CN110408661A - 一种发酵生产腺嘌呤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了种发酵生产腺嘌呤的方法,它依次包括发酵培养、粗品提取和精品提取步骤;所述的发酵培养是将腺嘌呤的种子接种到培养基上,经过发酵,制得含有腺嘌呤的腺嘌呤发酵液;所述的粗品提取是将腺嘌呤发酵液依次进行发酵液灭活、固液分离、滤液浓缩、吸附洗脱、洗脱液浓缩、降温结晶步骤,制得腺嘌呤粗品。所述的精品提取是将腺嘌呤粗品加纯化水溶解,入活性炭脱色,结晶干燥,制得腺嘌呤精品。该方法原料来源广,生产成本低,工艺技术成熟,绿色环保,产品纯度高,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,尤其是一种发酵生产腺嘌呤的方法。
背景技术
腺嘌呤,化学名为6-氨基嘌呤,是核酸的重要组成部分,也是许多医药原料的关键中间体,目前主要用于生产抗艾滋病药物替诺福韦酯和抗乙肝药物阿德福韦酯等。
目前腺嘌呤的主要生产方法有全化学合成法,以及以发酵产腺苷为原料结合化学合成裂解制备腺嘌呤。这两个方法工艺路线长,且使用大量有机溶剂,存在生产制造成本偏高、安全隐患大的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产腺嘌呤的方法,该方法原料来源广,生产成本低,工艺技术成熟,绿色环保,产品纯度高,适合工业化生产。
本发明的技术方案是这样实现的:一种发酵生产腺嘌呤的方法,它依次包括发酵培养、粗品提取和精品提取步骤;所述的发酵培养是将腺嘌呤的种子接种到培养基上,经过发酵,制得含有腺嘌呤的腺嘌呤发酵液;其特征在于:所述的培养基包含如下组分:葡萄糖10-30g/L,玉米浆20-100g/L,其他氮源20-80g/L,尿素1-5g/L,甘氨酸1-5g/L,硫酸镁0.5-1.5g/L,磷酸氢二钾2-10g/L,磷酸二氢钾2-10g/L,氯化钙1-5g/L,谷氨酸钠3-10g/L,微量元素5-16g/L,消泡剂0.15-0.5ml/L。
进一步,所述的培养基包含如下组分:葡萄糖15-25g/L,玉米浆40-80g/L,其他氮源30-60g/L,尿素2-4g/L,甘氨酸2-4g/L,硫酸镁0.8-1.2g/L,磷酸氢二钾4-8g/L,磷酸二氢钾4-8g/L,氯化钙2-4g/L,谷氨酸钠5-8g/L,微量元素8-12g/L,消泡剂0.25-0.4ml/L。
进一步,所述的其他氮源包括黄豆粉、大豆蛋白胨、豆粕粉、植物多肽粉、酵母粉中的一种或多种;所述的植物多肽粉是以1∶1质量比的玉米蛋白、大米蛋白为混合原料,经过水解后干燥获得的培养基原料,要求总氮不低于11.0%,灰分不高于12.5%,水分不高于9.0%。
进一步,所述的酵母粉优选啤酒酵母粉或者面包酵母粉。
进一步,所述的微量元素包含硫酸亚铁、钼酸钠、蛋氨酸、组氨酸、丙氨酸。
进一步,所述的粗品提取包括如下步骤:
S1、发酵液灭活:将腺嘌呤发酵液升温至60-95℃维持1-5小时,制得灭活的腺嘌呤发酵液;
S2、固液分离:将灭活的腺嘌呤发酵液采用过滤设备进行固液分离,制得腺嘌呤滤液;
S3、滤液浓缩:将腺嘌呤滤液使用超滤膜进行超滤浓缩,制得腺嘌呤滤液浓相;
S4、吸附洗脱:将腺嘌呤滤液浓相使用离子交换树脂吸附,再使用洗脱剂进行洗脱,收集洗脱液;
S5、洗脱液浓缩:将洗脱液使用超滤膜进行超滤浓缩,浓缩至洗脱液中腺嘌呤含量为10-50g/L;制得腺嘌呤洗脱浓相;
S6、降温结晶:将腺嘌呤洗脱浓相降温至0-10℃,结晶干燥,制得腺嘌呤粗品。
进一步,在粗品提取的S2步骤中,所述的过滤设备为陶瓷膜过滤器、碟片离心机、卧螺离心机或者板框压滤机;采用陶瓷膜过滤器,使用50-500nm的陶瓷膜,操作压力0.1-0.4MPa,温度60-90℃;采用板框进行固液分离,需要加入硅藻土作为助滤剂,硅藻土加量为发酵液体积的2-10%(w/v),过滤压力在0.05-0.4Mpa,过滤温度60-90℃。
进一步,在粗品提取的S3步骤中,使用分子量截留在3500-10000Da的超滤膜进行过滤,操作温度在10-45℃,压力0.5-1.5Mpa,最好使用卷式超滤膜芯,膜芯材料是聚醚砜或者聚丙烯腈。
进一步,在粗品提取的S4步骤中,所述的离子交换树脂为凝胶型201×4、凝胶型001×7、大孔型D113或者大孔型D213中的一种;所述的洗脱剂为氢氧化钠溶液、氨水溶液或者盐酸溶液中的一种。
进一步,所述的精品提取包括如下步骤:将腺嘌呤湿粗品加纯化水溶解,得腺嘌呤粗品水溶液,在腺嘌呤粗品水溶液加入活性炭脱色,再将脱色后的腺嘌呤水溶液降温至0-10℃,结晶干燥,制得腺嘌呤精品。
进一步,所述的腺嘌呤粗品水溶液浓度为10-50g/L,在腺嘌呤粗品水溶液加入3-10%(w/w)活性炭。
本发明和现有技术相比的优点为:
(1)发酵配方中的原料来源广泛且容易,价格低廉,适合工业化生产。
(2)工艺路线不涉及有机溶媒使用,安全隐患小,且设备投资较少,工艺方法绿色环保。
(3)工艺路线使用离心分离、膜分离和树脂分离技术,产品纯度高、含量高。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚,下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1:将腺嘌呤的种子接种到如下培养基中,葡萄糖15g/L,玉米浆100g/L,黄豆粉10g/L,酵母粉5g/L,植物多肽粉10g/L,豆粕粉25g/L,尿素1g/L,甘氨酸5g/L,丙氨酸2g/L,硫酸亚铁1.5g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钾5g/L,磷酸氢二铵8g/L,氯化钙2g/L,谷氨酸钠10g/L,蛋氨酸1.5g/L,组氨酸0.5g/L,消泡剂0.4ml/L,培养温度34℃,空气流量0.3-0.8VVM,发酵周期45小时,检测腺嘌呤含量12.5g/L。
实施例2:将腺嘌呤的种子接种到如下培养基中,葡萄糖30g/L,玉米浆45g/L,黄豆粉5g/L,植物多肽粉10g/L,大豆蛋白胨15g/L,豆粕粉20g/L,尿素4g/L,甘氨酸2g/L,丙氨酸5g/L,硫酸亚铁0.5g/L,钼酸钠0.5g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钾2g/L,磷酸氢二铵2g/L,氯化钙5g/L,谷氨酸钠3g/L,蛋氨酸5g/L,组氨酸5g/L,消泡剂0.3ml/L,培养温度34℃,空气流量0.3-0.8VVM,发酵周期48小时,检测腺嘌呤含量14.3g/L。
实施例3:将腺嘌呤的种子接种到如下培养基中,葡萄糖10g/L,玉米浆25g/L,黄豆粉20g/L,酵母粉15g/L,大豆蛋白胨15g/L,豆粕粉20g/L,尿素3g/L,甘氨酸3/L,丙氨酸3g/L,钼酸钠0.5g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钾8g/L,磷酸氢二铵6g/L,氯化钙2g/L,谷氨酸钠3g/L,蛋氨酸2g/L,组氨酸2g/L,消泡剂0.25ml/L,培养温度34℃,空气流量0.3-0.8VVM,发酵周期46小时,检测腺嘌呤含量13.8g/L。
实施例4:取实例2的发酵液,升温至95℃,维持2小时灭活,加入发酵液体积5%的硅藻土使用板框在80℃分离,分离压力0.3MPa,收集板框滤液使用10000Da超滤膜芯在20-25℃、0.7-0.9MPa进行超滤,超滤透析液使用D213树脂吸附后,使用氨水洗脱,收集洗脱液浓缩至50g/L后降温至4℃结晶,分离结晶液获得腺嘌呤湿粗品,HPLC检测腺嘌呤纯度98.7%,含量(以干计)94.4%。
实施例5:取实例2的发酵液,升温至80℃,维持4小时灭活,加入发酵液体积7.5%的硅藻土使用板框在75℃分离,分离压力0.4MPa,收集板框滤液使用3500Da超滤膜芯在20-30℃、0.7-1.5MPa进行超滤,超滤透析液使用D213树脂吸附后,使用氢氧化钠溶液洗脱,收集洗脱液浓缩至30g/L后降温至10℃结晶,分离结晶液获得腺嘌呤湿粗品,HPLC检测腺嘌呤纯度98.5%,含量(以干计)95.8%。
实施例6:取实例2的发酵液,升温至90℃,维持2.5小时灭活,使用碟片离心机在40℃分离,收集离心机清液使用10000Da超滤膜芯在20-25℃、1.0-1.5MPa进行超滤,超滤透析液使用001*7树脂吸附后,使用盐酸洗脱,收集洗脱液浓缩至25g/L后降温至10℃结晶,分离结晶液获得腺嘌呤湿粗品,HPLC检测腺嘌呤纯度97.8%,含量(以干计)95.4%。
实施例7:取实例3的发酵液,升温至65℃,维持5小时灭活,在70-80℃下使用200nm陶瓷膜分离,分离压力0.3MPa,收集滤液使用3500Da超滤膜芯在10-15℃、0.9-1.5MPa进行超滤,超滤透析液使用201*4树脂吸附后,使用氢氧化钠溶液洗脱,收集洗脱液浓缩至50g/L后降温至8℃结晶,分离结晶液获得腺嘌呤湿粗品,HPLC检测腺嘌呤纯度98.3%,含量(以干计)96.4%。
实施例8:取实例1的发酵液,升温至75℃,维持4.5小时灭活,使用卧螺离心机在45℃分离,收集离心机上清液使用10000Da超滤膜芯在25-35℃、1.0-1.5MPa进行超滤,超滤透析液使用D113树脂吸附后,使用盐酸洗脱,收集洗脱液浓缩至40g/L后降温至10℃结晶,分离结晶液获得腺嘌呤湿粗品,HPLC检测腺嘌呤纯度98.8%,含量(以干计)97.0%。
实施例9:取实例5的腺嘌呤湿粗品,按25g/L浓度溶解后,加入10%(w/w)活性炭脱色后,在4℃结晶,分离结晶液获得湿成品后得到腺嘌呤成品,外观白色,HPLC检测腺嘌呤纯度99.85%,含量99.4%。
实施例10:取实例7的腺嘌呤湿粗品,按50g/L浓度溶解后,加入3%(w/w)活性炭脱色后,在10℃结晶,分离结晶液获得湿成品后得到腺嘌呤成品,外观白色,HPLC检测腺嘌呤纯度99.93%,含量99.8%。
Claims (11)
1.一种发酵生产腺嘌呤的方法,它依次包括发酵培养、粗品提取和精品提取步骤;所述的发酵培养是将腺嘌呤的种子接种到培养基上,经过发酵,制得含有腺嘌呤的腺嘌呤发酵液;其特征在于:所述的培养基包含如下组分:葡萄糖10-30g/L,玉米浆20-100g/L,其他氮源20-80g/L,尿素1-5g/L,甘氨酸1-5g/L,硫酸镁0.5-1.5g/L,磷酸氢二钾2-10g/L,磷酸二氢钾2-10g/L,氯化钙1-5g/L,谷氨酸钠3-10g/L,微量元素5-16g/L,消泡剂0.15-0.5ml/L。
2.根据权利要求1所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的培养基包含如下组分:葡萄糖15-25g/L,玉米浆40-80g/L,其他氮源30-60g/L,尿素2-4g/L,甘氨酸2-4g/L,硫酸镁0.8-1.2g/L,磷酸氢二钾4-8g/L,磷酸二氢钾4-8g/L,氯化钙2-4g/L,谷氨酸钠5-8g/L,微量元素8-12g/L,消泡剂0.25-0.4ml/L。
3.根据权利要求1所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的其他氮源包括黄豆粉、大豆蛋白胨、豆粕粉、植物多肽粉、酵母粉中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的酵母粉优选啤酒酵母粉或者面包酵母粉。
5.根据权利要求4所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的微量元素包含硫酸亚铁、钼酸钠、蛋氨酸、组氨酸、丙氨酸。
6.根据权利要求5所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的粗品提取包括如下步骤:
S1、发酵液灭活:将腺嘌呤发酵液升温至60-95℃维持1-5小时,制得灭活的腺嘌呤发酵液;
S2、固液分离:将灭活的腺嘌呤发酵液采用过滤设备进行固液分离,制得腺嘌呤滤液;
S3、滤液浓缩:将腺嘌呤滤液使用超滤膜进行超滤浓缩,制得腺嘌呤滤液浓相;
S4、吸附洗脱:将腺嘌呤滤液浓相使用离子交换树脂吸附,再使用洗脱剂进行洗脱,收集洗脱液;
S5、洗脱液浓缩:将洗脱液使用超滤膜进行超滤浓缩,浓缩至洗脱液中腺嘌呤含量为10-50g/L;制得腺嘌呤洗脱浓相;
S6、降温结晶:将腺嘌呤洗脱浓相降温至0-10℃,结晶干燥,制得腺嘌呤粗品。
7.根据权利要求6所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:在粗品提取的S2步骤中,所述的过滤设备为陶瓷膜过滤器、碟片离心机、卧螺离心机或者板框压滤机;采用陶瓷膜过滤器,使用50-500nm的陶瓷膜,操作压力0.1-0.4MPa,温度60-90℃;采用板框进行固液分离,需要加入硅藻土作为助滤剂,硅藻土加量为发酵液体积的2-10%(w/v),过滤压力在0.05-0.4Mpa,过滤温度60-90℃。
8.根据权利要求7所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:在粗品提取的S3步骤中,使用分子量截留在3500-10000Da的超滤膜进行过滤,操作温度在10-45℃,压力0.5-1.5Mpa,最好使用卷式超滤膜芯,膜芯材料是聚醚砜或者聚丙烯腈。
9.根据权利要求8所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:在粗品提取的S4步骤中,所述的离子交换树脂为凝胶型201×4、凝胶型001×7、大孔型D113或者大孔型D213中的一种;所述的洗脱剂为氢氧化钠溶液、氨水溶液或者盐酸溶液中的一种。
10.根据权利要求9所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的精品提取包括如下步骤:将腺嘌呤湿粗品加纯化水溶解,得腺嘌呤粗品水溶液,在腺嘌呤粗品水溶液加入活性炭脱色,再将脱色后的腺嘌呤水溶液降温至0-10℃,结晶干燥,制得腺嘌呤精品。
11.根据权利要求10所述的发酵生产腺嘌呤的方法,其特征在于:所述的腺嘌呤粗品水溶液浓度为10-50g/L,在腺嘌呤粗品水溶液加入3-10%(w/w)活性炭。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191105 |
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