CN101962397A - 生物转化液中分离纯化2＇-脱氧腺苷的方法 - Google Patents
生物转化液中分离纯化2＇-脱氧腺苷的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101962397A CN101962397A CN 201010263106 CN201010263106A CN101962397A CN 101962397 A CN101962397 A CN 101962397A CN 201010263106 CN201010263106 CN 201010263106 CN 201010263106 A CN201010263106 A CN 201010263106A CN 101962397 A CN101962397 A CN 101962397A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preferred
- desoxyadenosine
- ethanolic solution
- bio
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 8
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 47
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 34
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 34
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 28
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 20
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 18
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 17
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 15
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 12
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 12
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 12
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 12
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 9
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 2'-deoxythymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 8
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 3
- 108010043943 Starch Phosphorylase Proteins 0.000 claims description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 abstract description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 abstract 1
- MQRJBSHKWOFOGF-UHFFFAOYSA-L disodium;carbonate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O MQRJBSHKWOFOGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 7
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 6
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- -1 tri-n-butyl tin hydrogen Chemical class 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 3
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 3
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 3
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N azane;methanol Chemical compound N.OC CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- IMNDHOCGZLYMRO-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylbenzamide Chemical compound CN(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 IMNDHOCGZLYMRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从生物转化液中分离纯化2′-脱氧腺苷的方法。该方法，是将制得的生物转化液离心除去菌体，得到上清液，上清液经过离子交换树脂柱吸附，吸附完毕后，先用Na2CO3水溶液洗脱，再用有机溶剂的混合液洗脱，用乙醇结晶后得到2′-脱氧腺苷。该方法将生物转化液中的2′-脱氧腺苷与其它杂质分离和提取出来，产品纯度达99％以上；而且提高了分离和提取速度，降低了成本、减少环境污染，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明于生物医药技术领域，涉及一种从生物转化液中分离纯化2′-脱氧腺苷的方法。
背景技术
2′-脱氧腺苷是脱氧核糖核酸DNA的结构片段，是基因药物和基因工程研究的重要原材料，具有很好的生理活性，虽未有报道其可直接用于抗病毒，但是可作为一种重要的原料，经过化学结构改造得到的2′-脱氧腺苷类似物具有良好的抗肿瘤活性，因此在市场上有广泛需求。2′-脱氧腺苷可通过脱氧核糖核酸的降解而得到，但是由于降解后产物分离困难等原因，使得该方法并不实用。脱氧腺苷也可通过化学合成法合成，但其步骤过于复杂，比如一些基团的保护与去保护以及糖基的活化等。图1是一种化学合成方法，以3`5`-二苯甲酰基腺苷为原料和N，N-二甲基苯甲酰胺及碳酰氯反应，再与硫化氢及吡啶反应，然后经三正丁基锡化氢脱氧，最后经甲醇氨脱保护得到2`-脱氧腺苷。
上述化学法生产2′-脱氧腺苷有以下缺点：1、其原料1-氯-3，5-二对硝基苯-2-脱氧核糖不易得到，需要自己生产；2、产率较低(约26％)，难以实现工业化生产；3、是使用汞盐，不利于环保与工人健康；4、得到的产物为α，β混合物，后期纯化困难，产品纯度低。
通过生物转化法合成2′-脱氧腺苷的方法(见图2所示)，具有步骤简单，反应时间短等优点，避免了以上不足。目前，国内外文献对提高转化产率的研究较多，但对提取纯化工艺的研究却相对较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离纯化2′-脱氧腺苷的方法。
本发明提供的分离纯化2′-脱氧腺苷的方法，包括如下步骤：
1)生物转化液预处理：
将生物转化液离心，取上清液，置于0-25℃冰箱中保存，得到预处理完毕的所述生物转化液；
2)样品吸附及2′-脱氧腺苷的解析：
将pH值调节至5-8的所述预处理完毕的生物转化液上样于所述层析柱中，依次用碳酸钠水溶液和乙醇水溶液进行洗脱，收集用所述乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液；
所述层析柱中的介质为离子交换树脂或大孔吸附树脂；
3)结晶：
将所述步骤2)得到的洗脱液中加入无水乙醇，于0-25℃结晶后得到2′-脱氧腺苷晶体粗品，将所述2′-脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶，得到所述2′-脱氧腺苷。
上述方法的步骤1)中，所述生物转化液是按照如下方法所得：以2′-脱氧胸苷为核糖基供体，腺嘌呤为碱基供体，通过微生物发酵产生的核糖磷酸化酶进行生物转化，得到所述生物转化液。制备所述生物转化液步骤中，所述微生物为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，所述瑞士乳杆菌的保藏编号CGMCC 1.1877(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)；所述离心步骤中，温度为0-25℃，优选4℃，时间为10-60分钟，优选20分钟，转速为3000-8000rpm，具体可为3500rpm、5000rpm或3500-5000rpm，优选4000rpm，离心半径为150-400mm，优选200mm。
所述步骤2)中，所述离子交换树脂优选为阴离子型树脂。各种常用的由公开商业途径购买所得阴离子交换树脂均适用，如717型阴离子型树脂、D201型阴离子型树脂或D290型阴离子型树脂，优选717型阴离子型树脂；各种常用的由公开商业途径购买所得大孔吸附树脂均适用，如D101型大孔吸附树脂、DM18型大孔吸附树脂、HPD722型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂，优选D101型大孔吸附树脂。所述层析柱中的介质在使用前进行如下预处理：将所述层析柱中的介质先用乙醇水溶液浸泡后，用去离子水洗涤后用氢氧化钠水溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性后用盐酸水溶液浸泡，最后用去离子水洗涤至中性；所述乙醇水溶液的体积百分浓度为75-99.9％，优选95％，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5-2.0mol/L，优选1mol/L，所述盐酸水溶液的浓度为0.5-2.0mol/L，优选1mol/L。所述用乙醇水溶液浸泡步骤中，时间为12-36小时，优选24小时；所述用氢氧化钠水溶液浸泡步骤中，时间为2-8小时，优选4小时；所述用盐酸水溶液浸泡步骤中，时间为2-8小时，优选4小时。
所述步骤2)洗脱步骤中，所述碳酸钠水溶液的浓度为0.05M-0.2M，具体为0.1-0.15M，优选0.1M，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为30-75％，具体为45-55％，优选45％。所述用碳酸钠水溶液进行洗脱步骤中，所述碳酸钠水溶液的用量为所述分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱的柱体积的2-10倍，具体为2-6倍、2倍或6倍，优选4倍，洗脱次数为1次；所述用乙醇水溶液进行洗脱步骤中，所述乙醇水溶液的用量为所述分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱的柱体积的1-5倍，具体为3-4倍，优选3倍，洗脱次数为1次。该步骤中，用碳酸钠水溶液洗脱的目的是去除层析柱中蛋白等杂质。洗脱速率为洗脱液由层析柱顶端依靠重力自然流出的速率，不需额外人为设定洗脱速率。
所述步骤3)所述加入无水乙醇步骤中，无水乙醇的用量为所述步骤2)得到的 洗脱液体积的0.2-2倍，优选0.5倍；所述2′-脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶步骤中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为10-50％，具体为20％、30％或20-30％，优选45％，所述乙醇水溶液的用量为所述2′-脱氧腺苷粗品体积的0.2-2倍，具体为0.4倍、2倍或0.4-2倍，优选0.4倍。
上述方法的步骤1)中，所述生物转化液具体可按照包括如下步骤的方法制备而得：将瑞士乳杆菌接入发酵培养基中发酵培养，得到菌体，将所述菌体破碎，制成细胞破碎液，向所述细胞破碎液中加入2′-脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得所述2′-脱氧腺苷；所述腺嘌呤的直径小于等于10μm；
各种能够发酵培养瑞士乳杆菌的培养基均适用，如可用由下列重量份的物质组成的培养基：葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、玉米麸质粉10-25、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4和水1000；所述发酵培养的温度为30-42℃，搅拌转速为120-160转/分钟，pH值为6.0-7.5，发酵时间为24-36小时；
所述瑞士乳杆菌种子液与所述发酵培养基的体积比可为10％-15％；
所述瑞士乳杆菌种子液是按照如下方法获得：将瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养制成斜面菌种，将所述斜面菌种接入发酵培养基中培养获得种子液；各种能够培养获得种子液的斜面培养基均适用，如所述斜面培养基可为由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4，琼脂15-20和水1000；所述瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养的温度为30-42℃，pH值为6.5-8.0，培养24-48小时；
对菌体进行破碎的目的是为了释放菌体内的核糖磷酸化酶，所述细胞破碎液按照如下方法制备：将所述粗菌体用柠檬酸缓冲液洗涤，然后用pH值为6.0-7.0磷酸缓冲液悬浮，获得细胞悬浮液，超声破碎所述细胞悬浮液，获得细胞破碎液；所述柠檬酸缓冲液的pH值为6.0-7.0；所述磷酸缓冲液的pH值为6.0；所述超声条件为功率为300-400瓦，频率为3-5次/10秒，时间为5-15分钟；所述细胞悬浮液中菌体的质量百分含量为15％-35％；所述酶促反应的温度为35-50℃。
本发明提供的分离纯化2′-脱氧腺苷的方法，是将制得的生物转化液离心除去菌体，得到上清液，上清液经过阴离子交换树脂柱吸附，吸附完毕后，先用Na2CO3水溶液洗脱，再用有机溶剂的混合液洗脱，洗脱液经减压浓缩，得2′-脱氧腺苷结晶，洗脱后的树脂用有机溶剂冲洗后重复使用。该方法将生物转化液中的2′-脱氧腺苷与其它杂质分离和提取出来，产品纯度达99％以上；而且提高了分离和提取速度，降低了成本、减少环境污染，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为化学法合成2′-脱氧腺苷。
图2为生物转化法合成2′-脱氧腺苷。
图3为实施例1步骤4)所得洗脱液的HPLC谱图。
图4为实施例1制备所得重结晶后的2′-脱氧腺苷的HPLC谱图。
图5为HPLC检测产品纯度所用标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例步骤4)和5)中HPLC的检测条件均如下所示：色相：Waters 600E高效液相色谱仪系统，色谱柱：迪马Platisil ODS C18 5u，250mmx4.6mm，流动相：由甲醇和水以体积比30∶70混合而得的混合液，吸收波长：254nm，流速：0.9ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。
计算产品2′-脱氧腺苷纯度时所用标准曲线如图5所示，回归方程为y＝4E-08x，相关系数R2＝0.9992，其中，x代表吸光度值，单位为微伏×秒，y代表样品含量，单位为g/ml。
实施例1
1)将3000毫升的生物转化液，在4℃下离心，离心转速为3500rpm，离心半径为200mm，离心15min以除去菌体，取上清液，得到预处理完毕的生物转化液，将其置于4℃冰箱中保存备用。
2)将717型阴离子树脂先用体积百分浓度为95％的乙醇水溶液充分浸泡24h，经检测无有机性物质后用去离子水洗至无醇味，然后在1mol/L NaOH溶液中浸泡4h，去离子水洗至中性，接着在1mol/L HCl水溶液中浸泡4h，去离子水洗至中性，得到预处理完毕的717型阴离子型树脂。
3)将步骤2)预处理完毕的717型阴离子型树脂12Kg填装于内径10厘米、高150厘米的玻璃层析柱内，调节步骤1)预处理完毕的生物转化液的pH值为8.0后，将该生物转化液500ml加入到该层析柱内，使其被树脂吸附，得到分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱。
4)分别用6个柱体积的0.1M浓度的Na2CO3水溶液、3个柱体积的45％体积分数的乙醇水溶液对步骤3)所得分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱进行洗脱各一次，收集乙醇水溶液洗脱而得的洗脱液，该洗脱液的HPLC检测结果如图3所示，经计算该洗脱液中产品纯度为68.7％，2′-脱氧腺苷的收率93.9％。
5)由于上述步骤4)所得洗脱液中仍含有少量胸苷和碱基，减压浓缩(真空度为100Pa，时间30分钟。)洗脱液，向其中加入0.5倍体积的无水乙醇，于冰箱中在4℃结晶，得到2′-脱氧腺苷晶体粗品，HPLC检测并用标准曲线计算可知，该粗品的纯 度为88.91％的2′-脱氧腺苷晶体粗品，将该2′-脱氧腺苷晶体粗品用体积百分浓度为30％的乙醇水溶液进行重结晶，所用体积百分浓度为30％的乙醇水溶液的用量为该2′-脱氧腺苷晶体粗品体积的2倍，得到2′-脱氧腺苷晶体，该HPLC检测结果如图4所示，经计算该2′-脱氧腺苷晶体的纯度为99.1％，收率为72.5％。
该实施例中步骤1)中所用生物转化液是按照如下方法制备而得：
(1)菌种斜面培养
将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CGMCC 1.1877(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种到斜面培养基，37℃、pH值6.5，培养24小时制成斜面菌种；斜面培养基由下列重量份的组分组成：
葡萄糖18份、蛋白胨18份、酵母膏8份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠9份、硫酸锰0.02份，琼脂20份和水1000份。
(2)接种发酵
将斜面菌种接入发酵培养基中扩大培养作为种子液；将种子液按10％(体积百分比)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中37℃，160转/分钟，pH值为6.0，发酵36小时；发酵培养基由下列重量份的组分组成：
葡萄糖20份、蛋白胨4份、玉米麸质粉25份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠9份、硫酸锰0.02份和水1000份。
(3)制备生物转化液
a)发酵液在4℃、8000转/分钟、离心20分钟，收集湿菌体；
b)柠檬酸缓冲液(pH值为6.5)洗涤步骤a)菌体，4℃离心10分钟，收集湿菌体，称重，用磷酸缓冲液(pH值为6.0)重悬菌体，制成15％(湿菌体重量和缓冲液的体积比)的细胞悬浮液；
c)步骤b)的细胞悬浮液置于冰浴中，超声波破碎10分钟，超声波功率为400瓦，频率为3次/10秒；
d)向步骤c)的破碎液中加入底物2′-脱氧胸苷和腺嘌呤混合后40℃反应24小时，得到生物转化液；每升破碎液中加入2′-脱氧胸苷50g和腺嘌呤30g，腺嘌呤为通过气流粉碎后的粉末，直径小于10μm；
HPLC检测(色谱柱：Diamonsil C18，5um，250x4.6mm；流动相：由甲醇和pH值为6.0的磷酸缓冲盐以体积比为30∶70组成的混合液，该磷酸缓冲盐是由0.01mol/L的磷酸一氢钾水溶液和0.01mol/L的磷酸二氢钾水溶液组成；流速：0.9ml/min；检测波长：254nm)可知，2′-脱氧胸苷转化为2′-脱氧腺苷的转化率达82％，每升生物转化液中含有2′-脱氧腺苷42g。
实施例2
1)将3000毫升的生物转化液，在4℃下离心，离心转速为5000rpm，离心半径为200mm，离心10min除去菌体，得到上清液，得到预处理完毕的生物转化液，将其置于4℃冰箱中保存备用。
2)将D101型大孔吸附树脂先用体积百分浓度为95％的乙醇水溶液充分浸泡24h，经检测无有机性物质后用去离子水洗至无醇味，然后在1mol/L NaOH水溶液中浸泡4h，去离子水洗至中性，接着在1mol/L HCl水溶液中浸泡4h，去离子水洗至中性，得到预处理完毕的D101型大孔吸附树脂。
3)将步骤2)预处理完毕的D101型大孔吸附树脂装填于层析柱中，再将pH值调至5.0的步骤1)所得预处理完毕的生物转化液装填于该层析柱中，得到分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱；
4)分别用2个柱体积的0.15M浓度的Na2CO3水溶液、4个柱体积的体积百分浓度55％的乙醇水溶液对步骤3)所得分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱进行洗脱各一次，收集乙醇水溶液洗脱而得的洗脱液，该洗脱液的HPLC检测结果与图3无实质性差别，此处不再熬述，经计算该洗脱液中产品2′-脱氧腺苷的纯度为70.7％，收率为92.6％。
5)由于上述步骤4)所得洗脱液中仍含有少量胸苷和碱基，减压浓缩(真空度为10Pa，时间30分钟。)洗脱液，向其中加入0.5倍体积的无水乙醇，于冰箱中在4℃结晶，得到2′-脱氧腺苷晶体粗品，HPLC检测并用标准曲线计算可知，该粗品的纯度为89.87％，将该2′-脱氧腺苷晶体粗品用体积百分浓度为20％的乙醇水溶液进行重结晶，所用体积百分浓度为20％的乙醇水溶液的用量为该2′-脱氧腺苷晶体粗品体积的0.4倍，该HPLC检测结果与图4无实质性差别，此处不再熬述，经计算该2′-脱氧腺苷晶体的纯度为99.3％，收率为71.2％。
该实施例中所用生物转化液是按照如下方法制备而得：
(1)将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CGMCC 1.1877(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种到斜面培养基，40℃，pH值为6.5，培养24小时制成斜面菌种；斜面培养基由下列重量份的组分组成：
葡萄糖15份、蛋白胨18份、酵母膏6份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、硫酸钠8份、硫酸锰0.02份，琼脂20份和水1000份。
(2)接种发酵
将斜面菌株接入发酵培养基中扩大培养作为种子液；将种子液按20％(体积百分比)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中37℃，140转/分钟，pH值为6.5，发酵36小时；发酵培养基由下列重量份的组分组成：
葡萄糖15份、蛋白胨5份、玉米麸质粉20份、柠檬酸胺2份、磷酸氢二钾2份、 硫酸钠9份、硫酸锰0.02份水1000份。
(3)制备生物转化液
a)发酵液在4℃、10000转/分钟、离心10分钟，收集湿菌体；
b)柠檬酸缓冲液(pH值为6.0)洗涤步骤a)菌体，4℃离心10分钟，收集湿菌体，称重，用磷酸缓冲液(pH值为6.0)重悬菌体，制成15％(湿菌体重量和缓冲液的体积比)的细胞悬浮液；
c)步骤b)的细胞悬浮液置于冰浴中，超声波破碎10分钟，超声波功率为340瓦，频率为4次/10秒；
d)向步骤c)的破碎液中加入底物2′-脱氧胸苷和腺嘌呤混合后50℃反应24小时，得到生物转化液；每升破碎液中加入2′-脱氧胸苷50g和腺嘌呤30g，腺嘌呤为通过气流粉碎后的粉末，直径小于10μm；
HPLC检测(色谱柱：Diamonsil C18，5um，250x4.6mm；流动相：由甲醇和pH值为6.0的磷酸缓冲盐以体积比为30∶70组成的混合液，该磷酸缓冲盐是由0.01mol/L的磷酸一氢钾水溶液和0.01mol/L的磷酸二氢钾水溶液组成；流速：0.9ml/min；检测波长：254nm)2′-脱氧胸苷转化为2′-脱氧腺苷的转化率达80％，每升生物转化液中含有2′-脱氧腺苷41g。
Claims (10)
1.一种分离纯化2′-脱氧腺苷的方法，包括如下步骤：
1)将生物转化液离心，取上清液，置于0-25℃冰箱中保存，得到预处理完毕的所述生物转化液；
2)将pH值调节至5-8的所述预处理完毕的生物转化液上样于所述层析柱中，依次用碳酸钠水溶液和乙醇水溶液进行洗脱，收集用所述乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液；
所述层析柱中的介质为离子交换树脂或大孔吸附树脂；
3)将所述步骤2)得到的洗脱液中加入无水乙醇，于0-25℃结晶后得到2′-脱氧腺苷晶体粗品，将所述2′-脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶，得到所述2′-脱氧腺苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)离心步骤中，温度为0-25℃，优选4℃，时间为10-60分钟，优选20分钟，转速为3000-8000rpm，优选4000rpm，离心半径为150-400mm，优选200mm；
所述生物转化液是按照如下方法制备而得：以2′-脱氧胸苷为核糖基供体，腺嘌呤为碱基供体，通过微生物发酵产生的核糖磷酸化酶进行生物转化，得到所述生物转化液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，制备所述生物转化液步骤中，所述微生物为瑞士乳杆菌。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述离子交换树脂为阴离子树脂；所述阴离子交换树脂为717型阴离子树脂、D201型阴离子树脂或D290型阴离子树脂，优选717型阴离子树脂；
所述大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂、DM18型大孔吸附树脂、HPD722型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂，优选D101型大孔吸附树脂。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述层析柱中的介质在使用前进行如下预处理：将所述层析柱中的介质先用乙醇水溶液浸泡后，用去离子水洗涤后用氢氧化钠水溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性后用盐酸水溶液浸泡，最后用去离子水洗涤至中性；所述乙醇水溶液的体积百分浓度为75-99％，优选95％，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.5-2mol/L，优选1mol/L，所述盐酸水溶液的浓度为0.5-2mol/L，优选1mol/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述用乙醇水溶液浸泡步骤中，时间为12-36小时，优选24小时；所述用氢氧化钠水溶液浸泡步骤中，时间为2-8小时，优选4小时；所述用盐酸水溶液浸泡步骤中，时间为2-8小时，优选4小时。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述碳酸钠水溶液的浓度为0.05M-0.2M，优选0.1M，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为30-75％，优选45％。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述用碳酸钠水溶液进行洗脱步骤中，所述碳酸钠水溶液的用量为所述分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱的柱体积的2-10倍，优选4倍，洗脱次数为1次；
所述用乙醇水溶液进行洗脱步骤中，所述乙醇水溶液的用量为所述分离纯化2′-脱氧腺苷用层析柱的柱体积的1-5倍，优选3倍，洗脱次数为1次。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)所述加入无水乙醇步骤中，无水乙醇的用量为所述步骤2)得到的洗脱液体积的0.2-2倍，优选0.5倍；
所述2′-脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶步骤中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为45％，所述乙醇水溶液的用量为所述2′-脱氧腺苷晶体粗品体积的0.2-2倍，优选0.4倍。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述生物转化液是按照包括如下步骤的方法制备而得：将瑞士乳杆菌接入发酵培养基中发酵培养，得到菌体，将所述菌体破碎，制成细胞破碎液，向所述细胞破碎液中加入2′-脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得所述2′-脱氧腺苷；所述腺嘌呤的直径小于等于10μm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010263106 CN101962397A (zh) | 2010-08-25 | 2010-08-25 | 生物转化液中分离纯化2＇-脱氧腺苷的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010263106 CN101962397A (zh) | 2010-08-25 | 2010-08-25 | 生物转化液中分离纯化2＇-脱氧腺苷的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101962397A true CN101962397A (zh) | 2011-02-02 |
Family
ID=43515459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010263106 Pending CN101962397A (zh) | 2010-08-25 | 2010-08-25 | 生物转化液中分离纯化2＇-脱氧腺苷的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101962397A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178541A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-12-03 | 西藏天虹科技股份有限责任公司 | 一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法 |
| CN105859809B (zh) * | 2016-04-09 | 2018-12-04 | 南昌大学 | 一种从发酵液中提取β-胸苷的方法 |
| CN111500659A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-08-07 | 苏州汇涵医用科技发展有限公司 | 一种利用酶催化制备2`-脱氧腺苷纯品的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575630A (zh) * | 2009-06-03 | 2009-11-11 | 北京博尔莱生物技术有限公司 | 生物转化法生产脱氧腺苷的方法 |
-
2010
- 2010-08-25 CN CN 201010263106 patent/CN101962397A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575630A (zh) * | 2009-06-03 | 2009-11-11 | 北京博尔莱生物技术有限公司 | 生物转化法生产脱氧腺苷的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《Eur.J.Biochem.》 19711231 Wolfgang UERKVITZ Trans-N-deoxyribosylase from Lactobacillus helveticus Crystallization and Properties 第387-395页 1-10 第23卷, * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178541A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-12-03 | 西藏天虹科技股份有限责任公司 | 一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法 |
| CN105859809B (zh) * | 2016-04-09 | 2018-12-04 | 南昌大学 | 一种从发酵液中提取β-胸苷的方法 |
| CN111500659A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-08-07 | 苏州汇涵医用科技发展有限公司 | 一种利用酶催化制备2`-脱氧腺苷纯品的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11149048B2 (en) | High-purity D-psicose preparation method | |
| EP3088515A1 (en) | Ensifer sp. strain and method for producing psicose using same | |
| WO2017099418A1 (ko) | 마이크로박테리움 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 | |
| US11279961B2 (en) | Aspergillus oryzae BLCY-006 strain and application thereof in preparation of galactooligosaccharide | |
| WO2018099366A1 (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用 | |
| CN101691538A (zh) | 一种米曲霉菌种及其制备高纯度低聚半乳糖的方法 | |
| CN101555503A (zh) | 一种从生产木糖的废木糖母液中分离提取l-阿拉伯糖的方法 | |
| CN108486160A (zh) | 高密度发酵合成莱鲍迪苷a的方法 | |
| CN105886573A (zh) | 一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 | |
| EP3633023B1 (en) | Strain in microbacterium and method for producing psicose using same | |
| CN101962397A (zh) | 生物转化液中分离纯化2＇-脱氧腺苷的方法 | |
| CN104059857B (zh) | 一株曲霉及其在制备果糖基转移酶中的应用 | |
| Lo et al. | Fermentative hydrogen production from hydrolyzed cellulosic feedstock prepared with a thermophilic anaerobic bacterial isolate | |
| CN108949713A (zh) | 一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的应用 | |
| CN101575630A (zh) | 生物转化法生产脱氧腺苷的方法 | |
| CN103773827A (zh) | 一种提高α-熊果苷产量的方法 | |
| CN109628505A (zh) | 一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法 | |
| CN103820362A (zh) | 一种生物合成庆大霉素x2工程菌的构建及其应用 | |
| CN110372606B (zh) | 一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法 | |
| CN109868245A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌bsln-08及其培养方法和应用 | |
| CN106191157B (zh) | 一种低聚乳果糖的制备方法 | |
| CN109749968A (zh) | 一株生物催化合成(r)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN111073830B (zh) | 一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用 | |
| CN103667369A (zh) | 一种生物发酵法转化甘油生产二羟基丙酮的方法 | |
| CN103740610B (zh) | 链球菌auh-jld109及其在柚皮素生物合成中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110202 |