CN107629096A - 采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β‑胸苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β‑胸苷的方法，其方法步骤如下：（1）发酵液的微滤：β‑胸苷发酵液通过膜孔径为50nm～1000nm的滤膜；（2）滤清液的离子交换：滤清液经过阳、阴离子交换柱，除去滤液中的多价离子；（3）离子交换液的超滤：离子交换液通过截留分子量为500～5000的滤膜；（4）滤清液的层析浓缩结晶：本发明的优点是：采用的二级膜分离工艺不仅简化了已有的多级膜分离工序，减少了提取分离步骤；将离子交换技术使用在两次膜分离中间，很好的解决了实际生产中由于膜分离过程中浓缩倍数的提高，金属盐物质析出，造成膜分离速度的下降的缺陷，具有工艺简单合理、提取分离度高、收率高、操作简便等优点。

Description

采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法

技术领域

本发明涉及β-胸苷制作领域技术，尤其是指一种采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法。

背景技术

β-胸苷作为遗传物质脱氧胸苷核酸（DNA）的组成成分存在于所有生物细胞之中，在生理上起着重要作用。

β-胸苷是医药工业上合成抗艾滋病抗病毒药物齐多夫定、拉米夫定的关键中间体，一种是利用2-脱氧-N-苯基戊糖胺为起始原料通过化学方法合成β-胸苷；一种是利用大肠杆菌，以葡萄糖、氨水为原料发酵生产β-胸苷。但由于化学法生产β-胸苷工艺复杂，生产条件要求高，产品收率低、生产成本高等一系列缺陷逐步被发酵法所取代。

由于发酵液中含有大量的菌体、蛋白、离子、色素、杂糖及不溶性的杂质颗粒，为了从发酵液中提取分离获得β-胸苷，需要将这些物质分离去除，才能获得高纯度的β-胸苷产品。目前，β-胸苷的提取分离按预处理方法分类包括：离心去除菌体法，一种提取分离方法，其主要是通过离心分离发酵液菌体，浓缩后加入乙醇去除蛋白，活性炭脱色后，浓缩、结晶获得Β-胸苷产品；酸化絮凝去除菌体法，如一种提取分离方法，其主要通过加酸调节发酵液PH至1.4～3.6后，加入絮凝剂升温后将发酵液中的菌体、蛋白及大颗粒杂质絮凝沉淀出后，经过离子交换、柱层析方法去除离子杂质，活性炭脱色后，浓缩、结晶获得Β-胸苷产品。但是不管是直接离心除菌还是絮凝后除菌，由于发酵液中菌体细小，都存在除菌不彻底的情况。其次这两种方法对发酵液的色素去除情况不理想，通过采用活性炭脱色后仍有部分色素残留，致使结晶后的成品颜色微黄，影响产品质量。于此相比，在一种利用膜分离技术从发酵液中提取Β-胸苷的方法，该方法的优点在于膜分离精度高，不仅能除去菌体及大颗粒杂质，还能去除大部分小分子蛋白及色素物质，从而提高提取效率，提高产品质量及产品收率。但该方法中β-胸苷发酵液按去除精度依次通过了4次膜过滤，操作步骤繁琐、耗时长，影响产品收率。并且由于发酵液中含有大量的金属离子，随着膜过滤过程中浓缩倍数的提高，会不断的从清液中析出金属盐物质，从而在膜过滤过程中附着在膜芯表面，造成后续的膜过滤速度降低，甚至导致堵塞膜孔的情况，大大的影响了过滤效果。

因此，工业应用上急需寻找一种简便可行的采用膜技术提取发酵液中的β-胸苷方法，工艺简单合理，能克服膜分离中存在的缺点，让膜分离技术完美的应用于β-胸苷的发酵液的提取。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，其在微滤后进行离子交换，确保了进入超滤前离子含量低，可以提高超滤的速度。具有工艺操作简单易行，膜分离步骤少，克服了现有膜分离技术应用过程中存在的过滤速度降低、堵塞现象，并且提高β-胸苷产品质量及收率。

为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

一种采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，包括有以下步骤：

（1）发酵液的微滤：β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm～1000nm的滤膜，除去发酵液中大部分的菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1～0.4MPa，操作温度12～45℃，浓缩倍数5～12倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的12～60%；

（2）滤清液的离子交换：滤清液经过阳、阴离子交换柱，除去滤液中的多价离子；

（3）离子交换液的超滤：离子交换液通过截留分子量为500～5000的滤膜，除去离子交换液中的大部分蛋白及色素物质，操作压力0.5～2.0MPa，操作温度20～40℃，浓缩倍数9～18倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的12～60%；

（4）滤清液的层析浓缩结晶：将上述3个步骤处理后的滤液，经过常规的离子交换层析、大孔吸附树脂层析、浓缩、结晶，获得纯度达99.5%以上的β-胸苷产品。

作为一种优选方案，所述步骤（1）中的滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜。

作为一种优选方案，所述步骤（2）中的离子交换顺序为滤清液先以1～6ΒV/H流速经过阳柱，再以1～6ΒV/H流速经过阴柱；本方法中的阳离子交换采用的树脂包括D001、732、D113阳离子交换树脂，阴离子交换树脂包括331、D315、717阴离子交换树脂。

作为一种优选方案，所述步骤（3）中滤膜为卷式超滤膜—醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜或聚酰胺膜。

作为一种优选方案，所述步骤（4）中大孔吸附树脂为HZ-818树脂、H103树脂或D101树脂。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知：

在已有的膜分离技术提取β-胸苷的基础上，创新性的采用了离子交换与膜分离技术相采用的方法进行发酵液中β-胸苷的提取。本发明采用的二级膜分离工艺不仅简化了已有的多级膜分离工序，减少了提取分离步骤，进而提高了产品收率；将离子交换技术使用在两次膜分离中间，很好的解决了实际生产中由于膜分离过程中浓缩倍数的提高，金属盐物质析出，造成膜分离速度的下降的缺陷，保证了生产过程的连续性，缩短了提取时间，并对膜芯起到了很好的保护作用，提高了膜设备的使用效率。本发明方法具有工艺简单合理、提取分离度高、收率高、操作简便等优点。采用本发明方法提取结晶后获得的β-胸苷产品经高效液相色谱分析纯度可达99.5%以上。

具体实施方式

本发明揭示了一种采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，包括有以下步骤：

（1）发酵液的微滤：β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm～1000nm的滤膜，除去发酵液中大部分的菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1～0.4MPa，操作温度12～45℃，浓缩倍数5～12倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的12～60%；滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜。

（2）滤清液的离子交换：滤清液经过阳、阴离子交换柱，除去滤液中的多价离子；离子交换顺序为滤清液先以1～6ΒV/H流速经过阳柱，再以1～6ΒV/H流速经过阴柱；本方法中的阳离子交换采用的树脂包括D001、732、D113阳离子交换树脂，阴离子交换树脂包括331、D315、717阴离子交换树脂。

（3）离子交换液的超滤：离子交换液通过截留分子量为500～5000的滤膜，除去离子交换液中的大部分蛋白及色素物质，操作压力0.5～2.0MPa，操作温度20～40℃，浓缩倍数9～18倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的12～60%；滤膜为卷式超滤膜—醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜或聚酰胺膜。

（4）滤清液的层析浓缩结晶：将上述3个步骤处理后的滤液，经过常规的离子交换层析、大孔吸附树脂层析、浓缩、结晶，获得纯度达99.5%以上的β-胸苷产品。大孔吸附树脂为HZ-818树脂、H103树脂或D101树脂。

下面以多个实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

β-胸苷发酵液100L通过膜孔径为1000nm的微滤膜，入膜压力0.2MPa，出膜压力0.1MPa，操作温度25℃，将发酵液浓缩10倍后，加入透析水量20L。滤清液以2ΒV/H流速通过732型阳离子交换树脂柱，阳柱流出液同样以2ΒV/H流速直接串入717型阴离子交换树脂柱。离子交换液通过膜截留分子量5000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30～35℃，将离子交换液浓缩15倍后，加入透析水量25L。滤液依次经过732型阳离子交换树脂，331型阴离子交换树脂，HZ-818树脂。树脂层析流出液经过减压浓缩，温度控制50～60℃，真空度-0.09MPa，浓缩至糖浆状后，加入糖浆体积的2倍量的无水乙醇，升温溶解后搅拌均匀，加少量晶种，缓慢降温使胸苷结晶析出，离心甩干后，母液再次经过层析、浓缩结晶。β-胸苷结晶经过真空干燥后，共获得β-胸苷产品4.89Kg。经高压液相色谱检测β-胸苷产品的纯度为99.50%。

实施例2：

β-胸苷发酵液100L通过膜孔径为200nm的微滤膜，入膜压力0.2MPa，出膜压力0.1MPa，操作温度25℃，将发酵液浓缩10倍后，加入透析水量30L。滤清液以2ΒV/H流速通过732型阳离子交换树脂柱，阳柱流出液同样以2ΒV/H流速直接串入717型阴离子交换树脂柱。离交液通过膜截留分子量2000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30～35℃，将离交液浓缩15倍后，加入透析水量30L。按照实施例1中后续提取方法，β-胸苷结晶经过真空干燥后，共获得β-胸苷产品4.97Kg。经高压液相色谱检测β-胸苷产品的纯度为99.80%。

实施例3：

β-胸苷发酵液100L通过膜孔径为500nm的微滤膜，入膜压力0.2MPa，出膜压力0.1MPa，操作温度25℃，将发酵液浓缩10倍后，加入透析水量25L。滤清液通过膜截留分子量2000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30～35℃，将微滤液浓缩15倍后，加入透析水量25L。超滤液以2ΒV/H流速通过732型阳离子交换树脂柱，阳柱流出液同样以2ΒV/H流速直接串入717型阴离子交换树脂柱。离交液按照实施例1中后续提取方法，β-胸苷结晶经过真空干燥后，共获得β-胸苷产品4.93Kg。经高压液相色谱检测β-胸苷产品的纯度为99.60%。

本发明的设计重点在于：在已有的膜分离技术提取β-胸苷的基础上，创新性的采用了离子交换与膜分离技术相采用的方法进行发酵液中β-胸苷的提取。本发明采用的二级膜分离工艺不仅简化了已有的多级膜分离工序，减少了提取分离步骤，进而提高了产品收率；将离子交换技术使用在两次膜分离中间，很好的解决了实际生产中由于膜分离过程中浓缩倍数的提高，金属盐物质析出，造成膜分离速度的下降的缺陷，保证了生产过程的连续性，缩短了提取时间，并对膜芯起到了很好的保护作用，提高了膜设备的使用效率。本发明方法具有工艺简单合理、提取分离度高、收率高、操作简便等优点。采用本发明方法提取结晶后获得的β-胸苷产品经高效液相色谱分析纯度可达99.5%以上。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，其特征在于：包括有以下步骤：

（1）发酵液的微滤：β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm～1000nm的滤膜，除去发酵液中大部分的菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1～0.4MPa，操作温度12～45℃，浓缩倍数5～12倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的12～60%；

（2）滤清液的离子交换：滤清液经过阳、阴离子交换柱，除去滤液中的多价离子；

（3）离子交换液的超滤：离子交换液通过截留分子量为500～5000的滤膜，除去离子交换液中的大部分蛋白及色素物质，操作压力0.5～2.0MPa，操作温度20～40℃，浓缩倍数9～18倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的12～60%；

（4）滤清液的层析浓缩结晶：将上述3个步骤处理后的滤液，经过常规的离子交换层析、大孔吸附树脂层析、浓缩、结晶，获得纯度达99.5%以上的β-胸苷产品。

2.根据权利要求1所述的采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜。

3.根据权利要求1所述的采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的离子交换顺序为滤清液先以1～6ΒV/H流速经过阳柱，再以1～6ΒV/H流速经过阴柱；本方法中的阳离子交换采用的树脂包括D001、732、D113阳离子交换树脂，阴离子交换树脂包括331、D315、717阴离子交换树脂。

4.根据权利要求1所述的采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，其特征在于：所述步骤（3）中滤膜为卷式超滤膜—醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜或聚酰胺膜。

5.根据权利要求1所述的采用超滤与离子交换技术精制发酵液中β-胸苷的方法，其特征在于：所述步骤（4）中大孔吸附树脂为HZ-818树脂、H103树脂或D101树脂。