CN115232002B - 全水相提取莽草酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全水相提取莽草酸的方法，主要步骤为：S1、将含有莽草酸的发酵液经陶瓷膜过滤收集滤液，后经超滤膜过滤收集滤液，最后经纳滤膜过滤收集纳滤浓缩液备用；S2、S1所得纳滤浓缩液进行浓缩和脱色处理，再进行浓缩及结晶处理，得到湿粗品；S3、湿粗品用水溶解，经脱色、浓缩后结晶，干燥的得莽草酸产品。本发明通过组合膜技术的应用达到对发酵液固液分离以及原儿茶酸、没食子酸等杂质和一价无机盐的有效去除，提取过程不转相，实现在全水相提取莽草酸，避免使用乙醇等有机溶剂，该方法稳定性强，能够生产高品质莽草酸产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种发酵液中提取莽草酸的方法。
背景技术
莽草酸(3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸)，英文名称：shikimic acid(SA)，为白色针状结晶，易溶于水，难溶于石油醚等有机溶剂，气味辛酸，熔点为185-187℃。是合成抗病毒药物磷酸奥司他韦(可威)的关键中间体，也是合成吲哚衍生物、生物碱、手性药物(如抗病毒药)的重要前体，具有广泛的药用价值。
莽草酸广泛存在于多种植物中，在木兰科植物八角茴香中含量较高，市场上莽草酸主要是利用八角提取获得。目前从八角中提取莽草酸的方法主要有溶剂提取法和水提取法。专利CN100999461A公布的一种八角莽草酸提取分离技术，采用溶剂提取法生产莽草酸，该技术将八角干果粉碎后脱脂、甲醇浸出、乙酸乙酯萃取、浓缩粗结晶、氯仿甲醇混合溶剂中重结晶，虽然能够得到八角莽草酸产品，但提纯过程使用了大量不同种类的有机溶剂，溶剂回收处理量大，不利于绿色清洁生产；而专利CN107721848A公布的一种从八角中提取莽草酸的方法，该方法用纯净水加热提取，再进行柱层析和结晶，虽然能够从八角中制备得到莽草酸，但提取过程操作复杂，且受到原料来源的限制。随着制药工艺的不断升级，从植物中提取莽草酸步骤繁琐，原料来源不稳定，常受产地气候等条件影响，并不利于工业上提高莽草酸产量。
对于微生物发酵法，虽然可以解决批次产量问题，但是发酵过程存在大量色素、微生物表达和代谢的大分子等富积，这使提取生产存在工艺复杂、产量低、杂质多且难以去除等问题，最终导致生产成本高而难以产业化。
因此，目前有必要对现有提取工艺进行改进，寻找新的提取方法。
发明内容
本发明提供一种全水相提取莽草酸的方法，采用全水相进行提取，避免使用乙醇等有机溶剂，该方法稳定性强，能够生产高品质莽草酸产品。
本发明的技术方案是，一种全水相提取莽草酸的方法，包括以下步骤：
S1、将含有莽草酸的发酵液经陶瓷膜过滤收集滤液，再经超滤膜过滤收集滤液，最后经纳滤膜过滤收集纳滤浓缩液备用；
S2、S1所得纳滤浓缩液进行浓缩和脱色处理，过滤后的滤液再进行浓缩及结晶处理，得到湿粗品；
S3、湿粗品用水溶解，经脱色、过滤、浓缩后结晶，干燥得莽草酸产品。
进一步地，S1中陶瓷膜截留分子量为25-35Kda，超滤膜截留分子量为2000-3000Da，纳滤膜浓缩截留分子量为150-200Da。其中，陶瓷超滤膜优选30KDa、有机超滤膜优选2500Da、纳滤膜优选150Da。
进一步地，发酵液经陶瓷膜过滤时，向陶瓷膜浓缩物端补加清水过滤至收集滤液总体积为发酵液体积的2.5-3倍；超滤过程中加水透析，控制透析过滤后的收集滤液体积为加入滤液体积的1.0-1.3倍。
进一步地，纳滤膜处理时，对加入的滤液进行浓缩，收集的滤液为加入滤液的1/10～1/8。
进一步地，S2及S3中的浓缩均为减压热浓缩；压力控制为0.085-0.1MPa，温度为70-80℃。所用设备可以为单效、双效或三效降膜蒸发器。浓缩莽草酸浓度为200-230g/L时，优选双效降膜蒸发器；浓缩至莽草酸浓度达到400-450g/L时，优选单效降膜蒸发器；
进一步地，S2中纳滤浓缩液先浓缩至莽草酸浓度达到200-230g/L，然后调pH至2.0-3.0；后加入活性炭脱色及过滤；第二次浓缩时，控制莽草酸浓度达到400-450g/L，进行冷却结晶处理。调pH所用溶剂为盐酸、硫酸、乙酸或硝酸，优选质量浓度为50％的硫酸。
进一步地，S2中结晶时以5-8℃/h速率降温结晶，降温至0-5℃后养晶3-5h，晶浆固液分离后收集湿粗品。
进一步地，S3中湿粗品与水的质量比为1:3～5，加水后升温至70-80℃溶解，加活性炭脱色、过滤，浓缩至莽草酸浓度达到400-450g/L冷却结晶。
进一步地，S3中冷却结晶时以5-8℃/h速率降温结晶，降温至0-5℃后养晶5-8h，经固液分离收集湿晶体，于70-80℃干燥、粉碎，即得莽草酸产品。所述干燥时采用的设备为鼓风烘箱、红外隧道干燥机或沸腾干燥机，优选红外隧道干燥机。
两次结晶后对晶浆进行固液分离时，采用的设备为正压过滤器、真空抽滤器或自卸料刮刀离心机，优选自卸料刮刀离心机。
进一步地，脱色时加入活性炭，活性炭加入量为脱色液体积的2-5％。加入活性炭脱色后过滤时的过滤设备为钛棒过滤器、烛式过滤器或板框过滤器；优选钛棒过滤器。优选采用粗滤+复滤方式进行，粗滤使用精度为0.45μm钛棒、复滤使用精度为0.22μm钛棒。
本发明具有以下有益效果：
1、传统工艺采用有机溶剂法提纯莽草酸时，对前端预处理后的水相料液质量要求不高，可以依赖后期有机溶剂的提取来降低盐类杂质，但采用全水相提纯时，水是唯一的溶剂，其初始来源于发酵液，而在纯水相实现莽草酸的提取与纯化并生产高品质莽草酸产品时，主要难点是需要控制好水对NaCl等盐的溶解度，使盐溶在水中而不析出，这样就可以保证莽草酸产品的内在质量，另外就是要降低莽草酸在水中的溶解度以提高收率，两方面的平衡是本发明的重中之重。本发明尽可能在前期将杂质去除，尽量避免后期目标产物与杂质同时析出。
2、具体地，本发明采用组合膜分离技术与全水相结晶相结合的工艺提取莽草酸，发酵液经微滤实现菌体与滤液分离、超滤去除水相滤液中的大分子杂质、纳滤去除原儿茶酸等杂质和一价无机盐离子并实现莽草酸浓缩富集，水相料液得到了大幅度纯化，该工序通过对膜的截留分子量进行精确选型，实现料液质量提升与膜过滤通量的有效平衡，这是全水相结晶出质量合格的莽草酸产品的重要前提，与此同时，通过纳滤有效减少了水相料液体积，提取后处理以减压热浓缩、降温结晶、分离干燥为主，程序简单，相对传统溶剂提取工艺，本发明中所有提取工序无需使用有机溶剂，大幅降低了环保处理压力及厂区防爆压力。
3、本发明提高热浓缩液中莽草酸浓度并辅以降温结晶，充分利用莽草酸在水相溶解度、超溶解度等物性数据，通过开展结晶动力学研究，根据不同温度条件下过饱和度的差异精确控制降温速率和养晶时间等操作，实现晶体最大程度析出，而结晶体系中的NaCl等杂盐继续以溶质形式残留在水溶液中，巧妙解决了结晶难析晶及晶体中包裹杂盐等问题。
4、本发明通过上述方案，可以获得高纯度的莽草酸产品，纯度可达99％以上，且杂质含量极低(如原儿茶酸含量显著降至0.1％以下、脱氢莽草酸及没食子酸几乎没有)，该质量水平下的产品有利于后续衍生物的质量控制；且本发明工艺制备的成品质量合格，由发酵液至莽草酸产品提取收率45％-55％，满足工艺要求。
5、本发明中，所用设备简单，无需使用有机溶剂，相比溶剂提取法，本发明方法的成本可以降低，采用本发明工艺后，收率45％左右时，每公斤莽草酸产品原材料成本可降低约30元，对应的原材料成本约140元/Kg，若收率进一步提高，成本将可以进一步降低，非常适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
图2为实施例1所得产品的HPLC检测谱图。
图3为实施例2所得产品的HPLC检测谱图。
图4为实施例3所得产品的HPLC检测谱图。
图5为对比例1-4所得产品的HPLC检测谱图。
图6为对比例1-5所得产品的HPLC检测谱图。
图7为对比例2-2所得产品的HPLC检测谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
(1)取发酵液10L(莽草酸含量70g/L)，使用截留分子量为35KDa的陶瓷膜对发酵液进行固液分离并透析，过滤过程中向浓缩物端连续补加水过滤，共收集第一滤液30L，然后使用截留分子量为3000Da的超滤膜对第一滤液进行超滤并加水透析，收集第二滤液39L，再次使用截留分子量为200Da的纳滤膜对第二滤液进行纳滤浓缩，收集第三滤液3.9L，此时，组合膜过滤工序莽草酸收率92％，第三滤液莽草酸含量约165g/L。
(2)使用双效降膜蒸发器于80℃下对第三滤液进行减压热浓缩，控制真空度0.095MPa，将料液莽草酸浓度升至230g/L，停止浓缩，得一次浓缩液约2.78L，将一次浓缩转入脱色罐，保温搅拌，使用浓硫酸调浓缩液pH至3.0，向浓缩液中加入139g活性炭，脱色30min，过滤并少量顶洗得一次脱色液约2.85L，该工序莽草酸收率约为98％。
(3)使用单效降膜蒸发器于80℃下对一次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.095MPa，将料液莽草酸浓度升至450g/L，停止浓缩，得二次浓缩液约1.43L，将二次浓缩液转入粗品结晶罐降温结晶，以8℃/h降温至5℃，养晶5h，分离，得湿粗品578g，湿粗品干燥失重15％，莽草酸含量96.5％，该工序莽草酸收率约为75％。
(4)将莽草酸湿粗品与水按质量比1:5投入溶解罐，升温至80℃使体系完全溶解得溶解液3.2L，加入64g活性炭，保温脱色30min，过滤并少量顶洗，收集二次脱色液约3.3L，该工序莽草酸收率约为98％。
(5)使用单效降膜蒸发器于80℃下对二次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.095MPa，将料液莽草酸浓度升至450g/L，停止浓缩，得三次浓缩液约1.06L，将三次浓缩液转入重结晶罐降温结晶，以8℃/h降温至5℃，养晶8h，分离，80℃鼓风干燥、粉碎、包装，得莽草酸产品358g，产品HPLC检测谱图如图2所示、质量结果如下表1所示，该工序莽草酸收率约为75％。
表1
本实施例中，发酵液用量为10L，中间体周转量较小，降膜浓缩器、溶解罐、结晶罐等设备均采用精密玻璃设备。
实施例2
(1)取发酵液500L(莽草酸含量72g/L)，使用截留分子量为25KDa的陶瓷膜对发酵液进行固液分离并透析，收集第一滤液1250L，然后使用截留分子量为2000Da的超滤膜对第一滤液进行超滤并加水透析，收集第二滤液1250L，再次使用截留分子量为150Da的纳滤膜对第二滤液进行纳滤浓缩，收集第三滤液约160L，此时，组合膜过滤工序莽草酸收率80％，第三滤液莽草酸含量约180g/L。
(2)使用双效降膜蒸发器于70℃下对第三滤液进行减压热浓缩，控制真空度0.085MPa，将料液莽草酸浓度升至200g/L，停止浓缩，得一次浓缩液约144L，将一次浓缩转入脱色罐，保温搅拌，使用浓硫酸调浓缩液pH至2.0，向浓缩液中加入2.88Kg活性炭，脱色30min，过滤并少量顶洗得一次脱色液约150L，该工序莽草酸收率约为98.5％；
(3)使用单效降膜蒸发器于70℃下对一次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.085MPa，将料液莽草酸浓度升至400g/L，停止浓缩，得二次浓缩液约71L，将二次浓缩液转入粗品结晶罐降温结晶，以5℃/h降温至0℃，养晶3h，离心分离，得湿粗品22.79Kg，湿粗品干燥失重12％，莽草酸含量99％，该工序莽草酸收率约为70％；
(4)将莽草酸湿粗品与水按质量比1:3投入溶解罐，升温至70℃使体系完全溶解得溶解液82L，加入1.64Kg活性炭，保温脱色30min，过滤并少量顶洗，收集二次脱色液约85L，该工序莽草酸收率约为98％；
(5)使用单效降膜蒸发器于70℃下对二次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.085MPa，将料液莽草酸浓度升至400g/L，停止浓缩，得三次浓缩液约48.7L，将三次浓缩液转入重结晶罐降温结晶，以5℃/h降温至0℃，养晶5h，分离，70℃红外隧道干燥、粉碎、包装，得莽草酸产品13.69Kg，产品HPLC检测谱图如图3，质量结果如表2所示，该工序莽草酸收率约为70％。
表2
实施例3
(1)取发酵液10m3(莽草酸含量70g/L)，使用截留分子量为30KDa的陶瓷膜对发酵液进行固液分离并透析，收集第一滤液28m3，然后使用截留分子量为2500Da的超滤膜对第一滤液进行超滤并加水透析，收集第二滤液35m3，再次使用截留分子量为170Da的纳滤膜对第二滤液进行纳滤浓缩，收集第三滤液约3.9m3，此时，组合膜过滤工序莽草酸收率88％，第三滤液莽草酸含量约158g/L；
(2)使用双效降膜蒸发器于75℃下对第三滤液进行减压热浓缩，控制真空度0.09MPa，将料液莽草酸浓度升至220g/L，停止浓缩，得一次浓缩液约2.77m3，将一次浓缩转入脱色罐，保温搅拌，使用浓硫酸调浓缩液pH至2.5，向浓缩液中加入110Kg活性炭，脱色30min，过滤并少量顶洗得一次脱色液约2.85m3，该工序莽草酸收率约为99％；
(3)使用单效降膜蒸发器于75℃下对一次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.09MPa，将料液莽草酸浓度升至425g/L，停止浓缩，得二次浓缩液约1.44m3，将二次浓缩液转入粗品结晶罐降温结晶，以6℃/h降温至2℃，养晶4h，离心分离，得湿粗品522Kg，湿粗品干燥失重13％，莽草酸含量98％，该工序莽草酸收率约为73％；
(4)将莽草酸湿粗品与水按质量比1:4投入溶解罐，升温至75℃使体系完全溶解得溶解液2.4m3，加入96Kg活性炭，保温脱色30min，过滤并少量顶洗，收集二次脱色液约2.5m3，该工序莽草酸收率约为98.8％；
(5)使用单效降膜蒸发器于75℃下对二次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.09MPa，将料液莽草酸浓度升至425g/L，停止浓缩，得三次浓缩液约1.04m3，将三次浓缩液转入重结晶罐降温结晶，以6℃/h降温至2℃，养晶7h，分离，75℃红外隧道干燥、粉碎、包装，得莽草酸产品321.5Kg，产品HPLC检测谱图如图4、质量结果如表3所示，该工序莽草酸收率约为73％。
表3
实施例4：
(1)取发酵液10m3(莽草酸含量68g/L)，使用截留分子量为30KDa的陶瓷膜对发酵液进行固液分离并透析，收集第一滤液28.1m3，然后使用截留分子量为2500Da的超滤膜对第一滤液进行超滤并加水透析，收集第二滤液35m3，再次使用截留分子量为150Da的纳滤膜对第二滤液进行纳滤浓缩，收集第三滤液约3.8m3，此时，组合膜过滤工序莽草酸收率86％，第三滤液莽草酸含量约154g/L；
(2)使用双效降膜蒸发器于70℃下对第三滤液进行减压热浓缩，控制真空度0.095MPa，将料液莽草酸浓度升至210g/L，停止浓缩，得一次浓缩液约2.78m3，将一次浓缩转入脱色罐，保温搅拌，使用浓硫酸调浓缩液pH至2.5，向浓缩液中加入105Kg活性炭，脱色30min，过滤并少量顶洗得一次脱色液约2.86m3，该工序莽草酸收率约为98.8％；
(3)使用单效降膜蒸发器于70℃下对一次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.095MPa，将料液莽草酸浓度升至440g/L，停止浓缩，得二次浓缩液约1.31m3，将二次浓缩液转入粗品结晶罐降温结晶，以6.5℃/h降温至2℃，养晶4.5h，离心分离，得湿粗品500Kg，湿粗品干燥失重13.5％，莽草酸含量97.8％，该工序莽草酸收率约为75％；
(4)将莽草酸湿粗品与水按质量比1:4投入溶解罐，升温至78℃使体系完全溶解得溶解液2.35m3，加入95Kg活性炭，保温脱色30min，过滤并少量顶洗，收集二次脱色液约2.5m3，该工序莽草酸收率约为99％；
(5)使用单效降膜蒸发器于78℃下对二次脱色液进行减压热浓缩，控制真空度0.09MPa，将料液莽草酸浓度升至430g/L，停止浓缩，得三次浓缩液约1m3，将三次浓缩液转入重结晶罐降温结晶，以6.5℃/h降温至0℃，养晶7h，分离，75℃红外隧道干燥、粉碎、包装，得莽草酸产品315Kg，产品质量结果如表4所示，该工序莽草酸收率约为74％。
表4
对比例1
对比例1-1采用截留分子量20KDa及20KDa以下的陶瓷膜对发酵液进行过滤时，平均过滤通量＜15L/㎡*h，远低于实施例中的陶瓷膜平均过滤通量50L/㎡*h以上，同等膜面积和过滤收率条件下，过滤时长是实施例的3倍以上，不具生产可行性。
对比例1-2采用截留分子量35KDa以上的陶瓷膜对发酵液进行过滤时，膜孔径会显著增大，初期过滤通量满足生产要求，由于膜孔径增大，过滤过程中发酵液中的菌体被膜面高速剪切为细小碎片，会出现细小碎片絮积在膜孔内部及周围堵塞膜孔，引起通量急剧下降，最终造成膜芯全部堵塞，且有部分碎片粒子进入滤液中引起滤液质量下降，因此不具生产可行性。
对比例1-3采用截留分子量25KDa的陶瓷膜对发酵液进行过滤时，过滤通量满足要求，当补水过滤的滤液体积达不到2.5倍时，陶瓷膜过滤工序的莽草酸收率将不到保证，即加水透析量越少，莽草酸进入到滤液的量也越少，滤液中莽草酸的收率则越低。提取成本将会大幅上升，所生产产品无利润可言，因此不具有生产可行性。
对比例1-4采用截留分子量25KDa的陶瓷膜对发酵液进行过滤，取消超滤工序，直接采用截留分子量150Da的纳滤膜对微滤液进行纳滤浓缩，其它工艺过程同实施例4，所得产品HPLC检测谱图如图5所示、质量结果如表5所示，产品质量达不到标准要求。
表5
对比例1-5采用截留分子量25KDa的陶瓷膜对发酵液进行过滤，采用截留分子量2500Da的超滤膜对微滤液进行超滤，取消纳滤浓缩工序，其它工艺过程同实施例4，所得产品HPLC检测谱图如图6所示、质量结果如表6所示，产品质量达不到标准要求。
表6
对比例2
对比例2-1
除控制粗品结晶、重结晶的结晶浓度＜400g/L这一条件外，其它工艺过程同实施例4，结果表明：结晶体系析出的莽草酸与结晶浓度呈正相关性，浓度越高，收率越高，浓度越低，收率越低，当结晶浓度＜180g/L时几乎得不到莽草酸固体产品(20℃时莽草酸在水中溶解度为180g/L)。当收率无法稳定时，成本将得不到有效控制，不具生产可行性。
特别说明：结晶体系析出的莽草酸与结晶浓度呈正相关性，浓度越高，收率越高，浓度越低，收率越低，当结晶浓度＜180g/时几乎得不到莽草酸固体产品，因为莽草酸在水中呈现极易溶解的状态，20℃时莽草酸在水中溶解度为180g/L，基于此，从常识角度判断水相结晶是不可能实现的，这也是到目前为止在水相直接结晶莽草酸研究偏少的原因。但是本发明中，通过提高莽草酸的结晶浓度，与溶解度相比增大浓度差以实现对结晶动力的控制，克服了常识认知方面的不足，这是重要的创新点。
对比例2-2
除控制粗品结晶、重结晶的结晶浓度＞450g/L这一条件外，其它工艺过程同实施例4，结果表明：结晶物系析出大量莽草酸，结晶收率高于实施例，但是莽草酸析出的同时有少量二价硫酸盐析出，对产品纯度影响负面，另外由于浓度大幅提高，结晶体系的黏稠度大幅增加，体系的流态显著变差，不利于搅拌和放料等后续操作。该对比例所得产品HPLC检测谱图如图7所示、质量结果如表7所示，产品质量达不到标准要求。
表7
上述对比例中，发酵液用量为10L，中间体周转量较小，降膜浓缩器、溶解罐、结晶罐等设备均采用精密玻璃设备。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种全水相提取莽草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将含有莽草酸的发酵液经陶瓷膜过滤收集滤液，再经超滤膜过滤收集滤液，最后经纳滤膜过滤收集纳滤浓缩液备用；陶瓷膜截留分子量为25-35KDa，超滤膜截留分子量为2000-3000Da，纳滤膜浓缩截留分子量为150-200Da；发酵液经陶瓷膜过滤时，向陶瓷膜浓缩物端补加清水过滤至收集滤液总体积为发酵液体积的2.5-3倍；超滤过程中加水透析，控制透析过滤后的收集滤液体积为加入滤液体积的1.0-1.3倍；纳滤膜处理时，对加入的滤液进行浓缩，收集纳滤浓缩液，浓缩液体积为加入滤液体积的1/10～1/8；
S2、S1所得纳滤浓缩液进行浓缩到200-230g/L，然后调pH至2.0-3.0；后加入活性炭脱色及过滤，过滤后的滤液再进行浓缩控制莽草酸浓度达到400-450g/L，进行冷却结晶处理，得到湿粗品；
S3、湿粗品用水溶解，湿粗品与水的质量比1:3~5，加水后升温至70-80℃溶解，加活性炭脱色、过滤，浓缩至莽草酸浓度达到400-450g/L，冷却结晶，干燥得莽草酸产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S2及S3中的浓缩均为减压热浓缩；压力控制为0.085-0.1MPa，温度为70-80℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S2中结晶时以5-8℃/h速率降温结晶，降温至0-5℃后养晶3-5h，晶浆固液分离后收集湿粗品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S3中冷却结晶时以5-8℃/h速率降温结晶，降温至0-5℃后养晶5-8h，经固液分离收集湿晶体，于70-80℃干燥、粉碎，即得莽草酸产品。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于：S2及S3中脱色时加入活性炭，活性炭加入量为脱色液体积的2-5%。
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