CN105602880B - 一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法 - Google Patents

一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于代谢工程及发酵工程技术领域，特别涉及一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法。为了解决现有技术中酶法生产磷脂酰丝氨酸生产成本高、不易获得的问题，本发明提供了一株谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌株是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L‑丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA基因、3‑磷酸甘油酸脱氢酶的突变基因serAΔ197基因和CDP‑甘油二酯合成酶的表达基因cdsA基因而获得。所述菌株经发酵法制备磷脂酰丝氨酸产量较出发菌株提高17‑39％。

Description

一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法
技术领域：
本发明属于代谢工程及发酵工程技术领域，特别涉及一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术：
磷脂酰丝氨酸(PS)广泛存在于动植物及微生物的生物膜中，是一种重要的磷脂成分。动物组织的磷脂中PS的含量非常低，仅为总磷脂的2％～10％，PS在人体内不能由自身完全合成，主要通过外界食物摄取，虽然含量低，但却有着重要的生理功能。PS可帮助脑细胞储存和读取资料、影响脑内化学信息的传递，是维持大脑正常反应和健康情绪的重要营养元素。PS在治疗阿耳茨海默(氏)病、儿童多动症和抑郁症上具有很好的效果。
PS的制备方法比较多，其中主要以提取法和酶转化法为主。提取法主要运用有机溶剂将动植物原料中的PS萃取出来，但这种方法有很多限制因素。动物提取方法主要从牛脑和内脏中提取PS，但因疯牛病等不安全疾病而被质疑；植物中PS含量低，提取量低，并且很难提取高纯度的PS，从而增加了分离纯化的成本，造成PS价格的居高不下。与提取法相比，生物酶法是利用磷脂酰胆碱为基质，加入L-丝氨酸，在磷脂酶D(phospholipase D，PLD)的作用下，生成磷脂酰丝氨酸(PS)，此方法反应条件温和，产品安全级别高，但PLD的生产成本高，不易获得，成为了生产PS的主要瓶颈。
PS作为磷脂成分之一存在于微生物体内，因此利用遗传工程手段获得一株PS合成高的工程菌株为PS的制备提供了新的思路，其中大肠杆菌和酵母菌提取磷脂已有报道，但大肠杆菌并非食品安全菌株，酵母菌也因其生长较缓慢限制了其产业化。谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)作为一种兼性好氧的革兰氏阳性菌，自1957年被分离出来以后，它便逐渐成为全世界范围内氨基酸生产的主要菌株。谷氨酸棒状杆菌是一种食品级的微生物，并且基因操作载体系统完善，因其生长迅速、培养条件简单、耐受性强、发酵条件成熟，是可将PS产业化的潜力菌株。
C.Glutamicum中PS可由前体物质L-丝氨酸和CDP-甘油二酯在磷脂酰丝氨酸合成酶的作用下生成。运用代谢工程原理，对前体物质L-丝氨酸和CDP-甘油二酯代谢途径中的关键酶进行遗传修饰或优化，改变碳流分布，使更多碳流量进入PS合成途径，有利于目的产物PS的合成。C.glutamicum中存在L-丝氨酸的分解代谢途径，Netzer等人[Netzer R,Peters-Wendisch P,Eggeling L,et al.Cometabolism of a nongrowth substrate:L-serine utilization by Corynebacterium glutamicum.Appl Environ Microbiol,2004,70:7148–7155]证明了丝氨酸脱氨酶(sdaA编码)能够催化L-丝氨酸分解为丙酮酸，因此阻断该途径有利于PS前体物质L-丝氨酸的积累。有报道称谷氨酸棒杆菌3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA编码)在缺失C末端197个氨基酸后可以解除来自L-丝氨酸的反馈抑制作用[Peters-Wendisch P,Netzer R,Eggeling L.et al.3-Phosphoglycerate dehydrogenase fromCorynebacterium glutamicum:the C-terminal domain is not essential foractivity but is required for inhibition by L-serine[J].Appl MicrobiolBiotechnol,2002,60(4):437-441]，从而有利于PS前体物质L-丝氨酸的合成。同时，过表达CDP-甘油二酯合成酶(cdsA编码)可提高PS前体物质CDP-甘油二酯在代谢途径中的含量。另外，磷脂酰丝氨酸合成酶(pssA编码)可以L-丝氨酸和CDP-甘油二酯为前体物质，催化合成PS，因此提高其表达量，有利于产物PS的合成。本发明旨在提供一株过量合成磷脂酰丝氨酸谷氨酸棒杆菌及其生产磷脂酰丝氨酸的方法。
发明内容
本发明所要解决上述技术问题所采用的技术方案之一：是提供一种高产磷脂酰丝氨酸(PS)的谷氨酸棒杆菌工程菌，用于过量合成PS。
所述工程菌，是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变基因serAΔ197基因和CDP-甘油二酯合成酶的表达基因cdsA基因；
所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述serAΔ197基因来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其核苷酸序列如序列表SEQID No.2所示；
所述cdsA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
优选的，所述磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因为pssAM基因；
优选的，所述CDP-甘油二酯合成酶的表达基因为cdsAM基因；
优选的，所述工程菌，是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的突变基因pssAM基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因serAΔ197基因和CDP-甘油二酯合成酶突变基因cdsAM基因；
所述pssAM基因，是将来源于E.coli K12的pssA基因进行了密码子优化所得，可提高PS在谷氨酸棒杆菌中15％以上的表达量，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；
所述serAΔ197基因，缺失了谷氨酸棒杆菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶C端的197个氨基酸，可解除丝氨酸反馈抑制，该基因来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13032；
所述cdsAM基因，是cdsA基因的突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示，其表达产物A74R的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，是将谷氨酸棒杆菌中原始CDP-甘油二酯合成酶的第74位氨基酸Ala突变为Arg，酶活提高10％以上；
所述工程菌株具体为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)M-1，该菌株已于2015年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.11923。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二：是提供技术方案一所述工程菌株的制备方法，具体如下：
(1)谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株的构建；
(2)扩增pssA或pssAM基因序列，连接至pXMJ19，构建重组质粒pXMJ19-pssA或pXMJ19-pssAM；
(3)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增serAΔ197基因片段，并连接至表达载体pXMJ19-pssA或pXMJ19-pssAM上，构建出重组质粒pXMJ19-pssA-serAΔ197或pXMJ19-pssAM-serAΔ197；
(4)扩增cdsA或cdsAM基因片段，分别连接至步骤(3)构建的重组质粒上，构建出新的重组质粒；
(5)将步骤(4)获得的重组质粒转化至谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株感受态细胞中；获得了一株过量合成磷脂酰丝氨酸的重组菌株。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三：是提供一种PS制备方法，具体如下：
1)菌株：以技术方案一所述的工程菌株为生产菌株；
2)培养基
活化斜面或平皿培养基：牛肉膏7～12g/L，酵母粉3～6g/L，蛋白胨7～12g/L，氯化钠3～6g/L，玉米浆120～160mL/L，琼脂条10～40g/L，调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min；
种子或发酵培养基：葡萄糖20～40g/L，玉米浆15～45mL/L，豆粕水解液10～30mL/L，K2HPO3·3H2O 1～3g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，尿素2～4g/L，调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min；
3)发酵培养
将30℃、150～250rpm下培养10～14小时的种子培养液以2％接种量转入发酵培养基，于30℃、150～250rpm条件下培养，在培养4～8h时加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，继续培养22～25h。
有益效果：
1、本发明所提供的cdsAM突变基因，将谷氨酸棒杆菌中CDP-甘油二酯合成酶的第74位氨基酸Ala突变为Arg，酶活提高10％以上，继而使PS合成率提高。
2、使用本发明提供的基因工程菌用于发酵制备PS，可使PS产量达到0.3378mg/g－0.4013mg/g菌体，与原始菌株相比提高了17％以上，特别是菌株M-1用于PS发酵，产量较出发菌株提高39％。
附图说明：
图1本发明所构建菌株中sdaA基因敲除验证的琼脂糖凝胶电泳图
其中，M为DNA Marker，1为重组菌株M-1，2为原始菌株ATCC13032；
图2本发明cdsAM基因扩增琼脂糖凝胶电泳图
其中，M为DNA Marker，1为cdsAM；
图3本发明pssAM基因扩增琼脂糖凝胶电泳图
其中，M为DNA Marker，1为pssAM；
图4本发明serAΔ197基因扩增琼脂糖凝胶电泳图
其中，M为DNA Marker，1为serAΔ197；
图5本发明重组质粒pXMJ19-pssAM-serAΔ197-cdsAM的构建图谱。
具体实施方式：
本发明的技术方案可以包含：
本发明所述的谷氨酸棒状杆菌为ATCC13032，基因敲除质粒是pK18mobsacB，表达质粒为pXMJ19。
以下为本技术方案的详细说明：
实施例1谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株的构建
(1)sdaA缺失质粒的构建
1)根据在NCBI中谷氨酸棒杆菌sdaA基因序列设计两对引物，通过PCR方法获得sdaA基因上游703bp片段及下游701bp片段，设计两对引物如下：
sdaAL-F：5'—GGAATTCCATTGCGGCATCTGCTGG—3'
sdaAL-R：5'—CCGGTACCCGGGCTGAGGGTGGGCC—3'
sdaAR-F：5'—CCCTCAGCCCGGTACGGCTTTAACACG—3'
sdaAR-R：5'—GCTCTAGAGCTACACCGCTTGATCGCA—3'
2)采用高保真Pyrobest DNA聚合酶，以左右同源臂为模板，经重叠PCR扩增得到sdaA基因缺失的修饰片段△sdaA；
3)将回收的1387bp目的片段△sdaA与用相同酶切处理的pK18mobsacB连接，获得pK18mobsacB△sdaA,转化E.coli JM109感受态细胞。E.coli JM109感受态细胞制备方法如下：将菌种JM109接种于5mL LB液体培养基中(加Amp终浓度100μg/mL)，37℃摇床培养过夜，然后再按10％的接种量在50mL LB液体培养基中(加Amp终浓度100μg/mL)37℃培养至OD600＝0.4～0.5，倒入离心管中5000rpm/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10％的甘油0.1mol/L的CaCl2水溶液悬浮，冰上放置30min，5000rpm/min，离心10min，弃上清，加1mL含有10％的甘油0.1mol/L的CaCl2水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，-70℃保存。
4)挑取单菌落培养提取质粒，XbaI和EcoRI双酶切鉴定。
(2)谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株的筛选和验证
1)谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态的制备方法如下：挑出单菌落接到含10mL液体培养基的50mL三角瓶。15h后取1mL转接到含50mL液体培养基的250mL三角瓶当OD达到1.524时取出冰浴30min。将所有菌体全部倒入50mL离心管，离心取菌体用TG溶液温和冲洗菌体，低速离心，重复三次。用60％甘油洗菌体，低速离心，重复两次。菌体加1mL60％甘油，混匀，取100μL分装到1.5mL EP管，-70℃保存。
2)将pK18mobsacB△sdaA电击转化至谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032感受态，将在含卡那霉素抗性的固体培养基上长出的单菌落PCR验证，将验证正确的菌转接到10％蔗糖平板上培养。
3)挑出蔗糖板上的菌落，分别对点转接到含卡那抗性培养基和不含卡那抗性固体培养基上培养，将只能在无抗性平板上生长的菌株进行PCR验证。如图1所示。
实施例2C.glutamicum(ΔsdaA)/pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsA的构建
1、表达质粒pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsA的构建
1)运用PCR方法以E.coli K12基因组DNA为模板，扩增pssA基因。
2)将纯化后的PCR产物用XbaI和EcoRI双酶切后连接到含相同酶切位点的表达载体pXMJ19上，构建出重组质粒pXMJ19-pssA。
3)将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单菌落在氯霉素抗性的LB培养基上培养，提取质粒用XbaI和EcoRI双酶切鉴定。
4)运用PCR方法，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增serAΔ197基因片段。
5)将纯化后的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后连接到含相同酶切位点的表达载体pXMJ19-pssA上，构建出重组质粒pXMJ19-pssA-serAΔ197。
6)将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单菌落在氯霉素抗性的LB培养基上培养，提取质粒用BamHI和EcoRI双酶切鉴定。
7)运用PCR方法，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增cdsA基因片段。
8)将纯化后的PCR产物用BamHI和KpnI双酶切后连接到含相同酶切位点的表达载体pXMJ19-pssA-serAΔ197上，构建出重组质粒pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsA。
9)将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单菌落在氯霉素抗性的LB培养基上培养，提取质粒用XbaI和KpnI双酶切鉴定。
2、重组菌株的构建
(1)谷氨酸棒状杆菌工程菌Δsda感受态制备，方法参照实例1中谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态制备方法。
(2)电击转化：
1)取表达质粒pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsA 10μL加入到100μL缺失sdaA基因的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态中混合均匀。
2)移入电转杯中，1800V、5ms电击一次；
3)立即加入预热到46℃的复苏液800μL，46℃水浴热击6min；
4)热击后的菌液置于30℃摇床中恢复培养2-3h；
5)离心1min，吹吸混匀后涂布相应的抗性平板，30℃培养24h；
6)将长出的阳性转化子转接于含氯霉素的液体培养基，培养12h后抽提质粒进行酶切鉴定。
实施例3pssA基因的密码子优化
为了进一步提高pssA基因在C.glutamicum中的表达量对pssA基因进行密码子优化。相关设计原则如下：(1)分析pssA基因和C.glutamicum简并密码子使用频率，优先选择最偏爱的密码子，同时也可以使用部分次偏爱密码子；(2)原pssA基因的氨基酸序列不能改变。
优化后的pssAM和原始pssA的核苷酸序列对比，此次pssA基因密码子优化共改变275个碱基，占pssA基因总碱基数的20.3％，PS在谷氨酸棒杆菌中表达量提高了15％以上。
实施例4cdsA基因的定点突变
1)克隆左、右同源臂片段
利用引物cdsAMF和A74RR进行PCR得到左同源臂，利用引物cdsAMR和A74RF进行
PCR得到右同源臂，此两个反应同步进行，设计两对引物如下：
cdsAMF：5'—CGCGGATCCAAAGGAGGACACGCATGCCCAAACCCAAAAATA—3'
cdsAMR：5'—CGGGGTACCTTACGACGGATACGAGCTG—3'
A74RF：5'—GATCATCGGCGGTCAGCGAATCATCTGGCTG—3'
A74RR：5'—CAGCCAGATGATTCGCTGACCGCCGATGATC—3'
2)基因cdsAM的扩增
将左同源臂和右同源臂等体积并稀释100倍作为重叠PCR模板，在不加引物体系下扩增5次循环，添加引物cdsAMF和cdsAMR后继续扩增25次循环，扩增产物即为cdsAM基因，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其表达产物即为在74位由丙氨酸Ala突变为精氨酸Arg的突变体A74R。如图2所示。经测定其酶活力提高10％以上。
实施例5M-1菌株的构建
1、表达质粒pXMJ19-pssAM-serAΔ197-cdsAM的构建
1)利用引物pssAMF和pssAMR扩增pssAM基因，如图3所示。
pssAMF：5'—TGCTGTAGAATGCTGTCCAAGTTCAAGCG—3'
pssAMR：5'—CCGGAATTCTTACAGGATACGGGAGATCAGA—3'
2)将纯化后的PCR产物用XbaI和EcoRI双酶切后连接到含相同酶切位点的表达载体pXMJ19上，构建出重组质粒pXMJ19-pssAM。
3)将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单菌落在氯霉素抗性的LB培养基上培养，提取质粒用XbaI和EcoRI双酶切鉴定。
4)运用PCR方法，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，利用引物serAΔ197F和serAΔ197R扩增serAΔ197基因片段，如图4所示。引物设计如下：
serAΔ197F：5'—CCGGAATTCAAAGGAGGACACGCGTGAGCCAGAATGGCCG—3'
serAΔ197R：5'—CGCGGATCCTTAAGCCAGATCCATCCACACAG—3'
5)将纯化后的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切后连接到含相同酶切位点的表达质粒pXMJ19-pssAM上，构建出重组质粒pXMJ19-pssAM-serAΔ197。
6)将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单菌落在氯霉素抗性的LB培养基上培养，提取质粒用BamHI和EcoRI双酶切鉴定。
7)基因cdsAM片段用BamHI和KpnI双酶切后连接到含相同酶切位点的质粒pXMJ19-pssAM-serAΔ197上，构建出重组质粒pXMJ19-pssAM-serAΔ197-cdsAM，如图5所示。
8)将重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单菌落在氯霉素抗性的LB培养基上培养，提取质粒用XbaI和KpnI双酶切鉴定。
2、谷氨酸棒杆菌M-1的构建
(1)参照实例1制备缺失sdaA的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞。
(2)电击转化：
1)取表达质粒pXMJ19-pssAM-serAΔ197-cdsAM 10μL加入到100μL谷氨酸棒状杆菌工程菌ΔsdaA感受态中混合均匀。
2)移入电转杯中，1800V、5ms电击一次；
3)立即加入预热到46℃的复苏液800μL，46℃水浴热击6min；
4)热击后的菌液置于30℃摇床中恢复培养2-3h；
5)离心1min，吹吸混匀后涂布相应的抗性平板，30℃培养24h；
6)将长出的阳性转化子转接于含氯霉素的液体培养基，培养12h后提质粒酶切鉴定。
实施例6PS产量计算方法
从sigma公司购买PS的标准品，配制不同浓度的PS标准溶液，0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1g/L，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据峰面积和PS标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝9062.0x-15.166，其中Y为相应浓度PS的峰面积，x为PS的浓度。将未知浓度的PS样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述标准曲线公式得出PS含量。
HPLC检测方法：
色谱条件：
仪器：UV(Agilent Technologies，USA)，
色谱柱：Angel XBP Silica 4.6×250mm，5μm；
流动相：乙腈：甲醇：磷酸＝100:3:1；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
紫外检测波长：205nm。
样品制备：称量10mg样品加到10mL容量瓶中，用氯仿定容至刻度线，经0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析检测PS含量。
实施例7C.Glutamicum(ΔsdaA)/pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsA(缺失sdaA同时串联表达pssA、serAΔ197、cdsA的菌株)发酵条件对PS合成的影响
1)培养基
活化斜面或平皿培养基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，玉米浆150mL/L，琼脂条30g/L，调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min；
种子或发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆35mL/L，豆粕水解液20mL/L，K2HPO3·3H2O2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，尿素3.5g/L，调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min；
2)摇瓶培养
将30℃、200rpm下培养12小时的种子培养基以2％接种量转入发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养，在培养6h时加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，继续培养24h。
PS产量达到最高0.3378mg/g菌体，发酵结束后，与原始菌株ATCC13032相比提高了17％。
实施例8C.Glutamicum(ΔsdaA)/pXMJ19-pssAM-serAΔ197-cdsA(缺失sdaA同时串联表达pssAM、serAΔ197、cdsA的谷氨酸棒杆菌)发酵条件对PS合成的影响
发酵条件同实施例7，发酵结束后C.Glutamicum(ΔsdaA)/pXMJ19-pssAM-serAΔ197-cdsA的PS产量达到最高0.3695mg/g菌体，与原始菌株ATCC13032相比提高了28％。
实施例9C.Glutamicum(ΔsdaA)/pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsAM(缺失sdaA同时串联表达pssA、serAΔ197、cdsAM的谷氨酸棒杆菌)发酵条件对PS合成的影响
发酵条件同实施例7，发酵结束后C.Glutamicum(ΔsdaA)/pXMJ19-pssA-serAΔ197-cdsAM的PS产量达到最高0.3551mg/g菌体，与原始菌株ATCC13032相比提高了23％。
实施例10谷氨酸棒杆菌M-1发酵条件对PS合成的影响
发酵条件同实施例7，发酵结束后谷氨酸棒杆菌M-1的PS产量达到最高0.4013mg/g菌体，与原始菌株ATCC13032相比提高了39％。

Claims (8)

1.一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌，是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达基因serAΔ197基因和CDP-甘油二酯合成酶的表达基因cdsAM基因；
所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述serAΔ197基因来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示；
所述cdsAM基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。
2.如权利要求1所述的一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因为pssAM基因，pssAM基因为pssA基因的突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。
3.一种CDP-甘油二酯合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示。
4.权利要求3所述CDP-甘油二酯合成酶突变体的编码基因，其特征在于，所述基因为cdsAM基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。
5.如权利要求1所述一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌具体为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)M-1，保藏编号为CGMCCNo.11923，该菌的宿主细胞为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。
6.如权利要求1所述一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：
(1)谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株的构建；
(2)扩增磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因，连接至pXMJ19，构建重组质粒；
(3)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增serAΔ197基因片段，并连接至步骤(2)所得重组质粒上，构建出新的重组质粒；
(4)扩增CDP-甘油二酯合成酶的表达基因，并连接至步骤(3)所得重组质粒，构建出新的重组质粒；
(5)将步骤(4)所得重组质粒转化至谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株感受态细胞中；获得了一株过量合成磷脂酰丝氨酸的重组菌株。
7.一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于，具体如下：
1)菌株：以权利要求1-2所述的工程菌株为生产菌株；
2)培养基
活化斜面或平皿培养基：牛肉膏7～12g/L，酵母粉3～6g/L，蛋白胨7～12g/L，氯化钠3～6g/L，玉米浆120～160mL/L，琼脂条10～40，调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min；
种子或发酵培养基：葡萄糖20～40g/L，玉米浆15～45mL/L，豆粕水解液10～30mL/L，K2HPO3·3H2O 1～3g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，尿素2～4g/L，调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min；
3)摇瓶培养
将30℃、150～250rpm下培养10～14小时的种子培养液以2％接种量转入发酵培养基，于30℃、150～250rpm条件下培养，在培养4～8h时加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，继续培养22～25h。
8.如权利要求7所述的一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于，所述生产菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)M-1，保藏编号为CGMCC No.11923。
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