CN110437290A - 一种甜菊糖苷提取、分离和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取，分离和纯化甜菊糖苷的方法。其方法包括如下步骤：称取一定量的甜叶菊，固液比控制在1∶8～1∶20，温度控制在0～30℃，焦亚硫酸钠添加量控制在0.1％～5.0％，甲醛添加量控制量0.1％～3.0％，进行循环渗漉提取，得提取液。提取液进行壳聚糖絮凝除杂，pH控制在3～7，壳聚糖添加量控制在0.5％～3.0％，温度控制在50～80℃，絮凝时间控制在0.5～3.0h。絮凝结束后，经离心得上清液。上清液经过微滤膜脱色，超滤膜除大分子，以及反渗透浓缩，得透过液。将透过液上柱，经过水洗、碱洗、酸洗、稀醇除杂和高醇解吸，可得到纯度90％以上的甜菊糖苷。本发明采用低温循环渗漉提取，膜过滤和柱层析纯化甜菊糖苷，可提高甜菊糖苷纯化效率以及减少废水的排放，具有良好的开发和应用前景。

Description

一种甜菊糖苷提取、分离和纯化方法

技术领域

本发明属于天然产物研究与开发技术领域，特别涉及一种甜菊糖苷提取、分离和纯化方法。

背景技术

甜菊糖苷是一种天然、高甜度、低热量不致龋甜味剂，是从甜叶菊的叶子和根茎中提取精制得到，主要由Stevioside(ST)和RebaudiosideA(RA)两种成分组成，其中RA是蔗糖的理想替代品。目前，甜菊糖苷已在我国食品、医药、日用品等行业得到了广泛应用。全世界甜菊糖苷的年需求量近1万吨，随着甜味剂主要消费国美国批准使用，其需求量将以每年30％的速度增长；我国年生产量为3000t，国内消耗约 500t，80％以上出口到日本、韩国、美国等国家，远远不能满足市场发展需求。

我国甜菊糖苷工业化生产制备的技术起步较晚，许多先进的生产技术及设备尚没被利用，提取分离技术水平低，产品纯度较低，工艺化生产成本高，致使许多资源没有得到充分的利用，尚需进一步的优化和提高。甜叶菊中甜菊糖及其相关产品的开发具有很好前景。大力开展甜菊糖苷的提取、分离和纯化工艺研究与开发，进行甜叶菊新品种的培育和改良，提高甜叶菊中有效成分RA的含量，对带动我国甜菊糖苷产业的发展，改善我国农村农作物品种结构，具有十分重要的现实意义。

甜菊糖苷的制备流程主要包括干燥粉碎甜叶菊、液相浸提、除杂、树脂处理、喷雾干燥和精制等步骤。传统采用热水或者醇类等极性溶剂浸提甜叶菊。低温渗漉提取是近些年来一种条件温和，能耗低和提取效率高的新型糖类物质提取方法。采用低温渗漉提取甜菊糖并对其进行工艺优化可为甜叶菊的节能低耗工业化生产提供参考。传统采用絮凝、板框过滤和树脂处理纯化甜菊糖苷，但是这些方法需经过多次纯化才能得到90％甜菊糖苷。膜是具有选择性分离功能的材料。利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离。它与传统过滤的不同在于膜可以在分子范围内进行分离，并且这过程是一种物理过程，不需发生相的变化和添加助剂。膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同(或称为截留分子量)，可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜。将膜技术应用到甜菊糖苷的分离纯化中，可提高上柱液中甜菊糖苷含量，渐少废水的排放，具有很好的应用和发展前景。

发明内容

一种甜菊糖苷提取、分离和纯化方法，其特征在于按如下步骤实施：称取一定量的甜叶菊，固液比控制在1∶8～1∶20，温度控制在0～30℃，焦亚硫酸钠添加量控制在0.1％～5.0％，甲醛添加量控制量0.1％～3.0％，进行循环渗漉提取，得提取液。提取液进行壳聚糖絮凝除杂，pH控制在3～7，壳聚糖添加量控制在 0.5％～3.0％，温度控制在50～80℃，絮凝时间控制在0.5～3.0h。絮凝结束后，经离心得上清液。上清液经过微滤膜脱色，超滤膜除大分子，以及反渗透浓缩，得透过液。将透过液上柱，经过水洗、碱洗、酸洗、稀醇除杂和高醇解吸，即可得到纯度90％以上的甜菊糖苷产品。下面通过具体实例进一步说明本发明。

附图说明：

图1不同脱色树脂对反渗透浓缩液的脱色效果

图2温度对D303树脂脱色效果的影响

图3不同流量对D303树脂脱色效果的影响

图4不同吸附树脂对反渗透浓缩液的甜菊糖保留率

图5温度对T28树脂吸附效果的影响

图6 T28树脂对反渗透浓缩液中甜菊糖苷的漏出曲线

图7 T28树脂动态解吸曲线

具体实施方法：

实施例1：

将甜叶菊在50℃下烘干，然后称取1Kg烘干甜叶菊，加入20L温度为20℃的水，循环渗漉提取30 min，放出提取液1约18L；然后加入18L温度为20℃的水，循环渗漉提取30min，放出提取液2约16L；合并1和2合计34L(记为a)。再次加入15L温度为20℃的水，循环渗漉提取30min，放出提取液3 约14L；最后，加入15L温度为20℃的水，循环渗漉提取30min，放出提取液4约14L；合并3和4共 29L(记为b)。再次称取1Kg甜叶菊，以b为提取剂进行循环渗漉提取。首先加入20L合并液b，循环渗漉提取30min，放出提取液5约18L。将剩余合并液b补齐至15L进行第二次循环渗漉提取，放出提取液6约14L。合并5和6共32L(记为c)。第三次提取时加入15L温度为20℃的水，循环渗漉提取 30min，放出提取液7约14L。最后加入15L温度为20℃的水，循环渗漉提取30min，放出提取液8约 14L。合并7和8共29L(记为d)。再次按照上述方法对1Kg新鲜甜叶菊进行循环渗漉提取。第一次提取液9约18L，第二次提取液10约14L，合并9和10共32L(记为e)。第三次提取液11约14L，第四次提取液12约14L，合并11和12共29L(记为f)。将a、c、e和f合并合计约120L，经测定其中的甜菊糖苷纯度为25.6％。

实施例2：

取10La、c、e、f合并液，然后向其中加入2％的壳聚糖搅拌均匀，絮凝温度控制在50℃，絮凝pH 值控制在6左右，搅拌后静止30min左右，然后通过离心得絮凝上清液和沉淀，经测定絮凝上清液中的甜菊糖苷纯度为27.8％。将絮凝上清液过5万微滤膜，得透过液9.8L，经测定其中的甜菊糖苷纯度为26.6％。然后将微滤膜透过液过5000超滤膜，得透过液9.0L，经测定其中的甜菊糖苷纯度为30.8％。最后。利用反渗透将超滤膜透过液进行浓缩，得浓缩液6L，作上柱备用。

实施例3：

分别称取5.000g脱色树脂D285、D941、D303、D335、LX-T，各加入30mL反渗透浓缩液，放至摇床，设置温度为25℃，速度为90rmp/min，振荡12h。测定在此温度和转速下，不同脱色树脂对甜菊糖苷反渗透浓缩液的脱色率，结果如图1所示。由结果可知，5种脱色树脂对甜叶菊水提液的脱色率都达到了 75％以上。从脱色率以及实际观察脱色液颜色上看，D303是脱色效果最好的树脂。

实施例4：

考察D303树脂在25℃、35℃和45℃下对反渗透浓缩液的脱色效果，结果如图2所示。由结果可知，在脱色初始阶段(0～5h)，45℃时树脂对甜菊糖样液色素的吸附速度最大。这是因为温度升高，提高了色素分子和树脂上可交换基团的解离度，同时升温有助于色素分子的热运动，色素分子更容易被树脂吸附。其中树脂对色素分子的推动力为静电相互作用。在5h以后树脂的脱色率上升缓慢，证明脱色树脂对色素的吸附趋于饱和。14h，45℃脱色树脂的脱色率达到最高，此后，脱色率缓慢下降，其原因有可能是温度太高，导致脱色树脂无法再对色素进行吸附。而反观35℃时脱色树脂对甜菊糖样液的脱色率缓慢上升，并且在15h左右，超过了45℃时的脱色率，在吸附20h时，甜菊糖苷反渗透浓缩液的脱色率达到了97.4％。因此，确定35℃为甜菊糖苷反渗透浓缩液的最佳脱色温度。

实施例5：

考察D303树脂在1.5BV/h和2.0BV/h上样速度下对反渗透浓缩液的脱色效果，结果如图3所示。由结果可知，以A/A0＝0.6为标准，1.5BV/h流量可处理4BV水提液，而3BV/h流量只能处理2BV水提液。结果表明，低流量进液时，色素分子与树脂接触更充分，脱色效果更加理想。

实施例6：

分别称取5.000g吸附树脂T28、LK37、DM18、DM30、AB-8、HZ-816、HZ-81，各加入30mL反渗透浓缩液，放至摇床，设置温度为25℃，速度为90rmp/min，振荡12h。测定在此温度和转速下，不同吸附树脂对甜菊糖苷保留率，结果如图4所示。吸附树脂的筛选主要是考察不同吸附树脂对甜菊糖样液中甜菊糖苷的吸附能力。以相同时间、相同温度下对甜菊糖苷的吸附量为标准。吸附量越大，表示树脂对甜菊糖苷的吸附能力越强。即吸附后的甜菊糖苷反渗透浓缩液中，甜菊糖苷的保留率越小，表示树脂的吸附能力越强。结果可知，T28吸附树脂对反渗透浓缩液中的甜菊糖保留率最低，为2.61％。因此，选择T28吸附树脂为反渗透浓缩液的最佳吸附树脂。

实施例7：

考察T28树脂在25℃、35℃和45℃下对反渗透浓缩液的吸附效果，结果如图5所示。由结果可知，温度控制在25℃时，在吸附初始的2h内，吸附树脂快速吸附甜菊糖苷，到第4h的时候，吸附液中的甜菊糖苷基本被吸附完全，甜菊糖苷浓度接近0％，并保持稳定。35℃和45℃时，甜菊糖苷分子的热运动增加，吸附树脂对甜菊糖苷分子的吸附速率加快，在前2h内，树脂对甜菊糖苷的吸附很快，之后树脂对甜菊糖苷的吸附缓慢。35℃，吸附树脂吸附5h～10h以及45℃，吸附树脂吸附10h～20h时，吸附量反而减少了。造成这种现象的原因可能是温度升高，甜菊糖苷分子的剧烈运动导致吸附的不稳定，原本已经被吸附的甜菊糖苷分子重新被释放出来。综合考虑，在吸附时间较长的情况下(超过6h)，25℃是甜菊糖苷反渗透浓缩液的最佳吸附温度。在吸附时间较短的情况下(2h以内)，升高温度，有利于树脂的快速吸附。

实施例8：

考察T28动态吸附反渗透浓缩液中甜菊糖苷的漏出曲线，结果如图6所示。将T28吸附树脂装柱，柱体积40mL，流量为2BV/h。结果表明，25℃下，T28吸附树脂最多可以处理8BV的甜菊糖苷反渗透浓缩液不发生泄露。

实施例9：

考察T28吸附反渗透浓缩液中甜菊糖苷的动态解吸曲线，结果如图7所示。先使用20％乙醇溶液洗脱 1.5BV，目的是除去树脂中吸附的杂质。然后，使用60％乙醇解吸，流量为2BV/h，解吸剂用量4BV即可将甜菊糖苷从树脂上完全解吸下来。

实施例10：

利用筛选出的脱色树脂D303对剩下的反渗透浓缩液进行处理，得5L脱色液，然后直接上T28吸附树脂；吸附结束后，先用1BV水洗；再用1BV的0.5％NaOH溶液洗，然后用1.0BV水顶至中性；再用 0.5％HCl溶液洗1BV，然后用1BV水顶至中性；接着用20％的乙醇洗1.5BV；然后用60％的乙醇洗1.5BV，收集洗脱液，经过浓缩和冷冻干燥，可得到纯度为90.6％甜菊糖苷产品。

由上述实施例可以看出，本发明采用低温渗漉提取、壳聚糖絮凝，膜处理和树脂纯化甜菊糖，与传统方法相比，可提高甜菊糖苷纯化效率，并减少工业化生产过程中废水的排放，所得甜菊糖苷纯度可达到 90.6％。针对现阶段我国甜菊糖苷提取分离技术水平低，产品纯度较低，工艺化生产成本高。本发明可对当前甜菊糖苷的开发和利用具有较大的应用潜力和发展前景。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，做出的变化、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种甜菊糖苷提取、分离和纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，原料的预处理

将甜叶菊50～70℃烘干，粉碎，过60～120目筛，备用；

第二步，焦亚硫酸钠-甲醛溶液的配制

称取一定质量的焦亚硫酸钠和甲醛，配制焦亚硫酸钠-甲醛溶液，其中焦亚硫酸钠的含量为0.1％～5.0％，甲醛的含量为0.1％～3.0％；

第三步，低温循环渗漉提取

称取一定质量的甜叶菊，然后加入温度为0～30℃的焦亚硫酸钠-甲醛溶液，甜叶菊的质量与焦亚硫酸钠-甲醛溶液体积控制在1∶8～1∶20，进行循环渗漉提取，提取时间为0.5h～1.0h，提取结束后放出提取液1；然后再次加入新鲜的焦亚硫酸钠-甲醛溶液，在同样的条件下进行第二次提取，提取结束后放出提取液2；然后再次加入新鲜的焦亚硫酸钠-甲醛溶液，在同样的条件下进行第三次提取，提取结束后放出提取液3；将提取液3加入新鲜的且同等质量的甜叶菊中进行第1次提取，如此循环；最后，将所有提取液合并，过滤，得甜菊糖低温渗漉提取液；

第四步，絮凝除杂

量取一定体积提取液，将其pH调节至3～7，温度调节至50～80℃，然后添加0.5％～3.0％的絮凝剂进行絮凝，絮凝时间控制在0.5～3.0h。絮凝结束后，经离心得上清液；

第五步，膜过滤

量取一定体积絮凝上清液，首先过微滤膜进行脱色，得微滤膜透过液；然后将微滤膜透过液过超滤膜，除去大分子杂质，得超滤膜透过液；最后将超滤膜透过液进行反渗透实验，将其浓缩至一定体积作上柱用；

第六步，柱纯化

(1)以超滤膜透过液的浓缩液为原料，以脱色率为指标，以T5(蓝晓科技有限公司)、D285(山东鲁抗股份有限公司)、D941(山东鲁抗股份有限公司)、D303(上海华震科技有限公司)、D335(上海华震科技有限公司)树脂为考察对象，按照生药质量∶树脂质量＝1∶1～2上样，筛选脱色效果最好的一种树脂；

(2)以脱色效果最好的脱色液为原料，以甜菊糖苷保留率为指标，以DM30(山东鲁抗股份有限公司)、LK37(山东鲁抗股份有限公司)、DM18(山东鲁抗股份有限公司)、T28(蓝晓科技有限公司)、HZ-816(上海华震科技有限公司)、HZ-818(上海华震科技有限公司)和AB-8(天津浩聚树脂科技有限公司)为考察对象，按照生药质量∶树脂质量＝1∶2～4上样，筛选一种吸附效果最好的树脂；

(3)在此基础上，对最佳吸附树脂上的甜菊糖苷进行解析；首先用1～3BV水洗，流速控制在1.0-3.0BV/h)，再用1～2BV的0.5～1.0％NaOH水溶液(pH为8～9)洗，然后用0.5～1.0％HCl水溶液(PH为6～7)洗1～2BV；再用15～30％的乙醇洗1.5～3.0BV，流速为1.0～2.0BV/h，以及60～80％的乙醇洗1.0～3.0BV，流速为1.0～2.0BV/h；最后水顶醇1.0～3.0BV，流速为1.0～3.0BV/h；将60～80％乙醇洗脱段进行浓缩和冷冻干燥，即得所要产品。

2.根据权利要求1所述的一种甜菊糖苷提取、分离和纯化方法，其特征在于第三步中所有提取液为每组新鲜甜叶菊的第一和第二次提取液的合并液。

3.根据权利要求1所述的一种甜菊糖提取、分离和纯化方法，其特征在于第四步中絮凝剂包括壳聚糖、硫酸铁、氧化铝、明矾、聚丙烯酰胺，活性炭等。

4.根据权利要求1所述的一种甜菊糖提取、分离和纯化方法，其特征在于步骤第六步中脱色率，甜菊糖苷含量以及甜菊糖苷保留率的测定如下：

(1)脱色率测定：甜叶菊水提液为茶褐色，根据颜色互补的原理，测量吸光度的时候，设置检测波长为420nm，在此波长下，分别测定甜叶菊水提液脱色前的吸光度(A0)和脱色后的吸光度(A1)，按照如下公式计算树脂的脱色率(D)；

(2)甜菊糖苷含量测定：配置成一系列浓度的甜菊糖标准溶液；采用高效液相色谱法测定相应的峰面积，以标准品的峰面积为纵坐标，以甜菊糖浓度为横坐标，单位为mg/mL，绘制标准曲线图；HPLC条件为：色谱柱为XB-C18，5μm，300×4.6mm，柱温箱温度为35℃，流动相为0.1％磷酸溶液∶乙腈＝0.245∶0.455，检测波长为210nm；按照标准曲线的测定方法测定样品的峰面积，然后代入标准曲线中，即能得到样品中甜菊糖苷的含量；

(3)甜菊糖苷保留率测定：分别测定吸附前甜菊糖苷溶液浓度C₀(mg/mL)、体积V₀(mL)以及吸附后浓度C₁(mg/mL)、V₁(mL)，按照如下公式计算甜菊糖苷的保留率(R)。