医药原料或其他工业原料的应用。
综上所述，本发明主要具有以下有益效果：本发明提出一种从发酵液中提取制备四氢嘧啶的工艺，四氢嘧啶成品含量大于99％，纯度达到100％，符合市场需求，能够作为化妆品原料、医药原料或其他工业原料进行应用；
并且具有工艺步骤简单的优点，通过膜过滤-阳离子交换-脱色-结晶-干燥的常规操作即可完成分离纯化，且结晶操作过程产生的母液可以在下一次结晶时进行套用，提高了产品收率及乙醇的利用率，生产成本低，适合大规模工业生产及应用。
附图说明
图1为本发明的实施例1的四氢嘧啶成品图；
图2为本发明的实施例4的液相检测色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，包含以下步骤：
步骤(1)、膜过滤：将发酵液通过陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液；将微滤液通过纳滤膜设备处理，收集滤液，得到去除蛋白杂质和部分色素的四氢嘧啶纳滤液；
步骤(2)、离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过离子交换柱，吸附饱和后，先用纯水洗涤去除杂质，再用氨水溶液将四氢嘧啶从离子交换柱上洗脱下来，得到四氢嘧啶洗脱液；
步骤(3)、浓缩：将四氢嘧啶洗脱液进行减压浓缩；
步骤(4)、活性炭脱色：向四氢嘧啶浓缩液中加入活性炭，脱色后过滤获得四氢嘧啶脱色液；
步骤(5)、浓缩结晶：将四氢嘧啶脱色液进行减压浓缩至饱和，加入乙醇，降温结晶并过滤获得四氢嘧啶晶体；
步骤(6)、干燥：将四氢嘧啶晶体进行干燥，获得四氢嘧啶成品；
步骤(7)、成品检测：通过高效液相色谱法检测四氢嘧啶成品的含量及纯度。
步骤(1)中，滤液作为发酵液的四氢嘧啶为胞外产物，陶瓷膜的规格为50nm-200nm，进出口压力为0.2-0.3MPa，温度为＜45℃，纳滤膜的规格为800D-1000D，进出口压力为0.8-1.0MPa，温度为＜45℃。
步骤(2)中，离子交换所用树脂为732型强酸性阳离子交换树脂，进料速度为1-2BV/h，纯水洗涤速度为1-2BV/h，氨水溶液浓度为0.5-1M，洗脱速度为0.5-1.5BV/h。
步骤(3)及步骤(5)中，减压浓缩温度为65℃-75℃。
步骤(4)中，活性炭的添加量为0.5％-1.5％，脱色时间为0.5h-1.5h。
步骤(5)中，乙醇添加量为浓缩液体积的2-3倍，结晶温度为4℃-8℃，结晶过滤后剩余的母液可在下一次结晶时进行套用。
步骤(6)中，干燥温度为60℃-70℃，干燥时间为4h-6h。
步骤(7)中，液相检测条件为色谱柱：C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：A相：超纯水，B相：纯乙腈；流动相配比：A：B＝95：5；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：紫外检测器，210nm；柱温箱：35℃。
本发明从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的应用，可通过该工艺制备的四氢嘧啶成品可作为化妆品原料、医药原料或其他工业原料的应用。
在具体实施时，可以按照如下实施方式进行：
实施例1：发酵液中四氢嘧啶的提取
(1)膜过滤：将30L四氢嘧啶发酵液(四氢嘧啶含量为81g/L)通过200nm陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液。将微滤液通过1000D纳滤膜设备处理，收集滤液，得到去除蛋白杂质和部分色素的四氢嘧啶纳滤液；
(2)离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过732型强酸性阳离子交换柱，进样速度为1BV/h，吸附饱和后，按1BV/h的速度先用纯水洗涤去除杂质，再用0.5M氨水溶液按0.5BV/h的速度将四氢嘧啶从离子交换柱上洗脱下来，得到四氢嘧啶洗脱液；
(3)浓缩：将四氢嘧啶洗脱液在73℃下进行减压浓缩；
(4)活性炭脱色：向四氢嘧啶浓缩液中加入1％活性炭，脱色1h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；
(5)浓缩结晶：将四氢嘧啶脱色液进行减压浓缩至饱和，加入3倍体积乙醇，4℃下静置结晶获得四氢嘧啶晶体；
(6)干燥：将四氢嘧啶晶体在65℃下干燥6h，获得四氢嘧啶成品1372.16g，样品形态如图1所示。
实施例2：发酵液中四氢嘧啶的提取
(1)膜过滤：将32L四氢嘧啶发酵液(四氢嘧啶含量为85g/L)通过50nm陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液。将微滤液通过800D纳滤膜设备处理，收集滤液，得到去除蛋白杂质和部分色素的四氢嘧啶纳滤液；
(2)离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过732型强酸性阳离子交换柱，进样速度为2BV/h，吸附饱和后，按2BV/h的速度先用纯水洗涤去除杂质，再用0.8M氨水溶液按1.5BV/h的速度将四氢嘧啶从离子交换柱上洗脱下来，得到四氢嘧啶洗脱液；
(3)浓缩：将四氢嘧啶洗脱液在70℃下进行减压浓缩；
(4)活性炭脱色：向四氢嘧啶浓缩液中加入0.5％活性炭，脱色1h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；
(5)浓缩结晶：将四氢嘧啶脱色液进行减压浓缩至饱和，加入实施例1的结晶母液及2.5倍体积乙醇，4℃下静置结晶获得四氢嘧啶晶体；
(6)干燥：将四氢嘧啶晶体在70℃下干燥5h，获得四氢嘧啶成品2035.47g。
实施例3：发酵液中四氢嘧啶的提取
(1)膜过滤：将30L四氢嘧啶发酵液(四氢嘧啶含量为82.5g/L)通过200nm陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液。将微滤液通过900D纳滤膜设备处理，收集滤液，得到去除蛋白杂质和部分色素的四氢嘧啶纳滤液；
(2)离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过732型强酸性阳离子交换柱，进样速度为1.5BV/h，吸附饱和后，按1.5BV/h的速度先用纯水洗涤去除杂质，再用1M氨水溶液按1BV/h的速度将四氢嘧啶从离子交换柱上洗脱下来，得到四氢嘧啶洗脱液；
(3)浓缩：将四氢嘧啶洗脱液在65℃下进行减压浓缩；
(4)活性炭脱色：向四氢嘧啶浓缩液中加入1.5％活性炭，脱色1.5h，过滤获得四氢嘧啶脱色液；
(5)浓缩结晶：将四氢嘧啶脱色液进行减压浓缩至饱和，加入实施例2的结晶母液及2倍体积乙醇，4℃下静置结晶获得四氢嘧啶晶体；
(6)干燥：将四氢嘧啶晶体在70℃下干燥4h，获得四氢嘧啶成品2150.23g。
实施例4：四氢嘧啶成品的含量及纯度检测
(1)HPLC条件：色谱柱：C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：A相：超纯水，B相：纯乙腈；流动相配比：A：B＝95：5；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：紫外检测器，210nm；柱温箱：35℃。
(2)对照品溶液制备：取四氢嘧啶对照品适量，置于105℃烘箱中恒温干燥3h，冷却至室温，精密称取0.010g(精确至0.0001g)，置于50mL容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤。
(3)样品溶液制备：分别取实施例1、实施例2和实施例3四氢嘧啶样品适量，置于105℃烘箱中恒温干燥3h，冷却至室温，精密称取0.010g(精确至0.0001g)，置于50mL容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤。
(4)含量检测：取对照品溶液和实施例1、实施例2和实施例3样品溶液，分别按照色谱条件进样，以外标一点法计算样品中四氢嘧啶的含量。样品中四氢嘧啶的含量＝(As×mr×Pr)/(Ar×ms)×100％。式中As为样品溶液中四氢嘧啶的峰面积，Ar为对照品溶液中四氢嘧啶的峰面积，ms为四氢嘧啶样品的称样量(g)，mr为四氢嘧啶对照品的称样量(g)，Pr为四氢嘧啶对照品的含量。以两次平行测定结果的算术平均值为报告值，两次平行测定结果的绝对差值不大于算术平均值的2％。测定结果如表1所示，计算得实施例1、实施例2和实施例3四氢嘧啶样品的含量分别为99.85％、100.49％、99.16％。
(5)纯度检测：取实施例1、实施例2和实施例3样品溶液，分别按照色谱条件进样，记录色谱图，按面积归一化法，通过峰面积百分比计算得样品中四氢嘧啶的纯度均为100％。色谱图如图2所示。
表1实施例4液相检测结果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，包含以下步骤：
步骤(1)、膜过滤：将发酵液通过陶瓷膜设备处理，收集滤液，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液；将微滤液通过纳滤膜设备处理，收集滤液，得到去除蛋白杂质和部分色素的四氢嘧啶纳滤液；
步骤(2)、离子交换层析：将四氢嘧啶纳滤液通过离子交换柱，吸附饱和后，先用纯水洗涤去除杂质，再用氨水溶液将四氢嘧啶从离子交换柱上洗脱下来，得到四氢嘧啶洗脱液；
步骤(3)、浓缩：将四氢嘧啶洗脱液进行减压浓缩；
步骤(4)、活性炭脱色：向四氢嘧啶浓缩液中加入活性炭，脱色后过滤获得四氢嘧啶脱色液；
步骤(5)、浓缩结晶：将四氢嘧啶脱色液进行减压浓缩至饱和，加入乙醇，降温结晶并过滤获得四氢嘧啶晶体；
步骤(6)、干燥：将四氢嘧啶晶体进行干燥，获得四氢嘧啶成品；
步骤(7)、成品检测：通过高效液相色谱法检测四氢嘧啶成品的含量及纯度。
2.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(1)中，滤液作为发酵液的四氢嘧啶为胞外产物，陶瓷膜的规格为50nm-200nm，进出口压力为0.2-0.3MPa，温度为＜45℃，纳滤膜的规格为800D-1000D，进出口压力为0.8-1.0MPa，温度为＜45℃。
3.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(2)中，离子交换所用树脂为732型强酸性阳离子交换树脂，进料速度为1-2BV/h，纯水洗涤速度为1-2BV/h，氨水溶液浓度为0.5-1M，洗脱速度为0.5-1.5BV/h。
4.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(3)及步骤(5)中，减压浓缩温度为65℃-75℃。
5.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(4)中，活性炭的添加量为0.5％-1.5％，脱色时间为0.5h-1.5h。
6.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(5)中，乙醇添加量为浓缩液体积的2-3倍，结晶温度为4℃-8℃，结晶过滤后剩余的母液可在下一次结晶时进行套用。
7.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(6)中，干燥温度为60℃-70℃，干燥时间为4h-6h。
8.如权利要求1所述从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(7)中，液相检测条件为色谱柱：C18(250×4.6mm,5μm)；流动相：A相：超纯水，B相：纯乙腈；流动相配比：A：B＝95：5；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：紫外检测器，210nm；柱温箱：35℃。
9.一种从发酵液中提取制备高含量四氢嘧啶的应用，其特征在于，通过该工艺制备的四氢嘧啶成品可作为化妆品原料、医药原料或其他工业原料的应用。
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