CN107227283B - 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码6‑磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸。本发明所述谷氨酸棒杆菌对戊糖磷酸途径中的gnd基因进行点突变，使得6‑磷酸葡糖酸脱氢酶的第361位的丝氨酸被苯丙氨酸替代，而减弱6‑磷酸葡糖酸脱氢酶的变构调节，从而增强NADPH再生能力，为脯氨酸合成提供充足的NADPH，进而提高脯氨酸的产量。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L‑脯氨酸高产菌株，能有效积累L‑脯氨酸，提高L‑脯氨酸的产量，为L‑脯氨酸的工业化生产奠定了基础。

Description

一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
背景技术
L-脯氨酸(L-proline)，化学名称为L-吡咯烷酮羧酸，分子式为C5H9NO2，相对分子质量为115。脯氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的21种氨基酸之一。脯氨酸广泛应用于医药、食品及调味剂、农业和有机化学。作为氨基酸类药物，脯氨酸是复方氨基酸大输液原料之一，用于营养不良、蛋白质缺乏症、严重胃肠道疾病，烫伤及外科手术后的蛋白质补充。脯氨酸可以调节细胞的渗透压，稳定蛋白的结构。随着研究不断深入，脯氨酸的应用范围也进一步扩大。因此，脯氨酸的生产具有非常广泛的应用前景。
目前，L-脯氨酸的生产方法有三种：化学合成法、酶解法、微生物发酵法。化学合成法和酶解法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，成为目前生产L-脯氨酸主流方法。
棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophlum)和黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。为了改善这些微生物的L-脯氨酸生产能力，可以通过传统诱变进行菌株选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-脯氨酸的目的。以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)2247为出发菌，吉永获得了一株L-异亮氨酸缺陷型变异株NO.14-5，经72小时培养可生成1.2％-1.5％的脯氨酸。张伟国以嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophlum)ATCC 13870为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变处理及结构类似物定向选育，获得了一株L-脯氨酸高产菌ZQ-3，在含16％葡萄糖的培养基中，摇瓶发酵72h，产酸率为5.4％。但目前L-脯氨酸的菌种的发酵性能仍较差、L-脯氨酸的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种L-脯氨酸产量高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌，其细胞内编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸。
6-磷酸葡糖酸脱氢酶是戊糖磷酸途径中产NADPH的关键酶之一。本发明对戊糖磷酸途径中的gnd基因进行点突变，使得6-磷酸葡糖酸脱氢酶的第361位的丝氨酸被苯丙氨酸替代，而减弱6-磷酸葡糖酸脱氢酶的变构调节，从而增强NADPH再生能力，为脯氨酸合成提供充足的NADPH，进而提高脯氨酸的产量。所述谷氨酸棒杆菌通过使用gnd基因而被修饰使得所述菌株的产生L-脯氨酸的能力与所述谷氨酸棒杆菌的未修饰的菌株相比增强。
在一个实施方案中，本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌MHZ-0701，其细胞内gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13757。
本发明提供了所述谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括：
步骤A、构建编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的重组质粒；
步骤B、将重组质粒转化谷酸棒杆菌MHZ-0700，用含卡那霉素的选择培养基筛选转化子，将筛得的转化子用液体脑心浸液培养基培养；
步骤C、培养物稀释后涂布在含有10％蔗糖的固体脑心浸液培养基上，培养获得重组菌株。
优选的，所述载体为pK18mobsacB。即步骤A所述重组质粒为pK18mobsacB-gnd361。
在一些具体实施方案中，步骤A所述构建编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的重组质粒的方法具体包括以下步骤：
1)以ATCC13870基因组为模板，以gnd-1f/gnd-1r引物对进行PCR扩增得到上游片段gnd361-up；以ATCC13870基因组为模板，以gnd-2f/gnd-2r引物对进行PCR扩增得到下游片段gnd361-dn；
2)以gnd361-up、gnd361-dn两片段混合物为模板，以gnd-1f/gnd-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的gnd361片段；
3)将gnd361片段和pK18mobsacB载体分别用EcoRI、BamHI进行双酶切，酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-gnd361。
MHZ-0700是一株性能优异的脯氨酸生产菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13756。本发明步骤B以脯氨酸生产菌MHZ-0700为出发菌株，重组质粒pK18mobsacB-gnd361以电穿孔方法转化MHZ-0700感受态细胞，其中突变的基因由于同源性被插入到MHZ-0700染色体中。在含有卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，将筛得的转化子培养，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。
其中优选的，步骤B所述含卡那霉素的选择培养基中卡那霉素的浓度为15mg/L；所述选择培养基为固体脑心浸液培养基。
进一步优选的，步骤B所述培养为33℃、220rpm振荡培养过夜。本领域技术人员可以理解所述培养过夜可以为培养8-14h。
本发明所述构建方法步骤C将培养物稀释后涂布在含有10％蔗糖的固体脑心浸液培养基上，培养获得重组菌株。
其中，所述稀释为将培养物做连续梯度稀释。在一些实施例中所述稀释具体为将培养物从10-2连续稀释至10-4。
步骤C所述固体脑心浸液培养基为脑心浸液培养基添加1.5％的琼脂。
优选的，步骤C所述培养为33℃静置培养48h。
利用本发明获得的谷氨酸棒杆菌进行发酵生产，可获得L-脯氨酸的有效积累，为L-脯氨酸的工业化生产奠定基础。因此本发明还提供了所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-脯氨酸中的应用。
优选的，所述谷氨酸棒杆菌为保藏编号为CGMCC No.13757的谷氨酸棒杆菌MHZ-0701。
进一步的，本发明还提供了一种L-谷氨酰胺的生产方法，将细胞内编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。
其中，优选的，所述谷氨酸棒杆菌为保藏编号为CGMCC No.13757的谷氨酸棒杆菌MHZ-0701。
优选的，所述种子培养基中玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO3 0.5％，余量为水，pH 7.2。
优选的，所述发酵培养基中玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO3 4％，VH 70μg/L，VB1·HCl 80μg/L，余量为水，pH 7.2。
优选的，所述发酵条件为33℃，发酵72h。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸。本发明所述谷氨酸棒杆菌对戊糖磷酸途径中的gnd基因进行点突变，使得6-磷酸葡糖酸脱氢酶的第361位的丝氨酸被苯丙氨酸替代，而减弱6-磷酸葡糖酸脱氢酶的变构调节，从而增强NADPH再生能力，为脯氨酸合成提供充足的NADPH，进而提高脯氨酸的产量。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L-脯氨酸高产菌株，能有效积累L-脯氨酸，提高L-脯氨酸的产量，为L-脯氨酸的工业化生产奠定了基础。
生物保藏说明
MHZ-0701，分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，于2017年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13757。
MHZ-0700，分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，于2017年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13756。
具体实施方式
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，本实验涉及的L-脯氨酸生产菌种的亲代菌株为ATCC13870，菌种的拉丁学名是Corynebacterium acetoacidophlum ATCC 13870。所述液体脑浸心培养基购自ThermoFisher Oxoid。
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-gnd361的构建及在MHZ-0700中引入点突变
(1)pK18mobsacB-gnd361质粒的构建
以ATCC13870基因组为模板，以gnd-1f/gnd-1r引物对进行PCR扩增得到上游片段gnd361-up；以ATCC13870基因组为模板，以gnd-2f/gnd-2r引物对(如表1所示)进行PCR扩增得到下游片段gnd361-dn。以gnd361-up、gnd361-dn两片段混合物为模板，以gnd-1f/gnd-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的gnd361片段。gnd361片段用EcoRI、BamHI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双酶切。两酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-gnd361。
(2)MHZ-0700中引入点突变
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-0700感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-gnd361以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的固体脑浸心培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-0701。
表1引物序列
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO：
gnd-1f actgaattcaagatggtccacaacggcatcga 1
gnd-1r agttgttctcgtcgaagccagccttgatc 2
gnd-2f gatcaaggctggcttcgacgagaacaact 3
gnd-2r cgcggatcctatcgacgcccacctccggcgaa 4
实施例2：L-脯氨酸基因工程菌发酵生产L-脯氨酸
1、培养基
种子活化培养基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH 7.2。
种子培养基：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO3 0.5％，pH 7.2。
发酵培养基：玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO3 4％，VH 70μg/L，VB1·HCl 80μg/L，pH 7.2。
2、MHZ-0701摇瓶发酵生产L-脯氨酸
(1)种子培养：挑取MHZ-0700、MHZ-0701斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16-22h；
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h。
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-脯氨酸含量，其浓度如下表2所示。
表2L-脯氨酸含量检测
菌株名称 MHZ-0700(出发菌) MHZ-0701(工程菌)
L-脯氨酸浓度g/L 30.3 38.1
如上表中所示，出发菌株MHZ-0700的L-脯氨酸的积累量为30.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-0701的L-脯氨酸产量为38.1g/L，比出发菌株产量提高1.26倍，由此可见gndS361F突变利于脯氨酸的积累。
SEQUENCE LISTING
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
<130> MP1705479
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actgaattca agatggtcca caacggcatc ga 32
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agttgttctc gtcgaagcca gccttgatc 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcaaggct ggcttcgacg agaacaact 29
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcggatcct atcgacgccc acctccggcg aa 32

Claims (7)

1.一种具有产生L-脯氨酸的能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，所述菌株的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸；所述谷氨酸棒杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13757。
2.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括：
步骤A、构建含有编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的突变基因的 重组质粒；
步骤B、将重组质粒转化谷酸棒杆菌MHZ-0700，用含卡那霉素的选择培养基筛选转化子，将筛得的转化子用液体脑心浸液培养基培养；所述谷酸棒杆菌MHZ-0700的保藏编号为CGMCC No.13756；
步骤C、培养物稀释后涂布在含有10％蔗糖的固体脑心浸液培养基上，培养获得重组菌株；
其中，步骤A所述构建含有 编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的突变基因的 重组质粒的方法具体包括以下步骤：
1)以ATCC13870基因组为模板，以gnd-1f/gnd-1r引物对进行PCR扩增得到上游片段gnd361-up；以ATCC13870基因组为模板，以如表1所示的gnd-2f/gnd-2r引物对进行PCR扩增得到下游片段gnd361-dn；
表1引物序列
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO： gnd-1f actgaattcaagatggtccacaacggcatcga 1 gnd-1r agttgttctcgtcgaagccagccttgatc 2 gnd-2f gatcaaggctggcttcgacgagaacaact 3 gnd-2r cgcggatcctatcgacgcccacctccggcgaa 4
2)以gnd361-up、gnd361-dn两片段混合物为模板，以gnd-1f/gnd-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的gnd361片段；
3)将gnd361片段和pK18mobsacB载体分别用EcoRI、BamHI进行双酶切，酶切产物以T4DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-gnd361。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤B所述含卡那霉素的选择培养基中卡那霉素的浓度为15mg/L；步骤B所述培养的条件为33℃、220rpm振荡培养过夜；步骤C所述培养的条件为33℃静置培养48h。
4.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-脯氨酸中的应用。
5.一种L-脯氨酸的生产方法，其特征在于，将细胞内编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的第361位丝氨酸突变为苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵；所述谷氨酸棒杆菌保藏编号为CGMCC No.13757。
6.根据权利要求5所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基的组成为：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，余量为水，pH 7.2；
所述发酵培养基中玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO3 4％，VH 70μg/L，VB1·HCl 80μg/L，余量为水，pH 7.2。
7.根据权利要求5所述生产方法，其特征在于，所述发酵条件为33℃，发酵72h。
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