CN103215198A - 利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法属于基因工程和酶工程领域。本发明应用基因工程方法，将钝齿棒杆菌SYPA5-5基因argB敲除，获得能够积累谷氨酸的安全菌株钝齿棒杆菌E01；从L.Plantarum GB01-21克隆谷氨酸脱羧酶基因于钝齿棒杆菌E01中表达，获得以葡萄萄糖为底物直接合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌C.crenatum E01/pGAD。重组菌发酵液γ-氨基丁酸积累量达13.98g/L。此发明成功整合谷氨酸和γ-氨基丁酸代谢途径，实现葡萄糖到γ-氨基丁酸一步法生产，简化制备途径，降低成本，提高安全性，为氨基酸的高效低成本制备提供崭新的思路。
Description
技术领域
利用基因工程技术，构建安全高效的钝齿棒杆菌工程菌。该菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法，属于基因工程和酶工程领域，具体涉及基因工程重组钝齿棒杆菌生产γ-氨基丁酸的方法。
技术背景
γ-氨基丁酸是天然存在于某些生物体内的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等重要生理功能。在食品、饲料、医药等领域具有广泛的应用。2009年，卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品，这意味着γ-氨基丁酸在国内市场跨入了一个崭新时代。
目前，γ-氨基丁酸的制备主要通过化学合成法和微生物法，化学合成法反应条件剧烈，污染严重；微生物发酵法条件温和、安全、成本较低。在微生物发酵法中，最受关注的是通过谷氨酸脱羧酶(EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧来生产γ-氨基丁酸。在已报道的方法中，γ-氨基丁酸生产均需要添加外源谷氨酸作为底物，而谷氨酸是由糖质为原料经微生物发酵，采用等电点提取，离子交换树脂分离等方法制备获得。因而添加外源谷氨酸在一定程度上增加了γ-氨基丁酸的制备成本。
本实验室筛选得到的一株高产精氨酸突变菌株钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatumSYP，保藏编号CCTCC NO：M208133)，经传代5次后，获得菌株SYPA5-5，其生长特性等与母体菌SYP基本一致。将SYPA5-5中的argB基因敲除后，获得基因工程菌钝齿棒杆菌E01。该工程菌缺少γ-氨基丁酸合成途径，但能高效转化葡萄糖为谷氨酸。另外，本研究室前期经诱变筛选获得一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21(中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号：CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途径，但具有较高的谷氨酸脱羧酶活力，能高效催化γ-氨基丁酸的合成。
基于研究室前期研究基础，本发明首先将精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5精氨酸合成途径的关键酶基因argB敲除，获得一株能高效转化葡萄糖为谷氨酸的工程菌钝齿棒杆菌E01。由于钝齿棒杆菌缺少GABA合成途径，本发明将植物乳杆菌GB01-21的谷氨酸脱羧酶基因克隆，于钝齿棒杆菌E01中进行表达，获得了一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸合成γ-氨基丁酸的高效重组钝齿棒杆菌。实现了无需添加外源的谷氨酸，直接经葡萄糖一步法发酵合成γ-氨基丁酸，大大节约了γ-氨基丁酸的制备成本。
发明内容
本发明的目的在于：敲除钝齿棒杆菌SYPA5-5精氨酸合成途径关键酶基因argB，获得谷氨酸积累菌株钝齿棒杆菌E01，将植物乳杆菌GB01-21的γ-氨基丁酸合成关键酶基因——谷氨酸脱羧酶基因进行克隆，于谷氨酸生产菌株钝齿棒杆菌E01中异源表达，获得一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸高效合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌。该重组菌实现葡萄糖到γ-氨基丁酸的一步法生产。该发明为成功整合氨基酸代谢中优质酶的生物功能，简化γ-氨基丁酸的制备途径，降低其合成成本提供了一条崭新的思路。
本发明的技术方案：以基因工程为手段，构建了一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌。
(1)一株能以葡萄糖为底物，高效转化γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为C.crenatum E01/pGAD。
(2)所述重组菌的构建方法，利用携带抗生素抗性与条件致死型标记sacB双标记的新型整合型载体pK18mobsacB，通过两次同源重组敲除钝齿棒杆菌SYPA5-5精氨酸合成途径关键酶基因argB，获得工程菌钝齿棒杆菌E01，再将lpgad基因插入到载体pJC-tac，构建得重组质粒pGAD，电击转化钝齿棒杆菌E01，通过含有30μg/mL的卡那霉素抗性筛选，获得目的重组菌株C.crenatum E01/pGAD；
①钝齿棒杆菌SYPA5-5argB基因的敲除
根据GenBank中C.glutamicum ATCC13032 argB基因序列设计argB基因上下游以及中间引物，引物序列如下：
PargBF：5’-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAGATTT
PargBR：5’-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG
PΔargBR：5’-CCCATCCACTAAACTTAAACACGGTTTAGCATCTCA
PΔargBF：5’-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGACTTGATTCCGGCATGA
以钝齿棒杆菌SYPA5-5基因组为模板，分别以PargBF和PΔargBR、PΔargBF和PargBR为引物PCR，获得含21bp互补粘性末端的PCR产物，再以上述PCR产物为模板，以PargBF、PargBR为引物PCR，获得基因内部缺失约500bp的缺失型基因ΔargB。ΔargB克隆后与线性化pK18mobsacB整合型载体相连构建重组质粒pK18mobsacB-ΔargB。将验证正确的质粒pK18mobsacB-ΔargB电击转化钝齿棒杆菌SYPA5-5，经LBG+Km固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子。再分别将目标转化子在含蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子。对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因缺失型的鉴定。提取转化子染色体，以目标基因argB的上下游引物进行PCR鉴定。鉴定正确的转化子命名为钝齿棒杆菌E01。
②植物乳杆菌GB01-21谷氨酸脱羧酶基因lpgad的获取
根据NCBI中植物乳杆菌Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III(GI：308044682)全基因组核酸序列3254376bp中的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计正反向引物lpgad F SalI和lpgad R BamHI。以L.plantarum GB01-21染色体为模板，lpgad F、lpgad R为引物进行PCR扩增反应，获得lpgad基因，其全长1400bp。
lpgad F SalI：5′-CGCGTCGACATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3′
lpgad R BamHI：5′-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3′
PCR采用50μL体系：10×ExTaq Buffer5μL，dNTP4μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH2O补齐至总体积50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min，15℃10min。获得lpgad基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA。
③重组表达载体pGAD的构建
将纯化后的PCR产物与pMD18-T连接，反应体系如下：质粒pMD18-T0.5μL，目的基因4.5μL，Ligation Solution5μL，混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。转化大肠杆菌JM109，提取质粒pMD18-T-lpgad，酶切验证并测序。提取质粒pMD18-T-lpgad和表达载体pJC-tac，二者同时用Sal I/ BamH I双酶切，酶切产物通过粘性末端连接，获得重组质粒pGAD。
④重组钝齿棒杆菌的获得
重组质粒pGAD转化大肠杆菌JM109感受态细胞，使用30μg/mL卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，重组质粒经Sal I/BamH I双酶切验证，提取重组质粒pGAD。
采用电击转化法，将重组质粒pGAD转化钝齿棒杆菌E01，涂布含有30μg/mL卡那霉素的固体LBG平板于30℃培养36h，从平板上筛选阳性菌落，接种于含30μg/mL卡那霉素的液体LBG培养基中，30℃培养过夜，提取质粒，以lpgad F、lpgad R为引物对质粒进行PCR验证，以及用Sal I和BamH I进行酶切验证。获得重组菌C.crenatum E01/pGAD。
(3)重组菌C.crenatum E01/pGAD发酵产γ-氨基丁酸
挑取单菌落接种至液体种子培养基(加入卡那霉素)，30℃，220r/min往复式摇床培养12h。以10％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，30℃，220r/min往复式摇床培养，根据菌体生长情况适时用IPTG进行诱导，继续进行发酵。发酵过程中待谷氨酸合成量基本达到最高值时停止NH4 +的供给，继续发酵合成γ-氨基丁酸。实时检测发酵过程中谷氨酸、葡萄糖残留量以及菌体量等参数。
(5)底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测
发酵液中葡萄糖和谷氨酸的实时检测通过SBA-40B生物传感分析仪测定。γ-氨基丁酸通过氨基酸测定仪测定。利用氨基酸测定仪分别测定标准样品γ-氨基丁酸和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中γ-氨基丁酸进行定性与定量检测。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD562nm。
本发明的有益效果：本发明通过克隆L.plantarum GB01-21γ-氨基丁酸代谢途径中的谷氨酸脱羧酶基因，于谷氨酸生产菌株C. crenatum E01中成功进行表达，获得了一株能以廉价的葡萄糖为底物，利用内源性谷氨酸合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌，实现葡萄糖到γ-氨基丁酸的一步法生产，简化了制备步骤，大大降低了γ-氨基丁酸的生产成本。同时，钝齿棒杆菌为食品安全菌株，提高了安全性，打破了以往大肠杆菌生产γ-氨基丁酸的普遍模式。
附图说明
图1二次重组菌株argB基因缺失型和回复野生型的PCR鉴定
泳道说明M：DL2000Marker；1：回复突变型argB；2-5：基因缺失型ΔargB
图2谷氨酸脱羧酶在E.coli JM109中的表达
M泳道为蛋白质分子量标准Marker；
1号泳道为对照组E.coli JM109/pJC-tac的胞内蛋白表达；
2号泳道为对照组诱导前E.coli JM109/pJC-tac的胞内蛋白表达；
3号泳道为实验组诱导后E.coli JM109/pGAD的胞内蛋白表达；
图3重组质粒pGAD酶切验证
1泳道为DL2000Maker
2泳道为pGAD BamH I、Sal I双酶切
3泳道为pGAD BamHI单酶切
4泳道为λ-Hind III Maker
图4钝齿棒杆菌E01发酵产L-谷氨酸过程曲线
图5重组菌C.crenatum E01/pGAD发酵液氨基酸测定结果
具体实施方法
实施例1：钝齿棒杆菌argB基因的敲除验证
对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因缺失型的鉴定。提取转化子染色体，以目标基因argB的上下游引物进行PCR鉴定。PCR鉴定结果如图1所示。
实施例2：谷氨酸脱羧酶在E.coli JM109中的表达
重组质粒pGAD转入E.coli JM109，在卡那霉素抗性LB平板上挑取阳性转化子至液体LB，IPTG诱导后收集菌体经超声波破碎后，上清液SDS-PAGE，检测到一条分子量约53kDa的特异性条带(图2)，与报道的目标蛋白大小一致，而对照菌株E.coli JM109/pJC-tac以及未经诱导的E.coli JM109/pGAD均无此条带。说明重组质粒pGAD在大肠杆菌中正确表达，因此可将构建好的重组质粒pGAD转入钝齿棒杆菌检测能否有效表达谷氨酸脱羧酶。
实施例3：重组菌C.crenatum E01/pGAD的鉴定
重组质粒pGAD电击转化C.crenatum E01，待转化子长出后转接至含有卡那霉素的LBG液体培养基，取菌液提取质粒进行PCR验证以及酶切验证，PCR产物均显示一条1410bp大小的目的条带，经Sal I/BamH I酶切验证后结果如图3，说明重组菌C.crenatum E01/pGAD构建成功。
实施例4：重组菌C.crenatum E01/pGAD的谷氨酸脱羧酶活力测定
取冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的活化培养基中，30℃振荡培养过夜，次日转接活化培养基中，IPTG诱导表达，超声波破碎法制备粗酶液。粗酶液采用比色法进行酶活测定。首先配制底物溶液Macllvaine缓冲体系(0.2mol/L，pH4.8，含0.1mmol/LPLP，0.4mol/L底物L-谷氨酸钠)，取200μL底物溶液和100μL酶液在30℃反应一定时间，置于冰浴中，加入200μL0.2mol/L硼酸缓冲液(pH9.0)终止反应；再加入1.0mL6％苯酚和400μL次氯酸钠溶液，充分振荡后，沸水浴中反应10min，迅速在冰浴中冷却显色，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟产生1μmolγ-氨基丁酸所需的酶量。经测定，重组钝齿棒杆菌谷氨酸脱羧酶活力为0.81U/mL。
实施例5：钝齿棒杆菌E01发酵产L-谷氨酸
培养基：①种子培养基：葡萄糖30，玉米浆25，KH2PO4·3H2O1.5，MgSO4·7H2O0.4，尿素6(分消)，pH7.0-7.2，115℃灭菌15min；②发酵培养基(g/L)：葡萄糖140，玉米浆3，尿素(分消)，KH2PO4·3H2O1.5，MgSO4·7H2O08，MnSO4·H2O0.02，FeSO4·7H2O0.02，生物素8×10-5，L-组氨酸5×10-4，pH7.0-7.2，115℃灭菌15min。发酵过程中添加尿素提供NH4 +源。
将上述经酶活验证的重组菌钝齿棒杆菌C.crenatum E01进行摇瓶发酵实验，从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环钝齿棒杆菌(对照菌及重组菌)于种子培养基中(25mL/250mL)，30℃，220r/min往复式摇床培养12h，以10％接种量，定时添加NH4 +源，发酵96h，分时间区段测定谷氨酸及L-精氨酸产量，结果与对照菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5相比，重组菌不再合成精氨酸，而到36h时谷氨酸可显著积累到34g/L左右。谷氨酸合成曲线如图4所示。
实施例6：重组菌C.crenatum E01/pGAD发酵产γ-氨基丁酸
培养基：①活化培养基：LBG：蛋白胨1，酵母膏0.5，NaCl1，葡萄糖0.5，115℃灭菌15min；②种子培养基：葡萄糖30，玉米浆25，KH2PO4·3H2O1.5，MgSO4·7H2O0.4，尿素6(分消)，pH7.0-7.2，115℃灭菌15min；③发酵培养基(g/L)：葡萄糖140，玉米浆3，尿素5.5(分消)，KH2PO4·3H2O1.5，MgSO4·7H2O0.8，MnSO4·H2O0.02，FeSO4·7H2O0.02，生物素8×10-5，L-组氨酸5×10-4，pH7.0-7.2，115℃灭菌15min。发酵过程中添加尿素提供NH4 +源。
挑取C.glutamicum E01/pGAD单菌落接种至液体种子培养基(加入终浓度50μg/mL的卡那霉素)，30℃，220r/min往复式摇床培养12h。以10％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，30℃，220r/min，培养至8h时开始添加尿素作为NH4 +源来合成谷氨酸。培养12h时加入终浓度为1μmol/mL的IPTG进行诱导，30℃，220r/min往复式摇床继续培养。36h时停止NH4 +的供给，即终止谷氨酸的合成，继续发酵至72h来合成γ-氨基丁酸。实时检测发酵过程中谷氨酸、葡萄糖残留量以及菌体量等参数。结果显示，36h时谷氨酸浓度达到最高，约在40h谷氨酸浓度开始下降。发酵72h后谷氨酸浓度基本稳定，说明γ-氨基丁酸不再合成，此时停止发酵。经氨基酸测定仪检测γ-氨基丁酸含量，最终发酵液γ-氨基丁酸浓度为13.98g/L。氨基酸测定结果如图5所示，出峰时间为2.559min的物质为L-谷氨酸，对应的出峰时间10.085min的物质为γ-氨基丁酸。
Claims (11)
1.一株能以葡萄糖为底物，高效转化葡萄糖为谷氨酸的基因工程菌钝齿棒杆菌E01。
2.权利要求1中基因工程菌钝齿棒杆菌E01的构建思路，其特征是利用一株高产精氨酸突变菌株钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYP，保藏编号CCTCC NO：M208133)，经传代5次后，敲除argB基因，获得基因工程菌钝齿棒杆菌E01，该工程菌缺少γ-氨基丁酸合成途径，但能高效催化葡萄糖转化为谷氨酸。
3.一株能以葡萄糖为底物，高效转化γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为C.crenatum E01/pGAD。
4.权利要求书3中的重组菌C. crenatum E01/pGAD的构建思路，其特征是根据植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21(中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCM209102)谷氨酸合成途径，但具有较高的谷氨酸脱羧酶活力，能高效催化γ-氨基丁酸的合成，以及权利要求1中的钝齿棒杆菌E01缺少γ-氨基丁酸合成途径，但能高效催化葡萄糖转化为谷氨酸的特点，该重组菌成功重组了钝齿棒杆菌的谷氨酸代谢途径和植物乳杆菌的γ-氨基丁酸合成途径，获得能以葡萄糖为底物，生物转化γ-氨基丁酸的高效重组钝齿棒杆菌。
5.权利要求书3中的重组菌C.crenatum E01/pGAD的构建方法，其特征是将植物乳杆菌的lpgad基因插入到载体pJC-tac，构建得重组质粒pGAD，电击转化钝齿棒杆菌E01，通过含有30μg/mL的卡那霉素抗性筛选，获得目的重组菌株C.crenatum E01/pGAD。
6.权利要求书3中的重组质粒pGAD的构建，其特征是将纯化后的lpgad基因与pMD18-T连接，反应体系如下：质粒pMD18-T0.5μL，目的基因4.5μL，Ligation Solution5μL，混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接4h以上，转化大肠杆菌JM109，提取质粒pMD18-T-lpgad，酶切验证并测序，提取质粒pMD18-T-lpgad和表达载体pJC-tac，二者同时用Sal I/BamH I双酶切，酶切产物通过粘性末端连接，获得重组质粒pGAD。
7.权利要求5中的lpgad基因的获得，其特征是以保藏编号为CCTCCM209102的L.plantarum GB01-21为模板，设计正反向引物lpgad F Sal I和lpgad R BamH I(如下所示)，以L.plantarum GB01-21染色体为模板，lpgad F、lpgad R为引物进行PCR扩增反应，PCR采用50μL体系：10×ExTaq Buffer5μL，dNTP4μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH2O补齐至总体积50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min，15℃10min，获得lpgad基因，其全长1400bp。
lpgad F SalI：5′-CGCGTCGACATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3′
lpgad R BamHI：5′-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3′。
8.权利要求1所述钝齿棒杆菌E01发酵产L-谷氨酸的方法，其特征是：通过发酵过程不断添加NH4 +源合成谷氨酸。
9.权利要求3所述的重组钝齿棒杆菌C.crenatum E01/pGAD发酵产γ-氨基丁酸的方法，其特征是：通过诱导使得谷氨酸脱羧酶高效表达，前期通过添加NH4 +源充分合成谷氨酸，后期停止NH4 +源的添加终止谷氨酸的合成，继续发酵合成γ-氨基丁酸。
10.权利要求9中，重组菌C. crenatum E01/pGAD的谷氨酸脱羧酶活力测定方法，其特征是：取冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的活化培养基中，30℃振荡培养过夜，次日转接活化培养基中，IPTG诱导表达，超声波破碎法制备粗酶液，采用比色法进行酶活测定，配制底物溶液Macllvaine缓冲体系(0.2mol/L，pH4.8，含0.1mmol/L PLP，0.4mol/L底物L-谷氨酸钠)，取200μL底物溶液和100μL酶液在30℃反应一定时间，置于冰浴中，加入200μL0.2mol/L硼酸缓冲液(pH9.0)终止反应，加入1.0mL6％苯酚和400μL次氯酸钠溶液，充分振荡后，沸水浴中反应10min，迅速在冰浴中冷却显色，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟产生1μmolγ-氨基丁酸所需的酶量，经测定，重组钝齿棒杆菌谷氨酸脱羧酶活力为0.81U/mL。
11.权利要求9中的底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测方法，其特征是发酵液中葡萄糖和谷氨酸的实时检测通过SBA-40B生物传感分析仪测定；γ-氨基丁酸通过氨基酸测定仪测定，利用氨基酸测定仪分别测定标准样品γ-氨基丁酸和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中γ-氨基丁酸进行定性与定量检测；菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD562。
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| CN102367432A (zh) * | 2011-09-28 | 2012-03-07 | 江南大学 | 一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用 |
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2013
- 2013-02-04 CN CN201310043508.5A patent/CN103215198B/zh active Active
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