CN100523209C

CN100523209C - 酶转化生产l—鸟氨酸的方法

Info

Publication number: CN100523209C
Application number: CNB200610112035XA
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 张淑荣; 刘春巧; 杨育红
Original assignee: Individual
Current assignee: Shandong Hongda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2026-08-29
Also published as: CN1908177A

Abstract

本发明涉及L-鸟氨酸的制备方法，它包括斜面种子的制备，培养基的选择，转化条件的优化和产物的提取等工艺步骤。本发明通过粪肠球菌酶转化生产L-鸟氨酸，具有生产成本低，生产条件温和，转化体系中杂质较少，工艺步骤简单，生产操作安全等优点。采用本发明生产L-鸟氨酸产量高，每升发酵液中含有90-112g L-鸟氨酸，精氨酸转化率可达99.5%。L-鸟氨酸是细胞中重要的代谢化合物，对于生物体内氨态氮的排出有重要调节作用；此外，L-鸟氨酸还是重要的医药工业基础原料。

Description

酶转化生产L—鸟氨酸的方法

技术领域

本发明涉及L—鸟氨酸的制备方法。

背景技术

目前，国内外对于酶法转化生产L—鸟氨酸的文献尚未见报道。L—鸟氨酸的制备方法主要有化学法和发酵法，其中化学法是以精氨酸为原料，经碱法水解或利用精氨酸酶水解得到L—鸟氨酸；而发酵法是利用微生物发酵生产L—鸟氨酸，常用于发酵生产L—鸟氨酸的微生物有：谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌、大肠杆菌、解烃棒杆菌、洁白链霉菌等。由于化学法生产L—鸟氨酸条件苛刻，大量使用有机溶剂，给环境带来严重污染；而发酵法生产L—鸟氨酸产量低(一般只有10g/L)，周期长，产物杂质多，分离困难；采用上述方法制备L—鸟氨酸产率不高，所以生产的L—鸟氨酸成本很高，给实际推广应用带来了很大困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种L—鸟氨酸的制备方法，该制备方法通过对粪肠球菌进行筛选、诱变获得一株L—鸟氨酸产率很高、专一性强的菌株粪肠球菌CGMCC NO.1786，选用合适的培养基在最适培养条件下培养一定时间，加入精氨酸，在最佳转化条件下酶转化生产L—鸟氨酸，转化液通过离子交换树脂柱的分离、纯化后，可得到高纯度的L—鸟氨酸。该方法具有生产条件温和、生产周期短、产品纯度高、产量高、生产成本低等优点。

本发明的整体技术构思是：

发酵法生产L—鸟氨酸，该方法由下列工艺步骤组成：

(1)将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；

(2)将斜面菌株扩大培养作为种子液；

(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵；

(4)加入精氨酸作为底物进行转化；

(5)L—鸟氨酸的分离纯化。

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：

步骤(1)中斜面培养基由下列重量份组分组成：

葡萄糖5—10份、尿素10—20份、玉米浆2.0—3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15—20份和水1000份；

制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为7.0—8.0、温度25—35℃、培养时间为24—48小时。

步骤(2)中种子培养基和步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成：

葡萄糖40—60份、尿素10—20份、玉米浆2.0—3.5份，硫酸镁0.5—1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；

发酵的工艺条件为：发酵液接种量为10—15％，pH值为6.0—7.5，培养温度为25—35℃，通风量为0.5—1.0vvm，搅拌转速为120—160转/分钟，发酵时间为24—36小时。

步骤(4)中转化条件为：底物精氨酸质量浓度为120—150g/1，转化温度为30—55℃，转化时间为36—72小时，搅拌转速为80—120转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L—鸟氨酸的转化率达95—99.5％，每升发酵液中含L—鸟氨酸90—112g。

步骤(5)中L—鸟氨酸的分离纯化包括以下四个步骤：

a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；

b、把经过a步骤后的发酵液通过弱酸性阳离子交换树脂柱除去阳离子杂质，弱酸性阳离子交换树脂柱为724型树脂柱；

c、把经过b步骤的发酵液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化，磺酸型阳离子交换树脂柱为D001树脂柱；

d、把经过c步骤的发酵液真空浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L—鸟氨酸，真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。

本发明所用的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为粪肠球菌CGMCC NO.1786，保藏时间为2006年8月28日。

粪肠球菌CGMCC NO.1786的筛选，由下列工艺步骤组成：

(1)将安培管粪肠球菌菌种接种斜面制得斜面菌种；

(2)将复壮后菌种涂布平板；

(3)将平板菌落接种摇瓶发酵培养，进行初筛和复筛；

(4)将复筛后的菌株进行复合诱变。

步骤(1)中斜面培养基和步骤(2)中的平板培养基由下列重量份组分组成：

制备斜面菌种和平板的工艺条件为pH值为7.0—8.0、温度25—35℃、培养时间为24—48小时。

步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成：

发酵的工艺条件为：pH值为7.0—7.5，培养温度为25—35℃，搅拌转速为120—160转/分钟，发酵时间为24—36小时。

步骤(4)中诱变依次包括种子菌悬液的制备，诱变剂的加入量，紫外照射。

将斜面菌种接种到含5ml生理盐水试管中，往试管中加入体积百分比为0.5％—2.0％的硫酸二乙酯诱变剂，在漩涡振荡器上振荡1—2min，取0.5ml该菌悬液涂布平板，把平板放在紫外灯照射20—60s，然后把平板暗培养。培养条件为：培养温度25—35℃、培养时间为48—72小时。

最后，得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。

本发明所取得的技术进步在于：

本发明是粪肠球菌CGMCC NO.1786酶法生产L—鸟氨酸，具有生产成本低，生产条件温和，转化体系中杂质较少，工艺步骤简单，生产操作安全等优点。采用本发明生产L—鸟氨酸产量高，每升发酵液中含有90—112g L—鸟氨酸，精氨酸转化率可达99.5％。通过离子交换树脂分离纯化，纯度可达到99.5％以上，具有重大工业化意义。

实施例：

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

(1)菌种斜面培养

将粪肠球菌CGMCC NO.1786菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；

其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：

葡萄糖5份、尿素20份、玉米浆3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15份和水1000份；

制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.5、温度30℃、培养时间为24小时。

(2)接种发酵

将斜面菌株扩大培养作为种子液；

将种子液按10％的接种量接入发酵罐中进行发酵；

其中种子培养基和发酵液由下列重量份组分组成：

葡萄糖60份、尿素15份、玉米浆3.0份，硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；

发酵的工艺条件为：发酵液接种量为10％，pH值为6.0，培养温度为30℃，通风量为0.8vvm，搅拌转速为160转/分钟，发酵时间为36小时。

(3)生产L—鸟氨酸

加入底物质量浓度为150g/l；

其中转化条件为：转化温度为35℃，转化时间为48小时，搅拌转速为100转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L—鸟氨酸的转化率达99.5％，每升发酵液中含L—鸟氨酸112g。(4)L—鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤：

a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；

b、步把经过a步骤后的发酵液通过724型弱酸性阳离子交换树脂柱除去NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺等阳离子杂质；

c、把经过b步骤的发酵液通过D001磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化；

d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达99.5％。

实施例2

(1)菌种斜面培养

其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：

葡萄糖8份、尿素15份、玉米浆3.0份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15份和水1000份；

制备斜面菌种的工艺条件为pH值为8.0、温度40℃、培养时间为36小时。

(2)接种发酵

将斜面菌株扩大培养作为种子液；

将种子液按10％的接种量接入发酵罐中进行发酵；

其中种子培养基和发酵液由下列重量份组分组成：

葡萄糖50份、尿素20份、玉米浆3.5份，硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；

发酵的工艺条件为：发酵液接种量为10％，pH值为6.5，培养温度为37℃，通风量为1.0vvm，搅拌转速为140转/分钟，发酵时间为36小时。

(3)生产L—鸟氨酸

加入底物质量浓度为135g/l；

其中转化条件为：转化温度为44℃，反应时间为48小时，搅拌转速为100转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L—鸟氨酸的转化率达95.0％，每升发酵液中含L—鸟氨酸96.2g。

(4)L—鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤：

a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；

实施例3

(1)菌种斜面培养

其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：

葡萄糖10份、尿素10份、玉米浆2.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15份和水1000份；

制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0、温度30℃、培养时间为48小时。

(2)接种发酵

将斜面菌株扩大培养作为种子液；

将种子液按10％的接种量接入发酵罐中进行发酵；

其中种子培养基和发酵液由下列重量份组分组成：

葡萄糖45份、尿素20份、玉米浆3.0份，硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份；

(3)生产L—鸟氨酸

加入底物质量浓度为125g/l；

其中转化条件为：转化温度为50℃，反应时间为48小时，搅拌转速为100转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L—鸟氨酸的转化率达98.5％，每升发酵液中含L—鸟氨酸92.4g。

(4)L—鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤：

a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；

Claims

1、酶转化生产L—鸟氨酸的方法，其特征在于：酶转化生产L—鸟氨酸，生产过程由下列工艺步骤组成：

(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液；

(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵，其发酵条件为：发酵液接种量为10—15％，pH值为6.0—7.5，培养温度为25—35℃，通风量为0.5—1.0vvm，搅拌转速为120—160转/分钟，发酵时间为24—36小时；

(4)加入精氨酸作为底物进行转化，其转化条件为：底物精氨酸质量浓度为120—150g/l，转化温度为30—55℃，转化时间为36—72小时，搅拌转速为80—120转/分钟，在此转化条件下，精氨酸转化为L—鸟氨酸的转化率达95—99.5％，每升发酵液中含L—鸟氨酸90—112g；

(5)L—鸟氨酸的分离纯化。

2、根据权利要求1所述的酶转化生产L—鸟氨酸的方法，其特征在于：所述的(1)步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成：

葡萄糖5—10份、尿素10—20份、玉米浆2.0—3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份，琼脂15—20份和水1000份。

3、根据权利要求1或2所述的酶转化生产L—鸟氨酸的方法，其特征在于：制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为7.0—8.0、温度25—35℃、培养时间为24—48小时。

4、根据权利要求1所述的酶转化生产L—鸟氨酸的方法，其特征在于：所述的(2)步骤中的种子培养基和(3)步骤中发酵液由下列重量份组分组成：

葡萄糖40—60份、尿素10—20份、玉米浆2.0—3.5份、硫酸镁0.5—1.0份、磷酸氢二钾1.0份、氯化钠5.0份、碳酸钙2.0份、硫酸铁0.02份、硫酸锰0.02份和水1000份。

5、根据权利要求1所述的酶转化生产L—鸟氨酸的方法，其特征在于：所述的(5)步骤中的L—鸟氨酸的分离纯化包括以下四个步骤：

a、将发酵完成后的发酵液离心除去菌体；

b、把经过a步骤后的发酵液通过弱酸性阳离子交换树脂柱除去阳离子杂质；

c、把经过b步骤的发酵液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进一步进行分离纯化；

d、把经过c步骤的发酵液真空浓缩、结晶，即可得到纯度为99.5％以上的L—鸟氨酸。

6、根据权利要求5所述的酶转化生产L—鸟氨酸的方法，其特征在于：所述的a步骤发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b步骤中的弱酸性阳离子交换树脂柱为724型树脂柱；c步骤中的磺酸型阳离子交换树脂柱为D001树脂柱；d步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品纯度达99.5％以上。