CN114853823A - 一种提取胸腺嘧啶核苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提取胸腺嘧啶核苷的方法，该方法主要利用竞争性吸附法去除胸腺嘧啶核苷发酵过程中产生的有机杂质，属于生物工程技术领域，包括将胸腺嘧啶核苷发酵液进行微滤，得到微滤液；将微滤液过阴阳离子交换柱进行脱盐，得到脱盐液；将脱盐液超滤，得到超滤液；将超滤液过大孔吸附树脂柱，收集流出液；将流出液进行纳滤，得到纳滤液；将纳滤液依次经浓缩、脱色、再次浓缩、结晶和烘干，得到胸腺嘧啶核苷。采用本发明的方法，胸腺嘧啶核苷的总收率为82‑85.5％，纯度为99.0～99.1％。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种提取胸腺嘧啶核苷的方法。
背景技术
胸腺嘧啶核苷是核苷类有机化合物，是由胸腺嘧啶和核糖组成的化合物。胸腺嘧啶核苷是一种重要的医药中间体，主要用作抗艾滋病和抗病毒药叠氮胸苷、齐多夫定(AZT)中间体的合成、也用于脱氧核苷或脱氧核苷酸的制备。
目前胸腺嘧啶核苷的传统生产主要为化学合成法和发酵法。化学法主要以胸腺嘧啶和四乙酰核糖为主原料制得。化学法制备胸腺嘧啶核苷污染非常大。胸腺嘧啶核苷发酵法的提取工艺一般为微滤、脱盐、超滤、层析、纳滤、浓缩、结晶。由于胸腺嘧啶核苷的发酵液中含有较多的有机杂质，需要采用树脂层析法来去除这些杂质，提取工艺复杂，单次层析收率低，树脂利用率低，生产过程废水量很大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取胸腺嘧啶核苷的方法，本发明工艺简单、收率高、成本低。
本发明利用胸腺嘧啶核苷发酵液中的杂质特性差异，对不同的杂质分别用不同的步骤去除，无机盐分通过阳离子树脂和阴离子树脂去除；与胸腺嘧啶核苷结构类似的杂质，利用树脂对杂质和胸腺嘧啶核苷的吸附差异，利用杂质在树脂中对胸腺嘧啶核苷的挤出效应或胸腺嘧啶核苷对杂质的挤出效应，采用竞争性吸附法去除杂质；分子量比胸腺嘧啶核苷小得多的杂质如胸腺嘧啶，利用纳滤膜去除杂质；再通过脱色和结晶，得到高纯度的胸腺嘧啶核苷。
本发明中，利用杂质对树脂的吸附能力强于产品对树脂的吸附能力的特点，用过饱和上柱的方法，利用杂质对产品的挤出效应，将液体中的杂质留在树脂里，从而得到高纯度的上柱流出液。如果杂质吸附能力弱于产品吸附能力，本发明同样适用，可以通过产品对杂质的挤出效应，从而达到去除杂质的目的。
本发明以胸腺嘧啶核苷工艺开发为基础，阐述了竞争性吸附法在树脂层析工艺上的应用，本发明所用的方法和原理同样适用于其他发酵类产品的提取、植物提取和化学合成产品的纯化等方面。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提取胸腺嘧啶核苷的方法，包括以下步骤：
1)将胸腺嘧啶核苷发酵液进行微滤，得到微滤液；
2)将所述步骤1)得到的微滤液过阴阳离子交换柱进行脱盐，得到脱盐液；
所述阴阳离子交换柱中的阳离子树脂为强酸性阳离子树脂，阴离子树脂为强碱性阴离子树脂；
3)将所述步骤2)得到的脱盐液超滤，得到超滤液；
4)将所述步骤3)得到的超滤液过饱和上柱大孔吸附树脂柱，收集流出液；当所述流出液中胸腺嘧啶核苷的浓度≥1g/L和纯度在96％以上时，开始收集流出液；
所述大孔吸附树脂柱中装有XAD16N树脂、XAD1600树脂或HZ816树脂；
5)将所述步骤4)得到的流出液进行纳滤，得到纳滤液；
6)将所述步骤5)得到的纳滤液依次经浓缩、脱色、再次浓缩、结晶和烘干，得到胸腺嘧啶核苷。
优选的，所述步骤1)胸腺嘧啶核苷发酵液中胸腺嘧啶核苷的含量为8～12g/L、菌体含量为40～100g/L、无机盐含量为10～15g/L和葡萄糖含量为1～5g/L。
优选的，所述步骤1)使用陶瓷膜进行微滤，所述陶瓷膜的孔径为50nm；
所述微滤时，胸腺嘧啶核苷发酵液的温度为55～80℃。
优选的，所述步骤2)强酸性阳离子树脂为732树脂，所述强碱性阴离子树脂为711树脂。
优选的，所述步骤3)超滤使用的超滤膜截留分子量为3000～10000Da。
优选地，上述步骤(4)所述超滤液上柱过程中，跟踪上柱流出液质量情况，收集流出液效价高于1g/L且纯度≥96％的流出液，优选收集效价高于1.5g/L，纯度≥97％的流出液；随着上柱的持续进行，上柱流出液纯度逐渐下降，当树脂逐渐被杂质饱和后，上柱流出液的纯度会低于96％，此时结束收集，用去离子水顶洗树脂，流出液套用至下一根层析柱，优选纯度低于96.5％时停止收集。
优选的，所述步骤5)纳滤使用的纳滤膜的截留分子量为150～500Da。
优选的，所述步骤6)浓缩和再次浓缩的条件分别包括：在真空度小于等于-0.009MPa和温度小于等于70℃下进行浓缩；
所述浓缩的终点为浓缩液的质量浓度为20～40％；
所述再次浓缩的终点为再次浓缩液的质量浓度为50～70％。
优选的，所述步骤6)脱色使用活性炭进行，所述活性炭的添加量为所述再次浓缩液中胸腺嘧啶核苷总质量的0.3～5％；
所述脱色的温度为50～70℃，所述脱色的时间为10～30min。
优选的，所述结晶使用的试剂为乙醇，所述乙醇的使用量为所述再次浓缩液体积的2～5倍；
所述结晶的条件包括：结晶的温度为0～15℃，结晶的时间为12h；
所述烘干的条件包括：在真空度为小于等于-0.08MPa、温度为50～85℃下烘干12h。
本发明利用胸腺嘧啶核苷发酵液中的杂质特性差异，对不同的杂质分别用不同的步骤去除，无机盐分通过阳离子树脂和阴离子树脂去除；与胸腺嘧啶核苷结构类似的杂质，利用树脂对杂质和胸腺嘧啶核苷的吸附差异，利用杂质在树脂中对胸腺嘧啶核苷的挤出效应或胸腺嘧啶核苷对杂质的挤出效应，采用竞争性吸附法去除杂质；分子量比胸腺嘧啶核苷小得多的杂质如胸腺嘧啶，利用纳滤膜去除杂质；再通过脱色和结晶，得到高纯度的胸腺嘧啶核苷。
本发明利用杂质对树脂的吸附能力强于产品对树脂的吸附能力的特点，用过饱和上柱的方法，利用杂质对产品的挤出效应，将液体中的杂质留在树脂里，从而得到高纯度的上柱流出液。如果杂质吸附能力弱于产品吸附能力，本发明同样适用，可以通过产品对杂质的挤出效应，从而达到去除杂质的目的。
本发明的有益效果是：
采用本发明的方法，胸腺嘧啶核苷的总收率为82～85.5％，纯度为99.0～99.1％。
具体实施方式
本发明提供了一种提取胸腺嘧啶核苷的方法，包括以下步骤：
1)将胸腺嘧啶核苷发酵液进行微滤，得到微滤液；
2)将所述步骤1)得到的微滤液过阴阳离子交换柱进行脱盐，得到脱盐液；
所述阴阳离子交换柱中的阳离子树脂为强酸性阳离子树脂，阴离子树脂为强碱性阴离子树脂；
3)将所述步骤2)得到的脱盐液超滤，得到超滤液；
4)将所述步骤3)得到的超滤液过大孔吸附树脂柱，收集流出液；当所述流出液中胸腺嘧啶核苷的浓度≥1g/L和纯度在96％以上时，开始收集流出液；
所述大孔吸附树脂柱中装有XAD16N树脂、XAD1600树脂或HZ816树脂；
5)将所述步骤4)得到的流出液进行纳滤，得到纳滤液；
6)将所述步骤5)得到的纳滤液依次经浓缩、脱色、再次浓缩、结晶和烘干，得到胸腺嘧啶核苷。
本发明将胸腺嘧啶核苷发酵液进行微滤，得到微滤液。
本发明对所述胸腺嘧啶核苷发酵液的来源没有特殊限定，采用本领域常规发酵胸腺嘧啶核苷制备的发酵液即可。在本发明中，所述胸腺嘧啶核苷发酵液中胸腺嘧啶核苷的含量为8～12g/L、菌体含量为40～100g/L、无机盐含量为10～15g/L和葡萄糖含量为1～5g/L。本发明优选使用陶瓷膜进行微滤，除去菌体，所述陶瓷膜的孔径优选为50nm。在本发明中，所述微滤时，胸腺嘧啶核苷发酵液的温度优选为55～80℃。
本发明将得到的微滤液过阴阳离子交换柱进行脱盐，得到脱盐液；所述阴阳离子交换柱中的阳离子树脂为强酸性阳离子树脂，阴离子树脂为强碱性阴离子树脂。
在本发明中，所述强酸性阳离子树脂优选为732树脂，所述强碱性阴离子树脂优选为711树脂。本发明对所述732树脂和711树脂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述微滤液优选先经过阳离子树脂再经过阴离子树脂。在本发明中，所述阴阳离子交换柱中阳离子树脂和阴离子树脂的装填量优选为树脂柱体积的70～80％。本发明对其它上阴阳离子交换柱的其它条件没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。在本发明中，所述阴阳离子交换柱能够除去无机盐，如磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁等。
本发明将得到的脱盐液超滤，得到超滤液。在本发明中，所述超滤使用的超滤膜截留分子量优选为3000～10000Da。在本发明中，所述超滤能够除去蛋白质和色素等大分子物质。
本发明将得到的超滤液过饱和上柱大孔吸附树脂柱，收集流出液；所述大孔吸附树脂柱中装有XAD16N树脂、XAD1600树脂或HZ816树脂。本发明对上述树脂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述流出液中胸腺嘧啶核苷的浓度在1g/L和纯度在96％以上时，开始收集流出液。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱中树脂的装填量优选为树脂柱体积的70～80％。本发明对上大孔吸附树脂柱的其它条件没有特殊限定，本领域技术人员采用常规操作即可。在本发明中，所述大孔吸附树脂能够除去胸腺嘧啶核苷的结构相关性杂质，如胸腺嘧啶、胸腺嘧啶核苷同分异构体等。
本发明将得到的流出液进行纳滤，得到纳滤液。在本发明中，所述纳滤使用的纳滤膜的截留分子量优选为150～500Da，更优选为300Da。在本发明中，所述纳滤能够除去水，起初步浓缩作用。
本发明将得到的纳滤液依次经浓缩、脱色、再次浓缩、结晶和烘干，得到胸腺嘧啶核苷。
在本发明中，所述浓缩和再次浓缩的条件分别优选包括：在真空度小于等于-0.009MPa和温度小于等于70℃下进行浓缩；所述浓缩的终点优选为浓缩液的浓度为20～40％(W/V)，更优选为35％(W/V)；所述再次浓缩的终点为再次浓缩液的浓度优选为50～70％(W/V)，更优选为60％(W/V)。在本发明中，所述脱色优选使用活性炭进行，所述活性炭的添加量为所述再次浓缩液中胸腺嘧啶核苷总质量的0.3～5％，更优选为0.5～2％。在本发明中，所述脱色的温度优选为50～70℃，更优选为55～60℃；所述脱色的时间优选为10～30min，更优选为15～20min。在本发明中，所述结晶使用的试剂优选为乙醇，所述乙醇的使用量优选为所述再次浓缩液体积的2～5倍，更优选为3倍。在本发明中，所述乙醇优选以乙醇溶液进行结晶，所述乙醇溶液的体积百分含量优选为95％。在本发明中，所述结晶的条件优选包括：结晶的温度优选为0～15℃，更优选为5～10℃；所述结晶的时间优选为12h。在本发明中，所述烘干的条件优选包括：在真空度为小于等于-0.08MPa、温度为50～85℃下烘干12h。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取50L胸腺嘧啶核苷发酵液，用蒸汽加热至55℃，用陶瓷膜微滤机(50nm)微滤，微滤得到30L澄清液后开始用生活饮用水顶洗浓缩液，微滤顶洗20L水后，共收集50L滤液，微滤浓缩液继续顶洗，顶洗液收集套用至下一次微滤。
微滤液经过732树脂和711树脂脱盐后，用3000Da分子量的超滤膜进行超滤，超滤后期用去离子水顶洗超滤浓缩液，共得到83L超滤液。
超滤液上柱XAD1600树脂柱，跟踪上柱流出液质量情况。上柱流出液前6L胸腺嘧啶核苷未检出，至第7L开始有微量胸腺嘧啶核苷流出，随着上柱的进行，流出液中胸腺嘧啶核苷的浓度缓慢上升；至第11L时，胸腺嘧啶核苷的浓度为0.8g/L，纯度78.8％；至第12L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到1.1g/L，纯度93.2％；至第13L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到1.6g/L，纯度96.8％，至第14L开始收集上柱流出液；继续跟踪上柱流出液质量情况，至第15L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到3.6g/L，纯度98.6％；继续跟踪上柱流出液质量情况，至第75L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到19.8g/L，纯度97.7％；至第77L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到19.9g/L，纯度97.2％；第78L时停止收集，用去离子水清洗树脂柱，将未上柱的剩余超滤液与清洗液合并，用于下一批次的竞争性吸附。
将收集的上柱流出液用150～300Da分子量的纳滤膜进行纳滤，纳滤透过液去污水系统，纳滤浓缩液浓度达到100g/L时，用去离子水顶洗浓缩液，跟踪纳滤浓缩液的质量情况，当杂质胸腺嘧啶含量低于0.2％后结束顶洗。将纳滤浓缩液与纳滤膜清洗液一起进行减压浓缩，浓缩至胸腺嘧啶核苷浓度达到36％时加入20g活性炭，55℃脱色15min。
脱色后继续浓缩，共得2.9L浓缩液，胸腺嘧啶核苷浓度为55％。往浓缩液中加入9L95％乙醇进行结晶，5℃冷却结晶12h，晶体抽滤并用500ml乙醇淋洗后，得到湿晶体。
湿晶体在-0.095MPa，60℃条件下干燥12h，得到1435g胸腺嘧啶核苷成品，纯度99.0％，总收率82.0％。
实施例2
取300L胸腺嘧啶核苷发酵液，用蒸汽加热至55℃，用陶瓷膜微滤机(50nm)微滤，微滤得到200L澄清液后开始用生活饮用水顶洗浓缩液，顶洗微滤150L水后，共收集350L滤液，继续顶洗，顶洗液收集套用至下一次微滤。
微滤液经过732树脂和711树脂脱盐后，用3000Da分子量的超滤膜进行超滤，超滤后期用去离子水顶洗超滤浓缩液，共得到560L超滤液。
超滤液上柱HZ816树脂柱，跟踪上柱流出液质量情况。上柱流出液前30L胸腺嘧啶核苷未检出，至第34L开始有微量胸腺嘧啶核苷流出，随着上柱的进行，流出液中胸腺嘧啶核苷的浓度缓慢上升；至第40L时，胸腺嘧啶核苷的浓度为1.2g/L，纯度92.1％；至第42L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到2.1g/L，纯度96.3％；至第44L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到3.3g/L，纯度97.4％，至第44L开始收集上柱流出液；继续跟踪上柱流出液质量情况，至第46L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到6.4g/L，纯度98.3％；继续跟踪上柱流出液质量情况，至第450L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到17.5g/L，纯度97.7％；至第460L时，胸腺嘧啶核苷的浓度达到17.4g/L，纯度97.6％；至第480L时胸腺嘧啶核苷的浓度达到17.5g/L，纯度97.3％；至第490L时胸腺嘧啶核苷的浓度达到17.5g/L，纯度96.7％；至第495L时停止收集，用去离子水清洗树脂柱，将未上柱的剩余超滤液与清洗液合并，用于下一批次的竞争性吸附。
将收集的上柱流出液用150～300Da分子量的纳滤膜进行纳滤，纳滤透过液去污水系统，纳滤浓缩液浓度达到105g/L时，用去离子水顶洗浓缩液，跟踪纳滤浓缩液的质量情况，当杂质胸腺嘧啶含量低于0.2％后结束顶洗。将纳滤浓缩液与纳滤膜清洗液一起进行减压浓缩，浓缩至胸腺嘧啶核苷浓度达到36％时加入120g活性炭，55℃脱色15min。
脱色后继续浓缩，共得18.2L浓缩液，胸腺嘧啶核苷浓度为54％。往浓缩液中加入60L95％乙醇进行结晶，5℃冷却结晶12h，晶体抽滤并用3L乙醇淋洗后，得到湿晶体。
湿晶体在-0.095MPa，60℃条件下干燥12h，得到8980g胸腺嘧啶核苷成品，纯度99.1％，总收率85.5％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提取胸腺嘧啶核苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将胸腺嘧啶核苷发酵液进行微滤，得到微滤液；
2)将所述步骤1)得到的微滤液过阴阳离子交换柱进行脱盐，得到脱盐液；
所述阴阳离子交换柱中的阳离子树脂为强酸性阳离子树脂，阴离子树脂为强碱性阴离子树脂；
3)将所述步骤2)得到的脱盐液超滤，得到超滤液；
4)将所述步骤3)得到的超滤液过饱和上柱大孔吸附树脂柱，收集流出液；当所述流出液中胸腺嘧啶核苷的浓度≥1g/L和纯度在96％以上时，开始收集流出液；
所述大孔吸附树脂柱中装有XAD16N树脂、XAD1600树脂或HZ816树脂；
5)将所述步骤4)得到的流出液进行纳滤，得到纳滤液；
6)将所述步骤5)得到的纳滤液依次经浓缩、脱色、再次浓缩、结晶和烘干，得到胸腺嘧啶核苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)胸腺嘧啶核苷发酵液中胸腺嘧啶核苷的含量为8～12g/L、菌体含量为40～100g/L、无机盐含量为10～15g/L和葡萄糖含量为1～5g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)使用陶瓷膜进行微滤，所述陶瓷膜的孔径为50nm；
所述微滤时，胸腺嘧啶核苷发酵液的温度为55～80℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)强酸性阳离子树脂为732树脂，所述强碱性阴离子树脂为711树脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)超滤使用的超滤膜截留分子量为3000～10000Da。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)超滤液上柱过程中，跟踪上柱流出液质量情况，收集流出液效价高于1g/L且纯度≥96％的流出液；随着上柱的持续进行，上柱流出液纯度逐渐下降，当树脂逐渐被杂质饱和后，上柱流出液的纯度会低于96％，此时结束收集，用去离子水顶洗树脂，流出液套用至下一根层析柱。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)纳滤使用的纳滤膜的截留分子量为150～500Da。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)浓缩和再次浓缩的条件分别包括：在真空度小于等于-0.009MPa和温度小于等于70℃下进行浓缩；
所述浓缩的终点为浓缩液的质量浓度为20～40％；
所述再次浓缩的终点为再次浓缩液的质量浓度为50～70％。
9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述步骤6)脱色使用活性炭进行，所述活性炭的添加量为所述再次浓缩液中胸腺嘧啶核苷总质量的0.3～5％；
所述脱色的温度为50～70℃，所述脱色的时间为10～30min。
10.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述结晶使用的试剂为乙醇，所述乙醇的使用量为所述再次浓缩液体积的2～5倍；
所述结晶的条件包括：结晶的温度为0～15℃，结晶的时间为12h；
所述烘干的条件包括：在真空度为小于等于-0.08MPa、温度为50～85℃下烘干12h。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114990176A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-09-02 | 宁夏华吉生物有限公司 | 一种生产尿嘧啶核苷的方法 |
| CN116496336A (zh) * | 2023-05-06 | 2023-07-28 | 浙江昊清生物科技有限公司 | 一种从发酵液中提取胸苷的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105859809A (zh) * | 2016-04-09 | 2016-08-17 | 南昌大学 | 一种从发酵液中提取β-胸苷的方法 |
| CN107383135A (zh) * | 2017-09-07 | 2017-11-24 | 江苏创诺制药有限公司 | 从发酵液中分离纯化β‑胸苷的方法 |
| CN107574201A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-12 | 江西诚志生物工程有限公司 | 采用发酵法生产β‑胸苷的方法 |
| CN107629096A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-26 | 江西诚志生物工程有限公司 | 采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β‑胸苷的方法 |
| CN108358989A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-08-03 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法 |
| CN110272461A (zh) * | 2019-06-29 | 2019-09-24 | 赤峰蒙广生物科技有限公司 | 一种从发酵液中提纯β-胸苷的方法 |
| CN113307832A (zh) * | 2021-06-06 | 2021-08-27 | 台州市厚普生物科技有限公司 | 一种制备尿苷酸的方法 |
-
2022
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105859809A (zh) * | 2016-04-09 | 2016-08-17 | 南昌大学 | 一种从发酵液中提取β-胸苷的方法 |
| CN107383135A (zh) * | 2017-09-07 | 2017-11-24 | 江苏创诺制药有限公司 | 从发酵液中分离纯化β‑胸苷的方法 |
| CN107574201A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-12 | 江西诚志生物工程有限公司 | 采用发酵法生产β‑胸苷的方法 |
| CN107629096A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-26 | 江西诚志生物工程有限公司 | 采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β‑胸苷的方法 |
| CN108358989A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-08-03 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法 |
| CN110272461A (zh) * | 2019-06-29 | 2019-09-24 | 赤峰蒙广生物科技有限公司 | 一种从发酵液中提纯β-胸苷的方法 |
| CN113307832A (zh) * | 2021-06-06 | 2021-08-27 | 台州市厚普生物科技有限公司 | 一种制备尿苷酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 岳明;倪孟祥;: "常用的核苷类化合物分离技术及应用", 药学进展 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114990176A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-09-02 | 宁夏华吉生物有限公司 | 一种生产尿嘧啶核苷的方法 |
| CN116496336A (zh) * | 2023-05-06 | 2023-07-28 | 浙江昊清生物科技有限公司 | 一种从发酵液中提取胸苷的方法 |
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