CN102191291B - 一种利用基因工程菌生产l-鸟氨酸盐酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub大肠杆菌基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法，该菌株能够表达产生超量的枯草芽孢杆菌精氨酸酶，高效的转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌的应用，具体涉及一种利用大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO-
Arg-Bsub基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法。
背景技术
一、L-鸟氨酸的生理功能和其医疗保健价值：
L-鸟氨酸是一种非蛋白氨基酸，是生物体合成精氨酸、脯氨酸等蛋白质氨基酸的前体物质。L-鸟氨酸在生物体内能够转化成腐胺，尸胺，亚精胺，精胺等多胺，多胺有促进生物组织生长的作用。带正电荷的多胺能和带负电的ＤＮＡ和ＲＮＡ结合，促进生物体ＤＮＡ的转录和ＲＮＡ的翻译；多胺能和细胞膜上的蛋白质或磷脂结合，使膜保持其稳定性。
L-鸟氨酸能够有效的刺激脑垂体诱导释放生长激素，促进脂肪代谢，肌肉生长和肝细胞再生，有利皮肤和组织伤口的愈合和修复。研究显示，鸟氨酸能够促进胸腺、肝脏和心脏组织的再生、加强肌肉的生长，增强免疫系统的功能。临床应用显示L-鸟氨酸对外科手术、烧伤病人、普通感染性疾病和肿瘤癌症的治疗有明显好处，L-鸟氨酸制剂对急性病人的恢复、对肝脏疾病、肝硬化病人的治疗有积极的意义。
L-鸟氨酸是生物体尿素循环代谢环中的重要成员，鸟氨酸接受二个NH4 +离子和一分子的CO2，形成一个L-精氨酸分子，在生物精氨酸酶的作用下，精氨酸被水解成鸟氨酸和尿素，尿素被排出生物体外起到排除血氨的生理功能。运动员补充L-鸟氨酸制品，肌肉的运动质量和强度在五周后会有显著提高。由于体育锻炼和剧烈体力活动可产生较多的血氨，引起肌体疲劳，而L-鸟氨酸能够吸收血氨抑制疲劳。
L-鸟氨酸的制剂，饮品和保肝护肝药品在国际市场上，具有一定的销售规模，L-鸟氨酸作为制备各种鸟氨酸药品保健品的基本原料，市场前景看好。
二、L-鸟氨酸盐酸盐的生产方法
L-鸟氨酸的生产方法有微生物发酵法和L-精氨酸弱碱水解法或者L-精氨酸酶法水解法。
中国专利（申请[公开]号 CN101323866A）公开了一种使用改造了的谷氨酸棒杆菌生产L-鸟氨酸的方法，葡萄糖的转化率为33%，发酵时间56小时，产酸率可以达到5～7%，收率70～80%。
中国专利（申请[公开]号 CN100340542C）公开了一种使用弱碱法（石灰乳）水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法，水解液中精氨酸的浓度为10%，产品的收率可以达到78～82%。
中国专利（申请[公开]号 CN1908177A）公开了一种使用微生物酶法（粪肠球菌精氨酸酶）水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法，培养微生物36小时后，加入转化底物L-精氨酸继续发酵水解L-精氨酸48小时，水解液中L-精氨酸的浓度为12%～15%，每升转化液中L-鸟氨酸的含量可以达到90～112克，再用树脂法分离出L-鸟氨酸。
我国是一个水解法生产L-胱氨酸和L-精氨酸的大国，L-精氨酸的成本低廉，利用L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸比起发酵法的生产成本更为经济。由于化学水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法常常引起L-鸟氨酸消旋，弱碱水解L-精氨酸的方法制备L-鸟氨酸，虽然能够减少消旋程度，但需要使用硫酸沉淀弱碱金属离子，会遇到过滤困难的问题，而且会产生一定的固体废物。发酵法生产L-鸟氨酸的産酸率不高，常伴随着产生少量的其他氨基酸，而且需要消耗一定量的粮食，而酶法生产L-鸟氨酸则可以克服化学水解法以及发酵法的弊端，且底物浓度高（15%），不产生杂酸（其他氨基酸），更利于产物的回收和精制，本专利公布的方法，采用TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub大肠杆菌基因工程菌湿菌体转化L-精氨酸为L-鸟氨酸，生产的产物不需要离子交换树脂法分离，可以直接减压浓缩结晶分离出合格的L-鸟氨酸盐酸盐来，方法较简便，生产周期显著缩短。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用大肠杆菌TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法。该大肠杆菌工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC(武汉大学)，保藏编号CCTCC No.
M2010358。
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学
保藏物名称：大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO- Arg-Bsub，
拉丁语名称：Escherichia coli, TOP10/PBAD/Thio-TOPO-
Arg-Bsub
本发明中的“TOP10/PBAD/Thio-TOPO- Arg-Bsub”，也可以按照“TOP10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub”来表示，其中的大小写的区别不会导致矛盾，它们之间可以互相更换
保藏日期：2010年12月22日。
该培养物的培养条件、检测存活性条件：
培养基：含100μg/ml Amp LB培养基，pH 7.0，培养温度37℃。
该培养物由如下方式得到：枯草芽孢杆菌中的精氨酸酶基因编码序列（argBsub），与pBAD/Thio-TOPO载体连接后，转化大肠杆菌E.coli
TOP10。
保存该培养物最适宜的方法：冷冻真空干燥法
该大肠杆菌工程菌能够有效的催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。
本发明提供的构建高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因工程菌的技术方案是：构建一种重组质粒（pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub），该重组质粒携带枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因的编码序列（arg-Bsub）。用该重组质粒转化大肠杆菌E.coli TOP10，通过抗生素筛选得到阳性转化菌株，测定阳性转化菌株的精氨酸酶活性，筛选出精氨酸酶高表达菌株，通过DNA序列分析确认高表达菌株含有重组质粒（pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub）。利用高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌株催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。
具体步骤是构建所述的重组质粒（pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub）和转化宿主菌大肠杆菌TOP10。构建重组质粒（pBAD/Thio-TOPO-argB-sub）的策略方案见图1
1. 材料与试剂
1.1. 遗传资源
感受态大肠杆菌TOP10菌种（Escherichia
coli TOP10），购自武汉天源生物技术公司。
线性TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO，购自武汉天源生物技术公司。
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）来自中国典型培养物保藏中心CCTCC（武汉大学），保藏号CCTCC No.93009。
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学
1.2
其他材料与试剂
提取枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC
No.93009)细菌基因组DNA所用得的试剂, DNA
molecular weight marker，缓冲液，溶菌酶，RNase，蛋白酶K等，购自基因有限公司。其它化学常规试剂均为分析纯试剂。
TaqDNA聚合酶、反应缓冲液，购自武汉天源生物技术公司。
1.1. 遗传资源
感受态大肠杆菌TOP10和线性TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO，TaqDNA聚合酶、反应缓冲液，购自英潍捷基[Invitrogen]贸易公司。
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）来自中国典型培养物保藏中心CCTCC,武汉大学，保藏编号CCTCC No.93009。
登录GenBank，通过GeneID:937760获取枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ）168菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列。
其他材料与试剂
提取枯草芽孢杆菌细菌基因组DNA所用得的试剂, DNA
molecular weight marker，缓冲液，溶菌酶，RNase，蛋白酶K等，购自基因有限公司。其它化学常规试剂均为分析纯试剂。
构建基因工程菌大肠杆菌
TOP10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub
的具体步骤
:
2.1.
设计合成一对
TA
克隆引物
登录GenBanK，通过Gene
ID: 937760获取枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ）168菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列，据此，利用Primerer 5.0 软件设计一对扩增888bp精氨酸酶基因DNA序列，用于pBAD/Thio-TOPO载体TA克隆所需的引物，p1、p2。(引物由英潍捷基[Invitrogen]（上海）贸易有限公司合成。)
p1:5′-GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3′,共26 bp。
p2:5′-GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3′,共23 bp。
２
.2
．提取枯草芽孢杆菌基因组
DNA
采用改进的Palva I等人的方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA。
(Paiva,
I . Molecular coloning of a-amylase gene from Bacillus amylolique faciens and
its expression in B. subtilis [J]. Gene, 1982, 19: 81-87)
(1).挑取枯草芽孢杆菌(保藏编号CCTCC
No.93009)菌株平板培养的单个菌落，接种到装有10ml牛肉膏，蛋白胨液体培养基的试管中，32℃振荡培养12小时。
(2).5000rpm离心10min,得到菌体沉淀，STE洗涤1次,再次离心,菌体重悬于4mlTE溶液中。
（3）.加入50mg/ml溶菌酶溶液8μl(终浓度为100μg/ml),37℃保温20min。再加入RNase(10mg/ml)10μl,至终浓度25μg/ml,然后加入10%SDS溶液0.5ml,37℃保温30min。加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl,终浓度为50μg/ml,37℃保温60min。
(4).再加入等体积的水饱和酚,混匀,8000rpm离心5min,取上清于另一个离心管中。
(5).上清液中加入等体积的酚:氯仿（1∶1体积）混合液,混匀,8000rpm离心5min,取上清置于另一个离心管中。
(6).加入1/5体积的3M醋酸铵,2倍体积无水乙醇,轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，可见DNA形成丝状析出物。
(7).
8000rpm 离心5min，沉淀DNA，吸弃所有的上清液。
(8).向DNA沉淀中加入1ml的70%乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。8000rpm
离心5min，沉淀DNA。吸弃所有的上清液。
(9).敞开管口，室温下使乙醇尽可能挥发干净。
(10).溶于0.5mlTE溶液中,测定OD260及OD280, A260/A280应在1.8~2.0。
(11).
0.9%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA,DNA带应集中均匀，不含RNA。
附：牛肉膏蛋白胨液体培养基的配制方法：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g溶于1000ml纯净水中, pH7.0。
３．
PCR
扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因
PCR反应所用试剂，Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，dNTPs和无菌纯水均来自Invitrogen公司，PCR引物p1、p2由英潍捷基[Invitrogen]（上海）贸易有限公司合成。
以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，利用p1、p2引物PCR扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因（argBsub）。PCR反应在50µl反应体系中进行，参照pBAD/TOPO® ThioFusion Expression Kit 使用说明书的方法进行PCR，TOPO克隆，细胞转化和转化菌株筛选。
(1).制备50µl反应体系。
模板DNA，2μl(50ng)； 10 X PCR Buf， 5μl； 50mMdNTPs， 0.5μl ；
引物p1和p2，各1μl（100ng）； Taq DNA
polymerase (1单位/μl)，1μl；
加无菌纯水至体积50ul。
(2).PCR反应的程序为:94℃预变性4min,94℃变性1min,56℃退火30sec,72℃延伸1.5min；共30个循环,最后72℃延伸10min。反应完毕后，置于冰中待用。
(3).取PCR扩增产物2μl上样1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测为0.9KB大小的DNA片段（已知精氨酸酶基因是888个碱基对的DNA片段）,得到的DNA带轮廓清楚，适用于直接进行TOPO-TA克隆反应。
４．
TOPO
克隆连接反应（重组质粒的构建）
为了获得精氨酸酶基因表达的产物的活性和质量最大化，表达产生的酶蛋白需要有正确的折叠和最大的可溶性，我们认为N-末端融合有HP-硫氧还蛋白引导肽，较有利于维持细菌细胞内部的氧化还原环境，有利于表达蛋白质的正确折叠和增大其可溶性，有利于增加目标蛋白质的表达量。另外，TA克隆技术具有操作简单、快速、重组效率高等优点。因此，我们选用TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO构建重组质粒pBAD/Thio-TOPO-argBsub。所用pBAD/Thio-TOPO载体、盐溶液和无菌水均来自Invitrogen公司。
（1）.准备TOPO克隆反应体系：
新鲜的PCR反应产物1µl，盐溶液1µl，pBAD/Thio-TOPO载体1µl，无菌纯水3µl，总体积6µl。在小试管中震动混匀，短暂离心，集中反应液至试管底部。
（2）.连接反应：
把反应试管置室温（25℃）水浴进行TA连接反应15分钟。反应完成后，把反应试管置于冰中待用。
．转化大肠杆菌
TOP10
感受态细胞
转化用受体大肠杆菌TOP10感受态细胞,系Invitrogen 公司提供的化学诱导的感受态菌株,商品名为“one shot® TOP10 Chemically Competent E.coli。
（1).取TOPO克隆连接反应液2µl，加进一小瓶的（50µl）大肠杆菌TOP10感受态细胞中，振摇混匀，瞬间离心集中细菌至小瓶底部。
（2).放到冰中，保持10分钟。
（3).42℃热休克细胞30秒钟，无需振摇,立刻转移置放在冰中。
(4).向转化细胞中加入250µl室温（25℃）的LB培养基，拧紧瓶盖，在37℃摇床上（225rpm）振摇1小时。
(5).取50µl和200µl两个体积的转化液铺含有100µg/mlAmp的LB培养基平板两个。
(6).37℃培养箱培养平板，得到Amp抗性菌落，从中筛选出酶活性最高的转化菌株，即是大肠杆菌TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株。
．
6
．
阳性克隆的鉴定和筛选
分别挑取20个Amp抗性的转化菌单菌落，接入含有100µg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养6小时，按0.01%的终浓度向培养物添加阿拉伯糖后继续培养6小时，离心得到湿菌体，把0.1g湿菌体加入5ml pH9.0的5%精氨酸底物中，添加锰离子使终浓度成为10µmol/L，37℃温育60分钟，薄层层析检查鸟氨酸的生成量，从中筛选出精氨酸酶产量最高的转化菌，即是所构建的大肠杆菌基因工程菌株（E.coli
TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub）。
其中薄层层析所用的展层剂配比为：
正丁醇：丙酮：浓氨水：水=10：10：5：2
2
．
7
．插入
DNA
片段的序列分析
(1).把菌株E.coli TOPO10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub接入含有100µg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养8—10小时，提取质粒，得到pBAD/Thio-TOPO- argBsub重组质粒DNA。
(2).将提取的pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重组质粒DNA送英潍捷基[Invitrogen]（上海）贸易有限公司进行DNA序列分析。
(3).依据pBAD/ TOPO –ThioFusion
表达试剂盒产品说明书提供的质粒DNA序列分析引物结合位点的序列信息，由英潍捷基[Invitrogen]（上海）贸易有限公司,合成pBAD-正向引物pf，其序列是5’- ATGCCATAGCATTTTTATCC，合成pBAD-反向引物pr，其序列是5’-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC。
(4).利用正向引物pf，5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC和pBAD/Thio-TOPO-
argBsub重组质粒DNA为模板进行序列分析，解读出一段至载体DNA的第245位核苷酸起，至下游1073个核苷酸的DNA序列。
(5).利用反向引物pr，5’-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC和pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA为模板进行序列分析，解读出一段自载体DNA的第834位核苷酸起，向上游延伸长1108个核苷酸的DNA序列。
(6).通过拼接后，得到一段DNA片段的序列信息，共计1484个碱基对（见序列表<223>DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列 <400> 3），内含TA克隆的插入序列长894个核苷酸（见序列表<223>插入的精氨酸酶基因核苷酸序列表 <400> 6），从第4位A起，至891位的G，计888个核苷酸，其核苷酸序列和枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶基因编码序列完全相同（编码296个氨基酸）。设计PCR引物时在该酶的N-末端增加一个三联体密码GAA,把天然的终止密码TAA修改为ACC，故插入序列为894(888+6)个碱基对（编码298个氨基酸）。
序列分析的结果
（1).融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的完整编码序列是由1350个核苷酸组成的。自起始密码ATG开始，是为 N-末端有着123个氨基酸残基的HP-硫氧还蛋白引导肽编码的核苷酸序列，接着而来的是为298个氨基酸残基编码的插入DNA序列,内含组成枯草芽孢杆菌精氨酸酶的296个氨基酸残基的核苷酸编码序列，再至为C-末端的V5-抗原决定部位和多组氨酸标签的28个氨基酸残基编码核苷酸，共有1347个核苷酸，给449个氨基酸残基编码，加上一个终止密码，该阅读框共有1350个核苷酸，其完整的DNA序列见序列表<223〉融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列 <400> 4。
（2).由核苷酸序列推导的融合酶蛋白有449个氨基酸残基组成，自N-末端向C-末端方向排列，见序列表<223〉融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列
<400> 6。由核苷酸序列推导的插入DNA片段编码肽链的298个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列，见序列表<223〉插入DNA序列编码的氨基酸残基序列 <400> 7。除去首尾两个氨基酸残基以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。和GenBank公布的枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶的氨基酸残基序列完全一致，见序列表<223〉枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列 <400> 8。
酶法转化
L-
精氨酸生成
L-
鸟氨酸
本发明所述的菌株能够高效转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸，工艺过程如下：
50升发酵罐培养，阿拉伯糖诱导条件下，每升培养物可以得到30克湿菌体，900克湿菌体在100L反应液中20小时可以催化15公斤精氨酸定量转化为鸟氨酸，转化率可达到98%。。
工程菌发酵和酶法转化精氨酸的过程：
操作方法：
(1)、将低温保存的大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株在含有100µg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；
(2). 将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100µg/ml的Amp的3.5ml LB培养基的试管中， 37℃、225r/min，振荡培养过夜（12~16小时），得到一级种液。
(3). 取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2%的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min,振荡培养8小时（OD=3）得到二级种液。；
(4).取培养好的二级种液1.2L接种到30L
4%的玉米浆培养基中,发酵温度控制在37℃，培养过程中补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20%，当细菌生长至OD600=6.0（12小时，），降温至30℃，并加入3g L-Ara进行诱导，诱导8小时停止发酵培养，收集湿菌体；
(5). 将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体；
(6). 按菌：精氨酸=0.6:10的比例，向100升pH9.0的15%的精氨酸底物溶液中加入湿菌体900克，把溶液中Mn2+浓度调整为10μmol/L,温度38℃酶解转化。转化18小时后，点薄板检测精氨酸酶解情况，精氨酸转化率≥98%时，进入下一工序；
其中薄层层析所用的展层剂配比为：
正丁醇：丙酮：浓氨水：水=10：10：5：2。
(7). 用6M盐酸将酶解液pH调到5.0左右，60℃，保温30min;按底物量的15%加入活性炭，60℃，脱色30min后，过滤至清亮；
(8). 滤液在0.08Mpa以上的真空下浓缩至底物量的2.5~3倍体积；
(9）再按底物量的8%加活性炭，60℃，脱色30min后，过滤至清亮；
(10)继续减压浓缩至底物量的1.5倍的体积,加入一倍体积的95%的乙醇，冷却后，第一批L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出。用第一次结晶产物湿重的一半数量体积的85%的乙醇洗涤结晶产物两次并甩干，烘干得产品,洗涤液和母液合并用于进一步回收L-鸟氨酸盐酸盐产品。
(11)向合并有洗涤液的母液中，加入一定量的活性炭60℃脱色45分钟，将母液真空浓缩至起始体积的1/5左右，用6M左右的盐酸调节pH至5.0，加等量的95%乙醇，搅拌均匀，置0℃盐水中降温8小时，第二批L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机分离晶体，用少量85%的酒精洗涤直到结晶湿重等量后用离心机甩干，得到第二批结晶，烘干，合并两次产品，得到所要的L-鸟氨酸盐酸盐产品。
、薄层层析法测定精氨酸的转化率：
薄层层析法分离鉴定氨基酸具有设备简单、操作方便、测定快速、斑点集中及显色灵敏度高等特点。薄层层析能够检测出0.2~0.5微克量的氨基酸。可以满足测定精氨酸的转化率的需要。
(1)、20x10展层薄板的铺制方法：
A、配置0.6%的羧甲基纤维素钠水溶液。
称取羧甲基纤维素钠4.5g(含水34%)，（用剪刀剪成细小粉末便于溶解）溶于500ml蒸馏水中，电炉上加热使羧甲基纤维素钠完全溶解后，抽滤得澄清滤液。
B、按硅胶粉的质量：羧甲基纤维素钠水溶液重量=1：2.5的比例，即100ml羧甲基纤维素钠水溶液中加入硅胶粉40g，在碾钵中搅拌研磨成均匀的糊状物。
C、将糊状的硅胶粉混合液倒在洗净的20x10玻璃板上，用铺板器铺成厚薄均匀后薄板，放置于干净平整的桌面上自然凉干。
(2)、层展精氨酸样品的制备
A、取酶解20小时的精氨酸转化液1ml加入到2ml的纯水中，使精氨酸的浓度为50µg/µl。
B、精氨酸标准液的配置：称取0.1g精氨酸溶于90ml纯水中，调pH9.0（pH8—9.5均行）后定容至100ml,精氨酸浓度为1µg/µl。
(3)、薄板层析
分别取1µg/µl的精氨酸标准液和50µg/µl的精氨酸转化液各1µl点在层析薄板上，待斑点吹干后，将薄板放入层析缸中展层，层析所用的展层剂配比为：正丁醇：丙酮：浓氨水：水=10：10：5：2
30℃-40℃展层3-4小时后，取出薄板进行茚三酮显色。若转化液中残余精氨酸的颜色跟标准精氨酸的颜色一样或者更浅，则说明溶液中精氨酸转化≥98%，可以进入下一工序。
、培养基配制方法
平板培养基配制方法如下：
(1)、LB培养基的配制 ：
称取10g蛋白胨、5g酵母粉与10gNaCL溶于950ml的水中，调pH至7.0后，加水定容到1000ml，分装成100ml份三角瓶；
（2）、100μg/mlAmp平板的配制 ：
称取1.5g琼脂粉溶于含100mlLB的三角瓶中,盖上瓶塞，121℃灭菌20min。待温度降至45℃以下时，加入5%的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装18~20ml到已灭好菌的玻璃平板中，待溶液凝固后，置于4℃的冰箱中保存备用。
（3）、含有100μg/ml的Amp试管培养用LB培养基配制方法如下：
含有100μg/ml的Amp的试管培养用LB培养基的配制 ：
取三角瓶装的100mlLB培养基一瓶，盖上瓶塞，121℃灭菌20min。待温度降至40℃以下时，加入5%的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装到已灭好菌的玻璃试管3.5ml份备用。
摇瓶培养用2%玉米浆培养基配制方法如下：
（4）、2%玉米浆培养基的配制；
玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，加水定容到1000ml，PH7.0；分装成100ml份三角瓶，盖上瓶盖，121℃灭菌20min，备用。
发酵培养用4%玉米浆培养基配制方法如下：
（5）、4%玉米浆培养基的配制：
称取玉米粉1200g、味精750g，磷酸氢二钾30g，硫酸镁30g、加水至30升搅拌溶解，0.1MPa蒸汽灭菌25min,降温至38℃，用于接种培养；
（6）、甘油的准备：
取甘油600ml，121℃灭菌20min，用于发酵过程中补加。
鸟氨酸盐酸盐的鉴别和检测
鉴别：比较产品红外吸收图谱和标准红外吸收图谱。
按照日本味之素公司氨基酸标准第七版提供的分析方法和质量标准进行分析。
本发明的优点是：
1. 目前进行L-精氨酸转化生成L-鸟氨酸的酶多是来自高等动物肝脏的1型精氨酸酶，克隆表达动物肝脏来源的1型精氨酸酶时，需要由其mRNA反转录成cDNA，再行PCR扩增出精氨酸酶的基因才能和载体重组，手续繁杂，难于掌握。而PCR细菌基因则简单方便得多，利用大肠杆菌基因工程菌表达枯草杆菌精氨酸酶，具有安全高效，手续简便的特点，
2. 所表达的融合蛋白不但保持了硫氧还蛋白融合蛋白可溶性高效表达的特性，而且表达得精氨酸酶融合蛋白得到正确的折叠，在融合蛋白的形态下，表现出很高的酶活性，可以满足工业化规模生产的要求。
3.发酵培养得到菌体不需要破壁处理即可以直接用于催化L-精氨酸转化生产L-鸟氨酸，工程菌菌体产量和酶活性均已达到工业化生产水平要求。工程菌菌体中酶蛋白比重可以达到细菌总蛋白的30%以上，酶活保持好，反应20个小时后酶活力可保持95%。
４．用微生物产生的精氨酸酶代替动物来源的酶，不仅开辟了新酶源，而且能够减少动物传染疾病的机会，有利于产品出口。
附图说明
图1：枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因PCR—TA克隆方案示意图
序列表说明
序列1 引物 P1的核苷酸序列
26个核苷酸
序列2 引物 P2的核苷酸序列
23个核苷酸
序列3 DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列
1484个核苷酸
序列4 融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列 1350个核苷酸
序列5 插入的精氨酸酶基因的核苷酸序列
894个核苷酸
序列6 融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列
449个氨基酸残基
序列7 插入DNA序列编码的氨基酸残基序列
298个氨基酸残基
序列8 枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列
296个氨基酸残基
关于：序列3、4、5的关系的说明
| 序列 | 核苷酸个数 | 位点 |
| DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列 | 1484 | 1-1484 |
| 融合蛋白编码核苷酸序列之前的部分 | 101 | 1-101 |
| 融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列 | 1350 | 102-1451 |
| 融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列之中的插入序列 | 894 | 471-1364 |
| 融合蛋白编码核苷酸序列之后的部分 | 33 | 1452-1484 |
在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列之前的部分，开始于第1个核苷酸，结束于第101个核苷酸
在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列，开始于第102个核苷酸，结束于第1451个核苷酸
在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列的插入序列，
插入序列的开始位点,位于第471个核苷酸，
*下游是插入序列，精氨酸酶的起始密码是ATG。
“…..CTC GCC CTT *
GAA ATG GAT……”
“T * G” 分别是第470-471个核苷酸
插入序列的结束位点,位于第1364个核苷酸
*上游是插入序列，
“….. CTG CTG ACC *
AAG GGC GAG……”
“C * A” 分别是第1364-1365个核苷酸
在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列之后的部分，开始于第1452个核苷酸，结束于第1484个核苷酸
插入的精氨酸酶基因的核苷酸序列的说明
内含TA克隆的插入序列长894个核苷酸，从第4位A起，至891位的G，计888个核苷酸，其核苷酸序列和枯草杆菌168的精氨酸酶基因编码序列完全相同（编码296个氨基酸）。设计PCR引物时在该酶的N-末端增加一个三联体密码GAA,把天然的终止密码TAA修改为ACC，故插入序列为894(888+6)个碱基对（编码298个氨基酸）
具体实施方式
实施例
1
设计合成一对TA克隆引物
登录GenBanK，通过Gene
ID: 937760获取枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ）168菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列，利用Primerer 5.0 软件设计一对PCR引物，p1、p2，用于扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因DNA序列，和pBAD/Thio-TOPO载体进行TA连接。英潍捷基（上海）贸易有限公司合成引物。
P1:5′-GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3′,共26 bp。
P2:5′-GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3′,共23 bp。
实施例
2
提取和测定枯草芽孢杆菌基因组DNA
采用改进的Palva I等人的方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA。
(1).挑取枯草芽孢杆菌(保藏编号CCTCC N0.93009)菌株平板培养的单个菌落，接种到装有10ml牛肉膏，蛋白胨液体培养基的试管中，32℃振荡培养14小时。
(2).5000rpm离心10min,得到菌体沉淀，STE洗涤1次,再次离心,菌体重悬于4mlTE溶液中。
（3）.加入50mg/ml溶菌酶溶液8μl(终浓度为100μg/ml),37℃保温20min。再加入RNase(10mg/ml)10μl,至终浓度25μg/ml,然后加入10%SDS溶0.5ml,37℃保温30min。加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl,终浓度为50μg/ml,37℃保60min。
(4).再加入等体积的酚,混匀,8000rpm离心5min,取上清于另一个离心管中。
(5).上清液中加入等体积的酚:氯仿（1：1体积）混合物,混匀,8000rpm离心5min,取上清置于另一个离心管中。
(6).加入1/5体积的3M醋酸铵,2倍体积无水乙醇,轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，DNA形成丝状析出物。
(7).
8000rpm 离心5min，沉淀DNA，吸弃所有的上清液。
(8).向DNA沉淀中加入1ml的70%乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。8000rpm
离心5min，沉淀DNA。吸弃所有的上清液。
(9).敞开管口，室温下使乙醇尽可能挥发干净。
(10).加入 0.5mlTE溶液溶解DNA,测定OD260及OD280,
A260/A280=1.85。
(11).
0.9%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA,DNA带集中均匀，不含RNA。
实施例
3
PCR扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因
1).制备50µl反应体系。
模板DNA，2μl(50ng)； 10 X PCR Buf， 5μl； 50mMdNTPs，
0.5μl；
引物p1和p2，各1μl（100ng）； Taq DNA
polymerase (1单位/μl)， 1μl；加无菌纯水至体积50μl。
PCR反应的程序为:94℃预变性4min,94℃变性1min,56℃退火30sec,72℃延伸1.5min;共30个循环,最后72℃延伸10min。反应完毕后，暂存于冰中待用。
2).取扩增产物2μl上样1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测到0.9KB大小的DNA片段, DNA带轮廓清楚，适用于直接进行TOPO-TA克隆反应。
实施例
4
重组质粒的构建和转化宿主菌
（1）.准备TOPO克隆反应体系：
新鲜的PCR反应产物1µl，盐溶液1µl，pBAD/Thio-TOPO载体1µl，无菌纯水3µl，总体积6µl。震动混匀，短暂离心，集中反应液至小试管底部。
（2）.连接反应：
把反应管置室温（25℃）水浴进行TA连接反应15分钟。反应完成后，把反应试管置于冰中待用。
（3).取TOPO克隆连接反应液2µl，仔细加进一小瓶的（50µl）大肠杆菌TOP10感受态细胞中，振摇混匀，瞬间离心集中细菌至小瓶底部。
（4).放置冰中，保持10分钟。
（5).42℃热休克细胞30秒钟，无需振摇，立刻转移置放在冰中。
（5).向转化细胞中加入250µl室温（25℃）的LB培养基，拧紧瓶盖，在37℃摇床上（225rpm）振摇1小时。
（6).取50µl和200µl两个体积的转化液铺平板(含有100µg/ml Amp的LB培养基平板)两个。
(7).平板置于37℃培养箱培养，得到Amp抗性菌落，挑选20个菌落分析精氨酸酶活性，从中选出酶活性最高的转化菌株，得到基因工程菌大肠杆菌E.coli
TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub菌株
实施例
5
阳性克隆的鉴定和挑选
分别挑取Amp抗性的转化菌菌落20个，接入含有100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养6小时，按0.01%的终浓度向培养物添加阿拉伯糖后继续培养6小时，离心得到湿菌体，把0.1g湿菌体加入5mlpH9.0的5%精氨酸底物中，添加锰离子使终浓度成为10μmol/L，37℃温育60分钟，薄板层析检查鸟氨酸的生成量，从中筛选出精氨酸酶活性最高的大肠杆菌基因工程菌株E.coli
TOP10/pBAD/Thio -TOPO-argBsub。
其中薄层层析所用的展层剂配比为：
正丁醇：丙酮：浓氨水：水=10：10：5：2
实施例
6
测定插入DNA片段的序列
(1).把菌株E.coli TOPO10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub接入含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养8—10小时，提取质粒，得到pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA。
(2).将提取的pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行序列分析。
(3).依据pBAD/ TOPO –ThioFusion
表达试剂盒产品说明书要求，由英潍捷基（上海）贸易有限公司,合成pBAD-正向引物pf和反向引物pr。
正向引物pf，5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC
反向引物pr，5’-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC
(4).通过序列分析得到一段共1484个碱基对的DNA序列信息,内含894个核苷酸的插入序列，插入序列的上游部分是载体的470个核苷酸，下游部分是载体的120个核苷酸。序列测定结果见序列表 <223> DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列<400> 3）。
（5）.融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的完整编码序列（阅读框）计有1350个核苷酸， ATG密码起于载体质粒346位核苷酸，止于714位核苷酸，计369个核苷酸，组成123个三联体密码，编码N-末端连接的HP-硫氧还蛋白引导肽的123个氨基酸残基。插入序列计有894个核苷酸，编码肽链的298个氨基酸残基序列，除去首尾两个氨基酸残基以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。插入序列另一端连接载体的第715位核苷酸，延伸至载体的第801位核苷酸，计有87个核苷酸为融合蛋白羧末端的V5-抗原决定部位和多组氨酸标签（28个氨基酸残基）编码，加上TGA终止密码子，整个阅读框共有1350个核苷酸，组成450个三联体密码子，编码449个氨基酸残基。完整的阅读框序列见序列表<223> 融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列 <400> 4）。
（6）.由阅读框核苷酸序列推导的融合酶蛋白的449个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列。（见序列表<223> 融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列<400> 6）。
（7）. 由核苷酸序列推导的插入DNA片段编码肽链的298个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列（见序列表<223> 插入DNA序列编码的氨基酸残基序列<400> 7）。除去首尾两个氨基酸以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。和GenBank公布的枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶的氨基酸残基的序列完全一致（见序列表<223>
枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列<400> 8）。
实施例
7
工程菌发酵-转化精氨酸的过程
1、将低温保存的大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株在含有100µg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；
2. 将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100µg/ml的Amp的3.5ml LB培养基的试管中， 37℃、225r/min，振荡培养过夜（12~16小时），得到一级种液。
3. 取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2%的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min,振荡培养8小时（OD600=3）得到二级种液。；
4.取培养好的二级种液1.2L接种到30L
4%的玉米浆培养基中,发酵温度控制在37℃，培养6小时后补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20%，继续培养6h,当细菌生长至OD600=6（约12小时），降温至30℃，并加入3g L-Ara进行诱导，在诱导5h后，每隔1h取样检测菌体酶活变化，诱导8h后出料。将发酵好的菌液33L,在4℃,5000r/min,离心10min,共收集湿菌体965g,菌体收率29.2g/L。
5、酶促转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸，分离和回收L-鸟氨酸盐酸盐。
在200升的搪瓷反应釜中加纯化水100升，在搅拌下，投进L-精氨酸15kg,用6M左右的盐酸调节pH至9.0左右，加锰离子使溶液中Mn2+终浓度为10μmol/L,夹套水浴升温，温度达到并维持在38℃，待温度稳定后，加入900g工程菌，继续搅拌酶解，当酶解到19小时时，取样检测残余精氨酸，（薄板层析），溶液中的残余精氨酸≤2%时，用6M左右的盐酸将酶解液pH调到5.0，60℃，保温搅拌30min；加入2.25kg活性炭，60℃，脱色30min后，板框过滤；
滤液在0.08Mpa以上的真空下浓缩，出料体积42升；加入1.2kg活性炭再次脱色，溶液进行抽滤，滤液在0.08Mpa以上的真空下再次浓缩，出料体积22L，
加入1倍体积的95%的食用乙醇，搅拌均匀，0℃盐水中降温结晶8小时，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机分离晶体，用8升左右的85%的乙醇洗涤两次并甩干产品，湿重14.34公斤，60度烘干后称重11.025公斤。母液52升含洗涤液，盐酸调节pH4.5，加入0.5公斤活性炭60℃脱色，将滤液真空浓缩至7.8升，调节pH至4.5左右，加95%的乙醇7.5升，搅拌均匀，置0℃盐水中降温8小时，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机甩干，用2升85%的乙醇洗涤，湿品重2.07公斤，干重1.75公斤；合并两次的产品，产品总收率为底物重量的85.0%，质量符合AJI92版（第七版）。
实施例8：
工程菌发酵-转化精氨酸的过程
1、将低温保存的大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株在含有100µg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；
2. 将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100µg/ml的Amp的3.5mlLB培养基的试管中， 37℃、225r/min，振荡培养过夜（12~16小时），得到一级种液。
3. 取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2%的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min,振荡培养8小时（OD600=3）得到二级种液。；
4.取培养好的二级种液1.2L接种到30L
4%的玉米浆培养基中,发酵温度控制在37℃，培养6小时后补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20%，继续培养6h,当细菌生长至OD600=6（约12小时），降温至30℃，并加入3g L-Ara进行诱导，在诱导5h后，每隔1h取样检测菌体酶活变化，诱导8h后出料。
将发酵好的菌液31L,在4℃,5000r/min,离心10min,共收集湿菌体980g,菌体收率31.6g/L。
5、酶促转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸，分离和回收L-鸟氨酸盐酸盐。
在200升的搪瓷反应釜中加纯化水100升，在搅拌下，投进L-精氨酸15kg,用6M左右的盐酸调节pH至9.0左右，加锰离子使溶液中Mn2+终浓度为10μmol/L,夹套水浴升温，温度达到并维持在38℃，待温度稳定后，加入900g工程菌，继续搅拌酶解，当酶解到19小时时，取样检测残余精氨酸，（薄板层析），溶液中的残余精氨酸≤2%时，用6M左右的盐酸将酶解液pH调到5.0，60℃，保温搅拌30min；加入2.25kg活性炭，60℃，脱色30min后，板框过滤；
滤液在0.08Mpa以上的真空下浓缩，出料体积41升；加入1.2kg活性炭再次脱色，溶液进行抽滤，滤液在0.08Mpa以上的真空下再次浓缩，出料体积23L，
加入1倍体积的95%的食用乙醇，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，0℃盐水中降温结晶8个小时，离心机甩干，用8升的85%的乙醇洗涤两次并甩干产品，湿重15.39公斤，60度烘干后称重11.325公斤，母液54升含洗涤液，盐酸调节pH4.5，加入0.5公斤活性炭60℃脱色，将滤液真空浓缩至8.8升，调节pH至4.5左右，加95%的乙醇8.5升，搅拌均匀，置0℃盐水中降温8小时，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机甩干，用2.4升85%的乙醇洗涤，湿品重2.365公斤，干重1.875公斤；合并两次的产品，产品总收率为底物重量的88.0%，质量符合AJI92版（第七版）。
实施例9：
工程菌发酵-转化精氨酸的过程
1、将低温保存的大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株在含有100µg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；
2. 将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100µg/ml的Amp的3.5mlLB培养基的试管中， 37℃、225r/min，振荡培养过夜（12~16小时），得到一级种液。
3. 取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2%的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min,振荡培养8小时（OD600=3）得到二级种液。；
4.取培养好的二级种液1.2L接种到30L
4%的玉米浆培养基中,发酵温度控制在37℃，培养6小时后补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20%，继续培养6h,当细菌生长至OD600=6（约12小时），降温至30℃，并加入3g L-Ara进行诱导，在诱导5h后，每隔1h取样检测菌体酶活变化，诱导8h后出料。
将发酵好的菌液35L,在4℃,5000r/min,离心10min,共收集湿菌体1.085Kg,菌体收率31g/L。
5、酶促转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸，分离和回收L-鸟氨酸盐酸盐。
在200升的搪瓷反应釜中加纯化水100升，在搅拌下，投进L-精氨酸15kg,用6M左右的盐酸调节pH至9.0左右，加锰离子使溶液中Mn2+终浓度为10μmol/L,夹套水浴升温，温度达到并维持在38℃，待温度稳定后，加入900g工程菌，继续搅拌酶解，当酶解到19小时时，取样检测残余精氨酸，（薄板层析），溶液中的残余精氨酸≤2%时，用6M左右的盐酸将酶解液pH调到5.0，60℃，保温搅拌30min；加入2.5kg活性炭，60℃，脱色30min后，板框过滤；
滤液在0.08Mpa以上的真空下浓缩，出料体积41.5升；加入1.2kg活性炭再次脱色，溶液进行抽滤，滤液在0.08Mpa以上的真空下再次浓缩，出料体积22.5L，
加入1倍体积的95%的食用乙醇，搅拌均匀， 0℃盐水中降温结晶8个小时，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机分离晶体，用8升的85%的乙醇洗涤两次并甩干产品，湿重15.84公斤，60度烘干后称重11.64公斤，母液55升含洗涤液，盐酸调节pH4.5，加入0.5公斤活性炭60℃脱色，将滤液真空浓缩至7.9升，调节pH至4.5左右，加95%的乙醇8升，搅拌均匀，置0℃盐水中降温8小时，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机分离出晶体，用1.8升85%的乙醇洗涤，湿品重1.77公斤，干重1.41公斤；合并两次的产品，产品总收率为底物重量的87.0%，质量符合AJI92版（第七版）。
实施例
10 L-
鸟氨酸盐酸盐的鉴别和检测
鉴别：比较产品红外吸收图谱和标准红外吸收图谱。
按照日本味之素公司氨基酸标准第七版提供的分析方法和质量标准进行分析。产品质量完全符合该版本要求。分析结果如下。
武汉远大弘元股份有限公司
WUHAN GRAND HOYO
CO LTD WUBC
质
检
单
C E R T I F I
C A T E O
F A N A L Y S
I S
结论Conclusion :Agree with the specification
of AJI92。
序列表
Claims (4)
1.一种利用大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO- Arg-Bsub基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法,
该大肠杆菌基因工程菌保藏编号CCTCC No. M2010358；
生产方法包括如下步骤：
(1)将低温保存的大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO-
Arg-Bsub基因工程菌株在含有100µg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；
(2) 将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100µg/ml的Amp的3.5ml LB培养基的试管中， 37℃、225r/min，振荡培养过夜，得到一级种液；
(3) 取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2%的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min,振荡培养8小时,得到二级种液；
所述2%玉米浆培养基配制方法如下：
玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，加水定容到1000ml，pH7.0；分装成100ml/份至三角瓶，盖上瓶盖，121℃灭菌20min，备用；
(4)取培养好的二级种液1.2L接种到30L 4%的玉米浆培养基中,发酵温度控制在37℃，培养过程中补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20%，当细菌生长至OD600=6.0,降温至30℃，并加入3g L-Ara进行诱导，在诱导5h后，每隔1h取样检测菌体酶活变化，诱导8h后出料；
(5) 将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集湿菌体；
(6) 在200升的搪瓷反应釜中加纯化水100升，在搅拌下，投进L-精氨酸15kg,用6M的盐酸调节pH至9.0，加锰离子使溶液中Mn2+终浓度为10μmol/L,夹套水浴升温，温度达到并维持在38℃，待温度稳定后，加入900g工程菌，继续搅拌酶解，当酶解19小时时，取样利用薄层层析检测残余精氨酸，溶液中的残余精氨酸≤2%时进入下一工序；
其中薄层层析所用的展层剂配比为：
正丁醇：丙酮：浓氨水：水=10：10：5：2；
(7) 用6M盐酸将酶解液pH调到5.0，60℃，保温搅拌30min; 加入2.25kg活性炭，60℃，脱色30min后，板框过滤；
(8) 滤液在0.08MPa以上的真空下浓缩，出料；
(9)加入1.2kg活性炭再次脱色，溶液进行抽滤，滤液在0.08MPa以上的真空下再次浓缩，出料；
(10) 加入1倍体积的95%的食用乙醇，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，0℃盐水中降温结晶8个小时，离心机甩干，用8升的85%的乙醇洗涤两次并甩干产品；母液和洗涤液合并，用盐酸调节pH4.5，加入0.5公斤活性炭60℃脱色，将滤液真空浓缩至8.8升，调节pH至4.5，加95%的乙醇8.5升，搅拌均匀，置0℃盐水中降温8小时，L-鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机甩干；合并两次的产品用于进一步回收L-鸟氨酸盐酸盐产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中含有100μg/mlAmp的平板配制方法包括如下步骤：
(1) 配制LB培养基：
称取10g蛋白胨、5g酵母粉与10gNaCl溶于950ml的水中，调pH至7.0后，加水定容到1000ml，分装成100ml/份至三角瓶；
(2) 配制100μg/mlAmp平板：
称取1.5g琼脂粉溶于含100mlLB的三角瓶中,盖上瓶塞，121℃灭菌20min；待温度降至45℃以下时，加入5%的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装到已灭好菌的玻璃平板中，待溶液凝固后，置于4℃的冰箱中保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的含有100μg/ml的Amp的LB培养基的配制方法如下：
取三角瓶装的100mlLB培养基一瓶，盖上瓶塞，121℃灭菌20min；待温度降至40℃以下时，加入5%的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装到已灭好菌的玻璃试管3.5ml/份备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中4%的玉米浆培养基的配制方法如下：
称取玉米粉1200g、味精750g、磷酸氢二钾30g、硫酸镁30g、加水至30升搅拌溶解，0.1MPa蒸汽灭菌25min,降温至38℃，用于接种培养。
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