CN111171097A - 发酵生产腺苷的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产腺苷的分离纯化方法,该方法采用微滤分离技术去除发酵液中的菌体,再用超滤分离去除微滤液中的大分子蛋白等杂质,然后用大孔树脂吸附超滤液中的腺苷,并用酸洗脱,串联阴离子交换树脂去除杂质并中和pH,最后浓缩、脱色、结晶分离得到腺苷成品。本发明的提取纯化工艺除杂效果好,一次结晶就能够获得合成产品,成品腺苷液相纯度≥99.5%,外标含量≥99.5%,总收率≥80%,且不需要硅藻土等助滤剂过滤,无固废产生,安全环保,具有良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,尤其是一种发酵生产腺苷的分离纯化方法。
背景技术
腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷,是由腺嘌呤的N-9与D-核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物,其磷酸酯为腺苷酸。可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸,参与心肌能量代谢,同时还参与扩张冠脉血管,增加血流量。腺苷对心血管系统和机体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体,也是水解生成腺嘌呤的底物。
腺苷的生产方法总的来说可分为化学合成法和生物合成法两种。化学合成法以腺苷衍生物、D-核糖、嘌呤等为起始原料,大部分原料价格较贵,工业化生产成本较高。生物合成法以葡萄糖为原料,利用微生物进行代谢生产腺苷,具有成本上的优势,是腺苷工业化生产的发展方向。然而,现有技术中,从腺苷发酵液中分离纯化腺苷的方法收率低、纯度低,过滤产生固体废弃物,环保压力大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产腺苷的分离纯化方法,该方法除杂效果好,产品纯度高,收率高,且不需要硅藻土等助滤剂过滤,无固废产生,安全环保,具有良好的经济效益。
本发明的技术方案是这样实现的:一种发酵生产腺苷的分离纯化方法,它包括如下步骤:
(1)微滤:腺苷发酵液通过孔径为100~200nm的微滤膜,去除发酵液中的菌体、不溶物以及大分子蛋白等杂质,操作压力0.1~0.3MPa,操作温度50~80℃,浓缩倍数2~5倍,顶洗水量为进料发酵液体积1~3倍;
(2)超滤:将微滤液降温至20~40℃,使用截留分子量为3500~5000的滤膜对微滤液进行超滤,去除大分子蛋白和色素等杂质,操作压力0.5~1.0MPa,温度20~40℃,浓缩倍数5~20倍,顶洗水量为进料料液体积的1~2倍;
(3)树脂纯化:用大孔树脂吸附超滤液中的腺苷,排除杂质,提升腺苷的纯度,再用酸溶液将腺苷产品从大孔树脂上洗脱下来,洗脱液串联阴离子交换树脂去除杂质阴离子,同时中和料液pH值;树脂用量为折纯腺苷的50~100倍;
(4)真空浓缩:用真空浓缩方式对离交液进行浓缩,使腺苷含量达到50~60g/L,浓缩温度60~80℃,真空度-0.08~-0.1MPa;
(5)脱色:按腺苷折纯量的0.5~1.5%加入活性碳进行脱色,脱色温度70~80℃,脱色时间15~30min;
(6)结晶分离:脱色液继续浓缩至100~150g/L,降温至0~5℃,保冷4~6h,使得腺苷结晶析出,然后过滤分离,得到含量和纯度均在99.5%以上的腺苷成品。
实施方法中的步骤(1)和(2)为发酵液菌体分离步骤,目的是去除菌体、不溶性杂质,大分子蛋白和色素等,提升料液中腺苷纯度。
所述步骤(1)中的滤膜为无机陶瓷膜、聚砜膜,孔径为100~200nm。
所述步骤(2)中的滤膜为卷式超滤膜,可以是聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、聚偏二氟乙烯膜。
上述实施方法中的步骤(3)为腺苷粗制步骤,目的在于进一步去除料液中的其它核苷杂质以及盐分,大孔树脂能专一性吸附腺苷以及其它少量分子量为300左右的杂质,酸溶液洗脱后串联阴离子交换树脂,进一步去除盐分并中和料液pH值,同时使树脂得到再生。
所述步骤(3)中的大孔性树脂为苯乙烯系骨架结构的树脂,如SP850、HP20等;阴离子交换树脂为20系列的季胺基强碱性阴离子交换树脂,或30系列伯、仲、叔胺基的弱碱性阴离子交换树脂,或大孔弱酸性树脂。
所述步骤(3)中洗脱所用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、醋酸等无机酸。
所述步骤(3)中配置的酸性洗脱液pH范围为0.5~2。
上述实施方法中的步骤(5)和(6)为腺苷精制步骤,通过活性碳脱色提高产品色度,通过结晶进一步提升成品的含量和纯度。
所述步骤(5)中的活性碳为粉状活性碳,用量为腺苷折纯量的0.5~1.5%。
本发明和现有技术相比的优点为:
本发明是一种可应用于工业化生产的腺苷发酵液提取纯化工艺,将膜分离技术、树脂纯化和结晶技术结合在一起,工艺操作简单,产品质量稳定,所得腺苷成品液相纯度≥99.5%,外标含量≥99.5%,总收率≥80%,一次结晶就能够获得合成产品,不需要硅藻土等助滤剂过滤,不产生固废,安全环保,具有良好的经济效益和市场前景。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚,下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述;但不构成对本发明的任何限制。
实施例1:将25L腺苷发酵液用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤,操作压力0.15MPa,浓缩1倍后,开始加水透析,透析水量为50L。取10L澄清的微滤液冷却至室温,用截留分子量为5000Da的卷式超滤膜进行分离,操作压力1.0MPa,浓缩5倍后,加入10L透析水顶洗。超滤液以3L/h的速度通过SP850型大孔树脂进行吸附,树脂用量为3L,进料完毕用3L水洗涤树脂柱,然后用pH=1的盐酸溶液进行洗脱,洗脱液直接串联201型阴离子树脂柱,树脂装量为3L。收集流出液真空浓缩至腺苷含量50g/L,加入6.5g粉末活性碳加热至80℃搅拌15min,过滤脱色,脱色液无色澄清,继续真空浓缩至腺苷含量100g/L,降温至4℃,保冷4H结晶,过滤分离得到腺苷成品54.1g,颜色白色,液相纯度99.50%,外标含量99.68%。总收率为80.75%。
实施例2:将30L腺苷发酵液用孔径100nm的陶瓷膜进行微滤,操作压力0.15MPa,浓缩1倍后,开始加水透析,透析水量为60L。取15L澄清的微滤液冷却至室温,用截留分子量为5000Da的卷式超滤膜进行分离,操作压力1.0MPa,浓缩8倍后,加入20L透析水顶洗。超滤液以4L/h的速度通过WD25-1型大孔树脂进行吸附,树脂用量为4L,进料完毕用4L水洗涤树脂柱,然后用pH=1的硫酸溶液进行洗脱,洗脱液直接串联301型阴离子树脂柱,树脂装量为4L。收集流出液真空浓缩至腺苷含量50g/L,加入8g粉末活性碳加热至80℃搅拌15min,过滤脱色,脱色液无色澄清,继续真空浓缩至腺苷含量120g/L,降温至4℃,保冷4H结晶,过滤分离得到腺苷成品78.6g,颜色白色,液相纯度99.56%,外标含量99.58%。总收率为83.04%。
实施例3:将20L腺苷发酵液用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤,操作压力0.15MPa,浓缩1倍后,开始加水透析,透析水量为40L。取10L澄清的微滤液冷却至室温,用截留分子量为3500Da的卷式超滤膜进行分离,操作压力1.0MPa,浓缩5倍后,加入10L透析水顶洗。超滤液以3L/h的速度通过HP20型大孔树脂进行吸附,树脂用量为3L,进料完毕用2L水洗涤树脂柱,然后用pH=1的盐酸溶液进行洗脱,洗脱液直接串联D113型阴离子树脂柱,树脂装量为3L。收集流出液真空浓缩至腺苷含量55g/L,加入5.5g粉末活性碳加热至80℃搅拌15min,过滤脱色,脱色液无色澄清,继续真空浓缩至腺苷含量100g/L,降温至4℃,保冷4H结晶,过滤分离得到腺苷成品53.2g,颜色白色,液相纯度99.55%,外标含量99.61%。总收率为81.41%。
Claims (6)
1.一种发酵生产腺苷的分离纯化方法,它包括如下步骤:
(1)微滤:腺苷发酵液通过孔径为100~200nm的微滤膜,去除发酵液中的菌体、不溶物以及大分子蛋白等杂质,操作压力0.1~0.3MPa,操作温度50~80℃,浓缩倍数2~5倍,顶洗水量为进料发酵液体积1~3倍;
(2)超滤:将微滤液降温至20~40℃,使用截留分子量为3500~5000的滤膜对微滤液进行超滤,去除大分子蛋白和色素等杂质,操作压力0.5~1.0MPa,温度20~40℃,浓缩倍数5~20倍,顶洗水量为进料料液体积的1~2倍;
(3)树脂纯化:用大孔树脂吸附超滤液中的腺苷,排除杂质,提升腺苷的纯度,再用酸溶液将腺苷产品从大孔树脂上洗脱下来,洗脱液串联阴离子交换树脂去除杂质阴离子,同时中和料液pH值;树脂用量为折纯腺苷的50~100倍;
(4)真空浓缩:用真空浓缩方式对离交液进行浓缩,使腺苷含量达到50~60g/L,浓缩温度60~80℃,真空度-0.08~-0.1MPa;
(5)脱色:按腺苷折纯量的0.5~1.5%加入活性碳进行脱色,脱色温度70~80℃,脱色时间15~30min;
(6)结晶分离:脱色液继续浓缩至100~150g/L,降温至0~5℃,保冷4~6h,使得腺苷结晶析出,然后过滤分离,得到含量和纯度均在99.5%以上的腺苷成品。
2.根据权利要求1所述的发酵生产腺苷的分离纯化方法,其特征在于:所述步骤(1)中的滤膜为无机陶瓷膜、聚砜膜,孔径为100~200nm。
3.根据权利要求2所述的发酵生产腺苷的分离纯化方法,其特征在于:所述步骤(2)中的滤膜为卷式超滤膜,可以是聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、聚偏二氟乙烯膜。
4.根据权利要求3所述的发酵生产腺苷的分离纯化方法,其特征在于:所述步骤(3)中的大孔性树脂为苯乙烯系骨架结构的树脂,如SP850、HP20;阴离子交换树脂为20系列的季胺基强碱性阴离子交换树脂,或30系列伯、仲、叔胺基的弱碱性阴离子交换树脂,或大孔弱酸性树脂。
5.根据权利要求4所述的发酵生产腺苷的分离纯化方法,其特征在于:所述步骤(3)中洗脱所用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、醋酸等无机酸。
6.根据权利要求5所述的发酵生产腺苷的分离纯化方法,其特征在于:所述步骤(3)中配置的酸性洗脱液pH范围为0.5~2。
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