CN103773827A - 一种提高α-熊果苷产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris），CGMCC NO.1243发酵催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷的制备方法。它包括固定化对苯二酚的制备，微生物发酵，反应条件优化和产物分离提取等工艺步骤。采用本发明生产α-熊果苷，每升发酵液α－熊果苷产量为20-235g，比直接用对苯二酚作为反应物的产量最大提高了14倍，对苯二酚转化率达到90.5-95.2%，经产物分离纯化后，产品纯度可达99.5％以上。本发明通过对苯二酚固定化，提高了菌体对对苯二酚的耐受度，简化了产物后续分离纯化工艺，减少了体系含酚废水的排放；具有产量高、生产工艺简单、生产成本低、环境友好等优点，大大降低了α－熊果苷生产成本低，为大规模低成本生产α－熊果苷奠定了基础。

Description

一种提高α-熊果苷产量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243发酵催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷的制备方法。 

背景技术

α－熊果苷具有显著抑制酪氨酸酶的活性，可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效。在比较α-熊果苷与其同分异构体β-熊果苷的美白效果时，Kazuhisa Sugimotod等通过人体黑素瘤细胞的实验，发现α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上。目前，α－熊果苷是国际公认的并正在极力推广的高效、安全的美白剂，是美白、祛斑、防晒化妆品理想的添加成份。 

作为α－熊果苷合成反应物的对苯二酚具有杀菌作用，它可以通过降低细胞内巯基水平及升高活性氧水平改变细胞内氧化还原状态而引起细胞凋亡。当α-熊果苷合成反应体系中对苯二酚浓度超过一定量时,会对菌体产生抑制作用，导致菌体催化能力下降，不利于α－熊果苷的生产。因此，研究一种既可以提高反应体系对苯二酚浓度又可以降低其毒害作用的方法，成为大规模低成本生产α－熊果苷的必然选择。 

固定化(immobilized)技术是用化学或物理手段将物体定位于限定空间区域的一门新兴技术，在化工、发酵、能源、医药等行业应用广泛。大孔吸附树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附树脂，有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。 

目前，由于利用化学合成方法很难合成α－熊果苷，所以关于α－熊果苷的制备方法主要通过生物转化法来实现。如今关于α－熊果苷生产的报道主要有日本Kohtaro Kirimura，国内张鹏、李群良、姜岷、庞宗文及杜刚等。但这些方法均存在以下一些问题： 

一、催化剂（菌体或酶）对对苯二酚的耐受度不高，导致α－熊果苷的产量也不高； 

二、α-熊果苷转化率不高，导致原材料利用率不高； 

三、产物α－熊果苷后续分离纯化工艺复杂、设备投资及操作费用均较大； 

四、生产过程有含对苯二酚废水产生，污染环境。 

为了克服这些问题，固定化对苯二酚是最好的解决办法。通过把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，使得发酵液溶液中的对苯二酚浓度基本为零，菌体的生长代谢将不受任何影响，可以更好地催化合成α－熊果苷；此外，把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，可以大大提高催化剂对对苯二酚的耐受度，提高单位体积发酵液中对苯二酚的浓度，从而大大提高α－熊果苷的产量；再者，待反应结束后，产物和未反应的对苯二酚依然固定在树脂上，产物后续处理只需用简单过滤即可把产物和发酵液进行有效分离，大大简化了后续产物分离纯化工艺及设备投资，并减少了发酵液中含对苯二酚废水排放，对环境的污染基本没有。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用固定化对苯二酚提高菌体对对苯二酚耐受度，提高单位体积发酵液中对苯二酚的浓度，进而提高α－熊果苷的产量。其中固定化对苯二酚即采用大孔吸附树脂吸附法对对苯二酚进行固定化，并用此固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243催化合成α－熊果苷的反应物，在最佳反应条件下催化合成α－熊果苷。该方法具有提高菌体对对苯二酚的耐受度，简化产物后续分离纯化工艺，减少含酚废水排放等优点，大大降低了α－熊果苷生产成本低，为大规模低成本生产α－熊果苷奠定了基础。 

本发明的整体技术构思是： 

利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243催化合成α-熊果苷的反应物，该方法由下列工艺步骤组成： 

（1）固定化对苯二酚的制备； 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵，其中包括种子培养和发酵罐培养； 

（3）加入固定化对苯二酚和双糖进行合成反应； 

（4）α-熊果苷的分离纯化。 

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是： 

步骤（1）中固定化对苯二酚的制备： 

先制得质量百分比浓度为1-10％的对苯二酚水溶液；然后往每100ml对苯二酚水溶液加入10g大孔吸附树脂进行吸附；把吸附后的树脂用滤纸过滤，然后用去离子水洗净树脂表面的对苯二酚溶液，制得吸附量为0.1-1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

步骤（2）中野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为25－40℃，转速为50-200r/min摇床中培养10－24h后得一级种子液；再将一级种子液按1－10％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为25－40℃，转速为50-300r/min，通风量为0.1-2vvm条件下培养10－24h得二级种子液；以5－15％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为25－40℃，通风量为0.1-2vvm，转速为50-300r/min条件下培养10－24h。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

双糖10-60份，蛋白胨1-10份，酵母粉1-5份，硫酸镁1-2份，磷酸氢二钾1-2份，氯化钠1-2份和水1000份。 

步骤（3）中的合成反应条件为： 

往发酵罐中加入固定了对苯二酚的大孔吸附树脂和双糖，其中大孔吸附树脂的质量浓度为10-100g树脂/l发酵液，双糖物质量浓度为10-2000mmol/l；在反应温度为20-50℃，通风量为0.1-2vvm，转速为50-300r/min条件下反应24-72h。 

步骤（4）中α-熊果苷的分离纯化包括以下三个步骤： 

①将发酵完成后的发酵液用滤纸过滤得到大孔吸附树脂，然后用去离子水把树脂表面的发酵液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为2-12h。 

本发明提供的利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243催化合成α－熊果苷反应物的方法，适用于以非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂为固定化介质的固定化对苯二酚的方法。 

本发明所用的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所（100080），保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243，保藏时间为2004年11月8日。 

本发明所取得的技术进步在于： 

本发明是通过以固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243催化合成α－熊果苷的反应物，解决了直接用对苯二酚作为反应物所存在的发酵液中对苯二酚浓度不高导致α－熊果苷产量无法提高，产物后续分离工艺复杂，含酚废水导致的环境污染等问题。利用本发明生产α－熊果苷的方法具有如下优点： 

（1）利用固定化对苯二酚提高菌体对对苯二酚耐受度，提高单位体积发酵液中对苯二酚浓度，进而提高α－熊果苷的产率，降低α－熊果苷的生产成本，使大规模生产α－熊果苷成为了可能； 

（2）在反应结束后，产物是直接固定在树脂上的，产物只需用简单过滤即可把产物和发酵液进行有效分离，大大简化了产物后续分离纯化工艺及其设备投资； 

（3）在反应结束后，未反应的对苯二酚依然固定在树脂上，发酵液中没有对苯二酚的存在，从而减少含酚废水排放，对环境不造成任何污染。 

采用本发明生产的α－熊果苷具有产量高，工艺步骤简单，生产成本低等优点，每升发酵液α－熊果苷产量为20-235g，比直接用对苯二酚作为反应物（ZL200410090980.5与ZL200510080364.6）的产量提高了2-14倍，对苯二酚转化率达到90.5-95.2%，经分离纯化后，产品纯度可达99.5％以上，具有重大工业化意义。 

本发明的方法涉及的非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂，既可用公知的方法合成，也可以是市场销售产品。作为市场销售的大孔吸附树脂的代表例子，例如下面所列举的实施例只是为了更详细地说明本发明，但本发明不受它们的任何限定。 

具体实施方式

实施例1 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先制得质量百分比浓度为10％的对苯二酚水溶液；然后往每100ml对苯二酚水溶液加入10g非极性大孔吸附树脂如D201、D4020、D4006、D3520、H1020、H103、H107、HPD-100、PS、NKA、X-5或YWD01B进行吸附；把吸附后的树脂用滤纸过滤，然后用去离子水洗净树脂表面的对苯二酚溶液，制得吸附量为1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为30℃，转速为100r/min摇床中培养15h后得一级种子液；再将一级种子液按5％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为30℃，转速为100r/min，通风量为1vvm条件下培养15h得二级种子液；以10％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为30℃，通风量为1vvm，转速为120r/min条件下培养15h。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

蔗糖20份，蛋白胨5份，酵母粉2份，硫酸镁1.5份，磷酸氢二钾1份，氯化钠1份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往10000升发酵罐中加入固定了对苯二酚的非极性大孔吸附树脂和蔗糖，其中树脂的质量浓度为50g树脂/l发酵液，蔗糖物质量浓度为1000mmol/l；在反应温度为30℃，通风量为1vvm，转速为150r/min条件下反应72h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α－熊果苷的转化率达93.5％，每升反应液中含α－熊果苷115.6g。 

（4）α-熊果苷的分离纯化： 

①将发酵完成后的发酵液用滤纸过滤得到大孔吸附树脂，然后用去离子水把树脂表面的发酵液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

实施例2 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先制得质量百分比浓度为5％的对苯二酚水溶液；然后往每100ml对苯二酚水溶液加入10g极性大孔吸附树脂如NKA-9、NKA-II、S-8、HPD-600或YWD06进行吸附；把吸附后的树脂用滤纸过滤，然后用去离子水洗净树脂表面的对苯二酚溶液，制得吸附量为0.5g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株， 加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为30℃，转速为200r/min摇床中培养10h后得一级种子液；再将一级种子液按10％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为30℃，转速为150r/min，通风量为0.5vvm条件下培养12h得二级种子液；以10％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为30℃，通风量为0.5vvm，转速为150r/min条件下培养12h。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

蔗糖40份，蛋白胨2份，酵母粉5份，硫酸镁1份，磷酸氢二钾1份，氯化钠2份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往10000升发酵罐中加入固定了对苯二酚的非极性大孔吸附树脂和蔗糖，其中树脂的质量浓度为100g树脂/l发酵液，蔗糖物质量浓度为1000mmol/l；在反应温度为30℃，通风量为1vvm，转速为200r/min条件下反应72h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α－熊果苷的转化率达90.5％，每升反应液中含α－熊果苷111.9g。 

（4）α-熊果苷的分离纯化： 

①将发酵完成后的发酵液用滤纸过滤得到大孔吸附树脂，然后用去离子水把树脂表面的发酵液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

实施例3 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先制得质量百分比浓度为2％的对苯二酚水溶液；然后往每100ml对苯二酚水溶液加入10g弱极性大孔吸附树脂如AB-8或YWD03F进行吸附；把吸附后的树脂用滤纸过滤，然后用去离子水洗净树脂表面的对苯二酚溶液，制得吸附量为0.2g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为30℃，转速为150r/min摇床中培养10h 后得一级种子液；再将一级种子液按2％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为30℃，转速为100r/min，通风量为1.5vvm条件下培养20h得二级种子液；以10％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为30℃，通风量为1.5vvm，转速为150r/min条件下培养10h。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

麦芽糖50份，蛋白胨5份，酵母粉5份，硫酸镁1.5份，磷酸氢二钾2份，氯化钠1份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往10000升发酵罐中加入固定了对苯二酚的非极性大孔吸附树脂和麦芽糖，其中树脂的质量浓度为100g树脂/l发酵液，麦芽糖物质量浓度为400mmol/l；在反应温度为30℃，通风量为1.5vvm，转速为200r/min条件下反应48h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α－熊果苷的转化率达95.0％，每升反应液中含α－熊果苷47.0g。 

（4）α-熊果苷的分离纯化： 

①将发酵完成后的发酵液用滤纸过滤得到大孔吸附树脂，然后用去离子水把树脂表面的发酵液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

实施例4 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先制得质量百分比浓度为5％的对苯二酚水溶液；然后往每100ml对苯二酚水溶液加入10g中等极性大孔吸附树脂如HPD-450或YWD04进行吸附；把吸附后的树脂用滤纸过滤，然后用去离子水洗净树脂表面的对苯二酚溶液，制得吸附量为0.5g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为30℃，转速为150r/min摇床中培养15h后得一级种子液；再将一级种子液按5％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为 30℃，转速为150r/min，通风量为2vvm条件下培养12h得二级种子液；以10％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为30℃，通风量为2vvm，转速为150r/min条件下培养12h。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

乳糖30份，蛋白胨10份，酵母粉5份，硫酸镁1份，磷酸氢二钾2份，氯化钠2份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往10000升发酵罐中加入固定了对苯二酚的非极性大孔吸附树脂和乳糖，其中树脂的质量浓度为50g树脂/l发酵液，乳糖物质量浓度为500mmol/l；在反应温度为30℃，通风量为1vvm，转速为150r/min条件下反应72h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α－熊果苷的转化率达94.5％，每升反应液中含α－熊果苷58.4g。 

（4）α-熊果苷的分离纯化： 

①将发酵完成后的发酵液用滤纸过滤得到大孔吸附树脂，然后用去离子水把树脂表面的发酵液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

Claims (9)

1.一种提高α-熊果苷产量的方法,其特征在于:用大孔吸附树脂对对苯二酚进行固定化，然后用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243发酵催化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷，该方法由下列工艺步骤组成：

（1）固定化对苯二酚的制备；

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵，其中包括种子培养和发酵罐培养；

（3）加入固定化对苯二酚和双糖进行合成反应；

（4）α-熊果苷的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：所述的（1）步骤中固定化对苯二酚的制备是利用大孔吸附树脂吸附法制备，其步骤是：先制得质量百分比浓度为1-10％的对苯二酚水溶液；然后往每100ml对苯二酚水溶液加入10g大孔吸附树脂进行吸附；把吸附后的树脂用滤纸过滤，然后用去离子水洗净树脂表面的对苯二酚溶液，制得吸附量为0.1-1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。

3.根据权利要求1或2所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：所述的用于固定化对苯二酚的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂。

4.根据权利要求1所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：所述的（2）步骤中的种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成：双糖10-60份，蛋白胨1-10份，酵母粉1-5份，硫酸镁1-2份，磷酸氢二钾1-2份，氯化钠1-2份和水1000份。

5.根据权利要求1或4所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：种子液培养的工艺条件为培养温度为25-40℃，摇床转速为50-200r/min，发酵时间为10-24h；发酵液培养的工艺条件为种子液接种量为1-10％，培养温度为25-40℃，通风量为0.1-2vvm，搅拌转速为50-300r/min，发酵时间为10-24h。

6.根据权利要求1所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：所述的（3）步骤中的反应条件为：固定化对苯二酚大孔吸附树脂质量浓度为10-100g树脂/L发酵液，双糖物质量浓度为10-2000mmol/L，反应温度为20-50℃，搅拌转速为50-300r/min，反应时间为24-72h。

7.根据权利要求1或6所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：所述的双糖为蔗糖，麦芽糖或乳糖。

8.根据权利要求1所述的一种提高α-熊果苷产量的方法，其特征在于：所述的（4）步骤中的α-熊果苷的分离纯化包括以下三个步骤：

①将反应完成后的发酵液用滤纸过滤得到大孔吸附树脂，然后用去离子水把树脂表面的发酵液洗干净；

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液；

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为2-12h。

9.野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243。