CN105859809B - 一种从发酵液中提取β-胸苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从发酵液中提取β‑胸苷的方法，该方法包括以下步骤：（1）发酵液的预热；（2）发酵液的微滤；（3）微滤液的超滤；（4）超滤液的电渗析；（5）渗析液的浓缩；（6）浓缩液的层析；（7）层析液浓缩与结晶。本发明将膜分离技术、电渗析技术、层析分离技术运用于β‑胸苷发酵液的提取过程中，除杂效果好，工艺过程简便、环保，自动化程度高。通过本发明的提取工艺，β‑胸苷产品液相纯度≥98.5%，外标含量≥98.5，总收率≥70%，实现了从发酵液中提取β‑胸苷的工业化应用，具有良好的经济效益与产业化推广前景。

Description

一种从发酵液中提取β-胸苷的方法

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中提取β-胸苷的方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

β-胸苷即2'-脱氧胸腺嘧啶核苷是合成抗艾滋病药物司他夫定、叠氮胸苷及齐多夫定的重要前体物质。由于全球艾滋病病人数量逐年增加，对合成抗艾滋病药的原料胸苷的需求也逐年增加。

目前，生产β-胸苷的方法主要有两类。一类是采用化学合成法生产胸苷，由于化学合成工艺复杂，合成过程需要使用大量的有机溶剂，生产过程存在较大的安全及环保隐患；一类是采用生物发酵法生产,但相关胸苷提取工艺的研究报道尚少，因此，有必要探索一种简便、安全、环保、高效的提取工艺，为工业化低成本发酵生产胸苷产品提供帮助。

本发明将膜分离技术、电渗析技术、层析分离技术运用于β-胸苷发酵液的提取过程中。该提取工艺操作简便，产品质量稳定，收率较高。通过本发明提取工艺制备的胸苷产品，β-胸苷产品液相纯度≥98.5，外标含量≥98.5%，总收率≥70%，实现了从发酵液中提取β-胸苷的工业化应用，具有良好的经济效益与产业化推广前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取β-胸苷的方法，该方法包括：

（1）发酵液的预热：β-胸苷发酵液发酵结束后，在发酵罐内经蒸汽加热至60～85℃；

（2）发酵液的微滤：β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm～1000nm的滤膜，除去发酵液中大部分的菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1～0.4MPa，操作温度10～50℃，浓缩倍数6～12倍，顶洗水量以体积百分比计占进料体积的50～80%；

（3）微滤液的超滤：微滤液通过截留分子量为500～5000的滤膜，除去微滤液中的大部分蛋白及色素物质，操作压力0.5～2.0MPa，操作温度20～40℃，浓缩倍数10～20倍，顶洗水量以体积百分比计占进料体积的10～50%。

（4）超滤液的电渗析：超滤液通过电渗析器，将超滤液中阴、阳离子型杂质分离。操作电压22V。

（5）渗析液的浓缩：用真空浓缩方式对电渗析除离子后的物料进行浓缩，使胸苷的含量在20g/L～60g/L。浓缩温度控制在40～55℃，真空度达到0.08MPa～0.1MPa。

（6）浓缩液的层析：将浓缩液采用离子交换树脂或大孔径吸附树脂进行层析，将胸苷与其它物质进行进一步分离，获得高纯度层析液。

（7）层析液的浓缩结晶：将上述6个步骤处理后的层析液，经过浓缩、结晶，获得含量达到98.5%以上的β-胸苷产品。

以上实施方法的（2）、（3）、（4）步骤为发酵液的预处理，目的在于除去发酵液中的菌体、蛋白、大部分色素及阴阳离子。

所述步骤（2）中的滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜。

所述步骤（3）中的滤膜为卷式超滤膜，卷式超滤膜的材料为醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜。

所述步骤（4）中的电渗析三个储槽内溶液分别为：极液槽内为Na₂SO₄溶液；浓液槽内为自来水；清液槽内为超滤液。

所述步骤（6）中的大孔径吸附树脂为：HZ-803、HZ-337、SD301、XD828。

以上实施方法的（6）步骤为发酵液的高纯处理，目的在于进一步除去发酵液中的蛋白、多肽、核酸、色素、及微量的阴阳离子。

本发明是一种行之有效的发酵液中提取β-胸苷的方法。采用先进的膜分离技术、电渗析技术、层析技术运用于β-胸苷发酵液的提取过程中，质量有保障，操作简便，自动化程度高，有利于提高β-胸苷的提取收率。通过本发明工艺，β-胸苷产品液相纯度≥98.5%，外标含量≥98.5%，总收率≥70%，有利于实现从发酵液中高效提取β-胸苷的工业化生产。

具体实施方式

以下实施实例用于说明本发明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

将100Lβ-胸苷发酵液用蒸汽加热至65℃；通过膜孔径为1000nm的微滤膜，入膜压力0.2MPa，出膜压力0.1MPa，操作温度25℃，将发酵液浓缩8倍后，加入顶洗水量60L。滤清液通过膜截留分子量3000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30～35℃，将微滤液浓缩12倍后，加入透析水量30L。超滤液以600L/h的流速通过电渗析设备分离阴阳离子，当滤液电导≤100us/cm时，收集滤液进行真空浓缩。将滤液浓缩至β-胸苷含量达到30g/L后，进入层析柱分离、收集层析液，真空浓缩结晶，共获得β-胸苷产品694.65g。经高压液相色谱检测β-胸苷产品的液相纯度为98.82%，外标含量达到98.6%。

实施例2

将β-胸苷发酵液100L在发酵罐内经蒸汽加热至65℃；通过膜孔径为500nm的微滤膜，入膜压力0.2MPa，出膜压力0.1MPa，操作温度25℃，将发酵液浓缩9倍后，加入顶洗水量70L。滤清液通过膜截留分子量1000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30～35℃，将离交液浓缩15倍后，加入透析水量40L。超滤液以500L/h的流速通过电渗析设备分离阴阳离子，当滤液电导≤100us/cm时，收集滤液进行真空浓缩将滤液浓缩至β-胸苷含量达到35g/L后，进入层析分离、收集层析液，真空浓缩结晶，共获得β-胸苷产品751.77g。经高压液相色谱检测β-胸苷产品的液相纯度为99.52%，外标含量达到99.2%。

实施例3

将β-胸苷发酵液100L在发酵罐内经蒸汽加热至65℃；通过膜孔径为200nm的微滤膜，入膜压力0.2MPa，出膜压力0.1MPa，操作温度25℃，将发酵液浓缩6倍后，加入顶洗水量60L。滤清液通过膜截留分子量2000的超滤膜，操作压力1.4MPa，操作温度30～35℃，将离交液浓缩10倍后，加入透析水量35L。超滤液以500L/h的流速通过电渗析设备分离阴阳离子，当滤液电导≤100us/cm时，收集滤液进行真空浓缩将滤液浓缩至β-胸苷含量达到40g/L后，进入层析分离、收集层析液，真空浓缩结晶，共获得β-胸苷产品710.02g。经高压液相色谱检测β-胸苷产品的液相纯度为99.05%，外标含量达到98.9%。

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Claims (1)

1.一种从发酵液中提取β-胸苷的方法，其特征是该方法包括以下步骤：

（1）发酵液的预热：β-胸苷发酵液发酵结束后，在发酵罐内经蒸汽加热至60～85℃；

（2）发酵液的微滤：β-胸苷发酵液通过膜孔径为50nm～1000nm的滤膜，除去发酵液中的菌体及较大的蛋白及杂质颗粒，操作压力0.1～0.4MPa，操作温度10～50℃，浓缩倍数6～12倍，顶洗水量以体积百分比计占进料体积的50～80%；

（3）微滤液的超滤：微滤液通过截留分子量为500～20000的滤膜，除去微滤液中的大部分蛋白及色素物质，操作压力0.5～2.0MPa，操作温度20～40℃，浓缩倍数10～20倍，顶洗水量以体积百分比计占进料体积的10～50%；

（4）超滤液的电渗析：超滤液通过电渗析器，将超滤液中阴、阳离子型杂质分离；操作电压22V；

（5）渗析液的浓缩：用真空浓缩方式对电渗析除离子后的物料进行浓缩，使胸苷的含量在20g/L～60g/L；浓缩温度控制在40～55℃，真空度达到0.08MPa～0.1MPa；

（6）浓缩液的层析：将浓缩液采用离子交换树脂或大孔径吸附树脂进行层析，将胸苷与其它物质进行进一步分离，获得高纯度层析液；

（7）层析液的浓缩结晶：将上述6个步骤处理后的层析液，经过浓缩、结晶，获得含量达到98.5%以上的β-胸苷产品；

以上实施方法的（2）、（3）、（4）步骤为发酵液的预处理，目的在于除去发酵液中的菌体、蛋白、大部分色素及阴阳离子；

所述步骤（2）中的滤膜为氧化铝膜、陶瓷膜、PVC膜；

所述步骤（3）中的滤膜为卷式超滤膜，卷式超滤膜的材料为醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜；

所述步骤（4）中的电渗析三个储槽内溶液分别为：极液槽内为Na₂SO₄溶液；浓液槽内为自来水；清液槽内为超滤液；

所述步骤（6）中的大孔径吸附树脂为：HZ-803、HZ-337、

SD301、XD828；

以上实施方法的（6）步骤为发酵液的高纯处理，目的在于进一步除去发酵液中的蛋白、多肽、核酸、色素、及微量的阴阳离子。