CN101671294B - 一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(dnj)、黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,其方法要点为:将桑叶和乙醇混合后提取,离心过滤,浓缩后加入絮凝剂絮凝沉淀;除去沉淀后将滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱,并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱;滤液加入结束后用纯净水洗至大孔树脂柱流出液无色时将其断开,再用氨水或含氨的乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ);洗脱液再上阳离子树脂柱,重复操作后收集洗脱液,用80D纳滤膜浓缩过滤后喷雾干燥,得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)。用3%~10%的乙醇洗涤大孔树脂柱以除去胶性杂质,再用50%~70%乙醇洗脱黄酮,收集棕红色洗脱液,减压浓缩回收乙醇后喷雾干燥,得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
Description
技术领域
本发明涉及一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法。
背景技术
桑叶为桑科植物桑的干燥叶,栽培或野生,对土壤适应性强,全国大部分地区多有生产。味苦、甘,性寒。经研究发现,桑叶在药理上具有抗炎、降血糖作用,并能够降血脂、利尿。桑叶具有上述活性和药理学作用,主要是因为其组分中含有1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮等成分,因而将其从桑叶中提取出来以供集中使用是十分有必要的。
1-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种强的α-葡萄糖苷酶抑制剂,抑制小肠中的α-葡萄糖苷酶将人体从淀粉类食物中所分解来的蔗糖、麦芽糖等二糖分解成葡萄糖,能明显抑制食后血糖急剧上升;黄酮类化合物是一类天然抗氧化剂,能够清除人体中超氧化自由基和过氧化物,具有软化毛细血管,改善血液循环系统的功能;1-脱氧野尻霉素(DNJ)和桑叶黄酮协同作用能更有效抑制血糖上升,防治糖尿病及其并发的心脑血管疾病。
目前国内外对从桑叶中提取并分离1-脱氧野霉素(DNJ)、黄酮进行了一些研究。
中国专利200710060127.2公开了一种从桑叶中提取生物碱、黄酮和多糖活性成分的方法,其主要步骤为将干燥后的桑叶浸泡入乙醇或丙酮中后减压蒸发,并加入水后通过大孔树脂用乙醇或丙酮洗脱,减压蒸发得到黄酮类化合物浸膏,再通过阳、阴离子交换树脂后先用氨水后用水洗脱离子柱,然后减压蒸发得到生物碱浸膏。该方法不足之处在于,料液分离采用高速离心机,在工业上成本较高;另外先使料液通过大孔树脂分离黄酮,后过阳离子树脂提取生物碱,容易丢失贵重而含量又相对较低的活性成分1-脱氧野霉素(DNJ)(桑叶中含0.2%-0.4%)。
中国专利200810236144.1公开了另一种提取方法,将桑叶加入盐酸-乙醇-水溶液后获得粗提物,并通过大孔吸附树脂再分别用水、乙醇、盐酸溶液提取并浓缩成粉末,其具有条件温和,可重复使用的优点。但其不足之处在于,该工艺在制备生物碱时使用氯仿、正己烷等有机溶剂,有毒,且难以从产品中清除,而且不适合大规模工业生产。
中国专利200710067498.3公开了一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法,其主要原理为,将原料桑叶粉碎后用溶剂提取所需组分,再将其酸化后通过阳离子交换树脂,并用醇溶液洗脱后将洗脱液浓缩成浸膏即可得到相应提取物。其好处为,可简单的获得所分离产品,但缺点在于其生产步骤需要将提取液冷到10℃~-30℃,条件较为苛刻,而且该工艺中用到甲醇、二乙胺、三乙胺等有毒、易燃的有机溶剂,不利于清洁生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,该方法提高了产品品质,并便于工业化生产。
本发明所述的方法由以下步骤组成:
(a)将桑叶和40~80%的乙醇按料液比1∶6~40投料,混合后于50~70℃搅拌1~3h,离心过滤得到滤液A;
(b)滤渣按料液比1∶6~40加入40~80%的乙醇,混合后于50~70℃搅拌1~3h,离心过滤得到滤液B,合并滤液A和B,在50~70℃下减压浓缩制得浓缩液,同时减压回收乙醇;
(c)浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀;
(d)压滤除去沉淀,滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱,并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱;
(e)滤液加入结束后用纯净水洗,待大孔树脂柱流出液无色时,将其断开,再用0.1~0.5mol/L的氨水或含氨0.1~0.5mol/L的5%~50%乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ),将洗脱液用酸调节pH至3~5,再上阳离子树脂柱,待洗脱液上完后,用纯净水洗至流出液无色,再用10%~70%的乙醇溶液洗;
(f)乙醇洗涤后,用纯净水洗至流出液无乙醇味,再用0.1~0.5mo l/L的氨水或含氨0.1~0.5mol/L的5%~50%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,用80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质,浓缩液喷雾干燥,得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ);
(g)在步骤(e)中断开的大孔树脂柱用3%~10%的乙醇洗涤以除去胶性杂质,再用50%~70%乙醇洗脱黄酮,收集棕红色洗脱液,减压浓缩回收乙醇,浓缩液喷雾干燥,得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
在提取分离方法中,采用对1-脱氧野霉素(DNJ)具有选择性吸附作用的阳离子树脂进行两次吸附,第二次吸附后,先用乙醇溶液洗涤,这样可洗脱出大量的黏性杂质,便于得到干燥的棕黄色粉末状1-脱氧野霉素(DNJ)产品,也提高了产品含量。(此段进行了修改)
在制备过程中,加入的絮凝剂为ZTC 1+1天然澄清剂、甲壳素、101果汁澄清剂、明胶-丹宁或蛋清,均可在市面上购得;吸附分离1-脱氧野霉素(DNJ)所用的阳离子树脂是指强酸型阳离子交换树脂,为国产阳离子732树脂、美国Amberlite IR-120、Dowex-50或德国Lewatit-100;所述的大孔吸附树脂是指HPD-700、HPD-600、HPD-400、D101或AB-8大孔吸附树脂;步骤(e)中所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸等,若采用盐酸调节pH值,可采用检测Cl-的方式来判断离子柱水洗后是否达到终点,其检测试剂为硝酸银或硝酸亚汞。
本发明所述从桑叶中连续提取分离1-脱氧野霉素(DNJ)、黄酮和多糖的方法,具有以下优点:
1.本发明采用柱层析技术、膜分离技术相结合,除减压浓缩回收乙醇外,其他工艺过程均采用常温过滤,常温浓缩,有利于保持产品的生物活性;同时简化了操作步骤,有利于降低能耗;
2.本发明在生产1-脱氧野尻霉素时,采用连续多次阳离子交换柱和大孔树脂柱层析,并用乙醇洗涤以除去色素和胶性杂质,提高了产品质量,降低了产品的黏性和吸湿性,得以顺利进行喷雾干燥制成1-脱氧野霉素(DNJ)和黄酮;
3.本发明所述的分离技术,使料液依次通过阳离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱,能够首先富集最贵重而含量又极低的目标产物DNJ,以保障其不因路径过长而吸附流失;而后通过洗脱大孔树脂柱得到第二个有用产品总黄酮。通过多次实施制备样品,并用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定含量,结果表明,1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量>10%,总黄酮含量≥20%。
4.本发明除乙醇外不使用其他有机溶剂。处理柱子和膜所用的酸、碱液相互中和,通过反渗透膜再生成纯净水,可重复使用。膜截流物可制成动物饲料盐,不会造成环境污染;
本发明的实施例都是实际生产过程,事实证明该工艺过程简单、生产周期短,工艺条件安全、宽松,便于工人操作及推广为规模化工业生产。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明,但本发明并非局限在实施例范围。
实施例1
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤:
(a)称取桑叶粉20Kg置于提取罐中,加入60%的乙醇160L,于60℃下搅拌2h,离心机过滤得到滤液;
(b)滤渣加入60%的乙醇160L,按上述条件重复提取一次并过滤,合并两次得到的滤液,用真空浓缩罐在70℃下减压浓缩,并回收乙醇;
(c)浓缩液加水稀释至100L,用盐酸调节pH至3,加热至55℃保温,边搅拌边加入ZTC1+1絮凝剂A组分(1%)4L,每隔半小时搅拌一次;2小时后,加入ZTC1+1絮凝剂B组分(1%的粘胶液,用1%醋酸配制)2L,搅拌均匀,半小时后,再搅拌一次,停止保温,静置过夜;
(d)压滤除去沉淀,滤液用泵打入3根并连在一起的732阳离子树脂柱(D×H=10cm×100cm),进而流经串连在后面的1根HPD-700大孔树脂柱(D×H=10cm×100cm);
(e)滤液上完后用纯净水洗柱子,待大孔树脂柱流出液无色、无Cl-时,将其断开,用0.2mol/L的氨水洗脱732阳离子树脂柱,高效液相色谱在线监测1-脱氧野尻霉素,收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液;将该液用盐酸调节pH至4,再上1根732阳离子树脂柱(D×H=10cm×100cm),上完后,用纯净水洗至流出液无色、Cl-后,再分别用15%、25%、55%、65%的乙醇各10L洗涤;
(f)采用乙醇洗涤后,用纯净水洗至流出液无乙醇味,再用0.2mol/L的氨水洗脱732阳离子树脂柱,高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液,用80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质;浓缩液喷雾干燥,得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)产品132.8g。高效液相色谱法测定1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为11.9%;
(g)步骤(e)断开的HPD-700大孔树脂柱,先用3%的乙醇40L洗涤,再用70%乙醇进行洗脱,收集棕红色洗脱液,减压浓缩回收乙醇,浓缩液喷雾干燥,得黄棕色粉末状桑叶总黄酮234.3g。以芦丁为对照品,分光光度法测定总黄酮含量为22.7%。
实施例2
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤:
(a)称取桑叶粉10Kg置于提取罐中,加入40%的乙醇400L,于70℃下搅拌1h,离心机过滤得到滤液;
(b)滤渣加入40%的乙醇,按上述条件重复提取一次并过滤,合并两次得到的滤液,用真空浓缩罐在70℃下真空浓缩,并回收乙醇;
(c)浓缩液加水稀释至60L,用盐酸调节pH至5,加入1%甲壳素溶液5L,搅拌均匀,静置过夜;
(d)压滤除去沉淀,滤液用泵打入2根串连在一起的Dowex-50阳离子树脂柱(D×H=10cm×100cm),进而流经1根HPD-400大孔树脂柱(D×H=10cm×60cm);
(e)滤液上完后用纯净水洗柱子,待大孔树脂柱流出液无色、Cl-时,将其断开。732阳离子树脂柱用含氨0.1mol/L的50%乙醇溶液洗脱,高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液,将该液用盐酸调节pH至5,再上1根732阳离子树脂柱(D×H=10cm×100cm),上完后,用纯净水洗至流出液无Cl-、无色后,再分别用10%、30%、50%、70%的乙醇各30L依次洗涤;
(f)70%乙醇洗后,用纯净水洗至流出液无乙醇味,再用0.2mol/L的氨水洗脱732阳离子树脂柱,高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液,过80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质,浓缩液喷雾干燥,得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)产品70.8g,高效液相色谱法测定1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为13.0%;
(g)步骤(e)断开的HPD-400大孔树脂柱,先用5%的乙醇100L洗涤,再用50%乙醇洗脱,收集棕红色洗脱液,减压浓缩回收乙醇,浓缩液喷雾干燥,得黄棕色粉末状桑叶总黄酮113.6g,以芦丁为对照品,分光光度法测定总黄酮含量为21.9%。
实施例3
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤:
(a)称取桑叶粉20Kg,置于提取罐中,加入80%的乙醇400L,于50℃下搅拌2h,离心机过滤得到滤液;
(b)滤渣加入80%的乙醇200L,按上述条件重复提取一次并过滤,合并两次得到的滤液,用真空浓缩罐在50℃下真空浓缩,并回收乙醇;
(c)浓缩液加水稀释至100L,用醋酸调节pH至5,加热至55℃保温,边搅拌边加入ZTC1+1絮凝剂A组分(1%)4L,每隔半小时搅拌一次;2小时后,加入ZTC1+1絮凝剂B组分(1%的粘胶液,用1%醋酸配制)2L,搅拌均匀,半小时后,再搅拌一次,停止保温,静置过夜;
(d)压滤除去沉淀,滤液用泵打入3根串连在一起的Dowex-50阳离子树脂柱(D×H=10cm×100cm),进而流经1根串连的HPD-400大孔树脂柱(D×H=10cm×60cm);
(e)滤液上完后用纯净水洗柱子,待大孔树脂柱流出液无色时,将其断开。732阳离子树脂柱用0.5mol/L的氨水洗脱,高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液,将其用盐酸调节pH至3,再上1根732阳离子树脂柱(D×H=10cm×100cm),上完后,用纯净水洗至流出液无色、Cl-时,再分别用20%、40%、60%、70%的乙醇各40L依次洗涤;
(f)70%乙醇洗后,用纯净水洗至流出液无乙醇味,再用0.2mol/L的氨水洗脱,高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液,过80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质,浓缩液喷雾干燥,得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)产品132.2g,高效液相色谱法测定1-脱氧野尻霉素(DNJ)的含量为12.6%;
(g)步骤(e)断开的HPD-400大孔树脂柱,先用5%的乙醇40L洗涤,再用50%乙醇洗脱,收集棕红色洗脱液,减压浓缩并回收乙醇,浓缩液喷雾干燥,得黄棕色粉末状桑叶总黄酮234.2g,以芦丁为对照品,分光光度法测定总黄酮含量为23.2%。
实施例4
生产本发明所述桑叶提取物的方法,在步骤(a)中按料液比1∶8加入50%的乙醇,步骤(c)中用酸调节pH值至3,步骤(f)中用0.4mol/L的氨水洗脱,步骤(g)中用含氨0.1mol/L的5%乙醇溶液洗脱,其余与实施例1相同。
实施例5
生产本发明所述桑叶提取物的方法,在步骤(a)中按料液比为1∶40加入75%的乙醇,步骤(c)中用酸调节pH值至5,步骤(f)中用0.3mol/L的氨水洗脱,步骤(g)中用含氨0.5mol/L的50%乙醇溶液洗脱,其余与实施例1相同。
另外,阳离子树脂除了采用国产阳离子732树脂外,也可采用美国Amberlite IR-120、Dowex-50或德国Lewatit-100;所述的大孔吸附树脂除了HPD-700之外,也可采用HPD-600、HPD-400、D101或AB-8大孔吸附树脂;步骤(c)中加入的絮凝剂亦可为101果汁澄清剂、明胶-丹宁或蛋清;步骤(e)中调节pH值所用的酸亦可为硫酸、磷酸或醋酸。
以上实施例,并非对本发明的组合物的含量作任何限制,凡是根据本发明的技术实质或组合物成分或含量对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,由以下步骤组成:
(a)将桑叶和40~80%的乙醇按料液比1∶6~40投料,混合后于50~70℃搅拌1~3h,离心过滤得到滤液A;
(b)滤渣按料液比1∶6~40加入40~80%的乙醇,混合后于50~70℃搅拌1~3h,离心过滤得到滤液B,合并滤液A和B,在50~70℃下减压浓缩制得浓缩液,同时减压回收乙醇;
(c)浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀;
(d)压滤除去沉淀,滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱,并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱;
(e)滤液加入结束后用纯净水洗,待大孔树脂柱流出液无色时,将其断开,再用0.1~0.5mol/L的氨水或含氨0.1~0.5mol/L的5%~50%乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ),将洗脱液用酸调节pH至3~5,再上阳离子树脂柱,待洗脱液上完后,用纯净水洗至流出液无色,再用10%~70%的乙醇溶液洗涤;
(f)乙醇溶液洗涤后,用纯净水洗至流出液无乙醇味,再用0.1~0.5mol/L的氨水或含氨0.1~0.5mol/L的5%~50%乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,用80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质,浓缩液喷雾干燥,得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ);
(g)在步骤(e)中断开的大孔树脂柱用3%~10%的乙醇洗涤以除去胶性杂质,再用50%~70%乙醇洗脱黄酮,收集棕红色洗脱液,减压浓缩回收乙醇,浓缩液喷雾干燥,得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
2.根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,其特征在于:加入的絮凝剂为ZTC 1+1天然澄清剂、甲壳素、101果汁澄清剂、明胶-丹宁或蛋清。
3.根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,其特征在于:步骤(d)所用阳离子交换树脂柱中的阳离子树脂是指强酸型阳离子交换树脂,其为国产阳离子732树脂、美国Amberlite IR-120、Dowex-50或德国Lewatit-100;所用大孔吸附树脂柱中的大孔吸附树脂是指HPD-700、HPD-600、HPD-400、D101或AB-8大孔吸附树脂。
4.根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,其特征在于:步骤(e)所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸。
5.根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法,其特征在于:步骤(e)所述的乙醇溶液洗涤是用10%~70%乙醇浓度中的一种浓度洗涤或几种浓度间隔洗涤。
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