CN106536724A - 使用甘氨酸裂解系统在棒杆菌中生产l‑氨基酸的方法 - Google Patents

使用甘氨酸裂解系统在棒杆菌中生产l‑氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

令人惊奇地发现，腐殖质还原棒杆菌菌株包含非常有效的甘氨酸裂解系统。

Description

使用甘氨酸裂解系统在棒杆菌中生产L-氨基酸的方法
本发明涉及一种在棒杆菌中生产L-氨基酸的方法，其中使用甘氨酸裂解系统。
使用棒杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法为本领域技术人员已知。
尽管已知许多棒杆菌菌种，但是这些方法中通常使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)种，因为发现这个菌种对于生产L-氨基酸特别有益。
也已经发现L-氨基酸的产量可以通过使用甘氨酸裂解系统(GCV)而进一步增加，因为不希望的L-甘氨酸副产物的形成可以由甘氨酸裂解系统在很大程度上阻止。抑制L-甘氨酸形成或者过量L-甘氨酸降解在L-甲硫氨酸的生产中特别有意义，因为L-甘氨酸在此是作为等摩尔副产物产生的。
甘氨酸裂解系统由两或多个亚基组成，即亚基GcvP、GcvT和GcvH。其表现为多酶复合物形式，催化甘氨酸的氧化脱羧化和脱氨化为二氧化碳、铵离子和N5-10-亚甲基四氢叶酸。
甘氨酸脱氢酶GcvP是含有磷酸吡哆醛的脱羧酶，其释放二氧化碳并留下与磷酸吡哆醛结合的氨基甲基化合物。
H-蛋白GcvH是含有硫辛酰胺(硫辛酰胺)的氨基甲基转移酶。
酶GcvT催化四氢叶酸对于氨基甲基硫辛酰胺的亲核性攻击，形成N5-10-亚甲基四氢叶酸及释放铵离子，其中完全还原的硫辛酰胺保持与GcvH结合。
甘氨酸裂解系统不是存在于所有棒杆菌中，迄今为止仅描述了非常少的棒杆菌。例如，特别优选用于氨基酸生产的生产菌株谷氨酸棒杆菌没有固有的甘氨酸裂解系统。为了利用甘氨酸裂解系统对于谷氨酸棒杆菌的优势，将这种系统从另一棒杆菌中掺入谷氨酸棒杆菌中并异源表达。目前来自杰氏棒杆菌(C.jeikeium)(WO 2008/101857)的甘氨酸裂解系统用于此目的。在这种情况中的一个严重不利影响是杰氏棒杆菌是一种病原性生物。另一不利影响是对于不希望的甘氨酸副产物的降解，需要制备异源构建体。
因此，本发明的一个主要目的是提供新的甘氨酸裂解系统，优选非源自病原性生物的甘氨酸裂解系统，其中所述甘氨酸裂解系统优选适于掺入其它棒杆菌中，特别是谷氨酸棒杆菌中。
本发明的另一目的是提供棒杆菌，其固有地能产生L-氨基酸及另外具有固有的甘氨酸裂解系统，由此在谷氨酸棒杆菌的情况中不需要制备异源构建体。
根据本发明现在已经令人惊奇地发现非病原性的腐殖质还原棒杆菌(C.humireducens)种具有固有的甘氨酸裂解系统，其在结构上与迄今为止描述的甘氨酸裂解系统显著不同。
令人惊奇地进一步发现，腐殖质还原棒杆菌的甘氨酸裂解系统非常有效，由此在氨基酸合成中的不希望的副产物甘氨酸，如果有的话，在野生型菌株中仅以相对低的量积聚在细胞中。通过扩增本发明的甘氨酸裂解系统，特别是通过过表达，可以相应地进一步改善对甘氨酸副产物形成的抑制作用。特别地，在其它微生物、特别是在谷氨酸棒杆菌中甘氨酸副产物形成也可以通过本发明的甘氨酸裂解系统的过表达而被有效地抑制。
令人惊奇地进一步发现腐殖质还原棒杆菌通过其固有需求，甚至固有地能产生L-氨基酸，特别是L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-谷氨酸，由此腐殖质还原棒杆菌是具有同源甘氨酸裂解系统的L-氨基酸生产菌株，其可以特别用做起始点以开发进一步的具有宿主甘氨酸裂解系统的生产菌株。
腐殖质还原棒杆菌由Wu et al.(International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(2011),61,882-887)首次描述。所述菌株保藏在DSMZ中，保藏号为DSM 45392，其16S rRNA保藏在EMBL中，登记号为GQ421281。亲本菌株是耐盐的、嗜碱性腐殖酸还原性细菌。
关于腐殖质还原棒杆菌的进一步信息见于如下出版物：Wu et al.(Microb.Biotechnol.(2013),6(2),141-149)，Lin et al.(Bioresour.Technol.(2013),136,302-308)。
本发明的第一方面因此涉及选自如下的甘氨酸裂解系统的酶：
a)酶GcvP，其与SEQ ID NO:40所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
b)酶GcvT，其与SEQ ID NO:42所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
c)酶GcvH，其与SEQ ID NO:38所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性。
本发明因此进一步涉及包含酶GcvP、GcvT和GcvH的甘氨酸裂解系统，特征在于所述系统包含至少一种如下多肽：
a)酶GcvP，其与SEQ ID NO:40所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
b)酶GcvT，其与SEQ ID NO:42所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
c)酶GcvH，其与SEQ ID NO:38所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性。
在这种情况中，本发明的甘氨酸裂解系统优选包含至少两种、优选全部三种上述多肽(a)-(c)。
特别优选的是包含如下三种多肽的甘氨酸裂解系统：
a)酶GcvP，其与SEQ ID NO:40所示序列具有至少95或98％序列相同性，
b)酶GcvT，其与SEQ ID NO:42所示序列具有至少95或98％序列相同性，
c)酶GcvH，其与SEQ ID NO:38所示序列具有至少95或98％序列相同性。
广义上，酶LpdA、LplA、LipA、LipB和GcvH也属于甘氨酸裂解系统。
二氢硫辛酰胺脱氢酶(LpdA)再氧化(reoxidises)结合GcvH的硫辛酰胺。
硫辛酸-蛋白质连接酶A(LplA)催化GcvH的硫辛酰化。
硫辛酸合酶(LipA)催化硫辛酸的合成。
硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白N-硫辛酰转移酶(LipB)催化硫辛酸转移至GcvH。
GcvL是二氢硫辛酰脱氢酶。
在一个优选的实施方案中，本发明的甘氨酸裂解系统因此进一步包含选自如下的至少一种进一步的酶：
a)酶LipA，优选与SEQ ID NO:48所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LipA，
b)酶LipB，优选与SEQ ID NO:50所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LipB，
c)酶Lpd，优选与SEQ ID NO:52所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶Lpd，
d)酶LplA，优选与SEQ ID NO:94所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LplA，
e)酶GcvL，优选与SEQ ID NO:96所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶GcvL。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的甘氨酸裂解系统在这种情况中包含至少两种、三种或四种、优选全部五种上述多肽。
本发明因此进一步涉及选自如下一组的酶：
a)酶LipA，优选与SEQ ID NO:48所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LipA，
b)酶LipB，优选与SEQ ID NO:50所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LipB，
c)酶Lpd，优选与SEQ ID NO:52所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶Lpd，
d)酶LplA，优选与SEQ ID NO:94所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LplA，
e)酶GcvL，优选与SEQ ID NO:96所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别是至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶GcvL。
另外或者除了使用保证硫辛酸和/或硫辛酰胺适当合成之外的合适酶之外，这些化合物也可以加入反应培养基中，例如以直至15mM的量加入。
本发明进一步涉及编码本发明的酶和/或本发明的甘氨酸裂解系统的多核苷酸。这些多核苷酸优选选自如下一组：
a)多核苷酸(gcvP)，其编码酶GcvP及与SEQ ID NO:39位置301-3162所示序列具有至少70或75％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:39位置301-3162所示序列互补的多核苷酸杂交；
b)多核苷酸(gcvT)，其编码酶GcvT及与SEQ ID NO:41位置301-1404所示序列具有至少70或75％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:41位置301-1404所示序列互补的多核苷酸杂交；
c)多核苷酸(gcvH)，其编码酶GcvH及与SEQ ID NO:37位置301-699所示序列具有至少70或75％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:37位置301-699所示序列互补的多核苷酸杂交；
d)多核苷酸(lipA)，其编码酶LipA及与SEQ ID NO:47位置301-1344所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:47位置301-1344所示序列互补的多核苷酸杂交；
e)多核苷酸(lipB)，其编码酶LipB及与SEQ ID NO:49位置301-1089所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:49位置301-1089所示序列互补的多核苷酸杂交；
f)多核苷酸(lpd)，其编码酶Lpd及与SEQ ID NO:51位置301-1710所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:51位置301-1710所示序列互补的多核苷酸杂交；
g)多核苷酸(lplA)，其编码酶LplA及与SEQ ID NO:93位置301-1089所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:93位置301-1089所示序列互补的多核苷酸杂交；
h)多核苷酸(gcvL)，其编码酶GcvL及与SEQ ID NO:95位置301-1710所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％的序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:95位置301-1710所示序列互补的多核苷酸杂交。
根据本发明，“严格条件”是指在盐浓度1×SSC和0.1％重量SDS在80℃温度条件下洗涤。
本发明进一步涉及多核苷酸，其与上述的编码多核苷酸互补。
本发明进一步涉及合适的载体，特别是克隆和表达载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。这些载体可适当地掺入微生物中，特别是棒状细菌中，特别是棒杆菌属，或者肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌中，尤其是埃希氏菌属(Escherichia)。
本发明的载体可包含本发明的一或多种多核苷酸。本发明优选的载体包含编码选自GcvP、GcvT和GcvH的本发明的酶的至少一种多核苷酸。特别优选的载体包含编码本发明所有三种酶GcvP、GcvT和GcvH的多核苷酸。
本发明的载体优选具有一和/或多个合适的启动子及任选进一步的调节元件，其使得本发明的多核苷酸可以在重组细菌、优选重组棒杆菌中表达。
此外，为了表达编码的基因，本发明的多核苷酸也可以掺入微生物基因组中，特别是掺入棒状细菌的基因组中，特别是棒杆菌属那些细菌基因组中，或者掺入肠杆菌科、特别是埃希氏菌属细菌基因组中。
本发明还进一步涉及相应的重组微生物，优选细菌，特别是棒状细菌，尤其是棒杆菌属细菌，特别是腐殖质还原棒杆菌和谷氨酸棒杆菌菌种，以及肠杆菌科细菌，特别是埃希氏菌属细菌，其包含本发明的至少一种酶和/或本发明的至少一种多核苷酸和/或本发明的至少一种载体和/或本发明的一种甘氨酸裂解系统和/或编码本发明甘氨酸裂解系统的多核苷酸。
在本文中，一个优选的方面是重组棒杆菌，特别是腐殖质还原棒杆菌和谷氨酸棒杆菌菌种，其包含选自GcvP、GcvT和GcvH的本发明的至少一种酶、优选本发明的所有酶和/或编码所述酶的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的至少一种载体。
本发明还特别涉及重组微生物，优选细菌，特别是棒状细菌，尤其是除了腐殖质还原棒杆菌之外的棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌，其包含本发明的至少一种酶和/或本发明的至少一种多核苷酸和/或本发明的至少一种载体和/或本发明的一种甘氨酸裂解系统和/或编码本发明甘氨酸裂解系统的多核苷酸。
在本文中，一个优选的方面是除了腐殖质还原棒杆菌之外的重组棒杆菌，特别是谷氨酸棒杆菌菌种，其包含选自GcvP、GcvT和GcvH的本发明的至少一种酶、优选本发明的所有酶和/或编码所述酶的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的至少一种载体。
根据本发明，“重组微生物”或者“重组细菌”应理解为是指已经经历至少一种遗传工程措施的微生物或细菌。在本文中，所述遗传工程措施可特别是靶向或随机突变、掺入外源基因和/或过表达或弱化宿主基因或外源基因。本发明的重组微生物或重组细菌优选特征在于至少一个基因的过表达或弱化。在一特别优选的实施方案中，本发明的重组微生物或本发明的重组细菌特征在于本发明的至少一种酶和/或编码所述酶的多核苷酸的过表达和/或本发明的甘氨酸裂解系统或编码所述系统的多核苷酸的过表达。
关于甘氨酸形成所用语“相对低量”应理解为在完成发酵后在细胞中和/或在发酵培养基中在每种情况中基于积聚的甘氨酸含量至多0.3g/l、优选至多0.2或0.1g/l、特别优选至多0.05或至多0.03g/l的量。
在棒杆菌属中，本发明优选基于如下菌种的菌株：有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)，如模式菌株DSM44549，谷氨酸棒杆菌，如模式菌株ATCC13032或者菌株R，产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，如模式菌株ATCC6871，腐殖质还原棒杆菌，如菌株DSM 45392，以及北京棒杆菌(Corynebacterium pekinese)，如菌株CGMCC No.5361。
特别优选的是谷氨酸棒杆菌和腐殖质还原棒杆菌。在本说明书中，如果提及菌株腐殖质还原棒杆菌，则所述菌株优选是菌株DSM 45392或从中衍生的菌株。
谷氨酸棒杆菌种的一些代表也为本领域已知。这些代表例如包括：嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、百合棒杆菌(Corynebacteriumlilium)DSM20137、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869和双歧杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020。关于谷氨酸棒杆菌的术语“产谷氨酸小球菌”同样使用。有效棒杆菌种的一些代表在本发明也称作热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，例如菌株FERM BP-1539。
关于棒状细菌菌株的分类目信息可见于Seiler(Journal of GeneralMicrobiology 129,1433-1477(1983))、Kinoshita(1985,Glutamate Bacteria,p115-142.in:Demain and Solomon(ed),Biology of Industrial Microorganisms.TheBenjamin/Cummins Publishing Co.,London,UK)、and Kroppenstedt(CanadianJournal of Microbiology 42,989-1005(1996))、Liebl et al(International Journalof Systematic Bacteriology 41,255-260(1991))、Fudou et al(InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52,1127-1131(2002))和US-A-5,250,434。
以“ATCC”命名的菌株可得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)。以“DSM”命名的菌株可得自Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养中心)(DSMZ,Braunschweig,Germany)。以“NRRL”命名的菌株可得自Agricultural Research Service Patent Culture Collection(ARS,Peoria,Illinois,US)。以“FERM”命名的菌株可得自National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST Tsukuba Central 6,1-1-1Higashi,TsukubaIbaraki,Japan)。以“CGMCC”命名的菌株可得自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国北京)。
本发明进一步还涉及过量产生L-氨基酸的方法，特征在于所述方法中使用本发明的至少一种酶和/或编码所述酶的多核苷酸和/或本发明的甘氨酸裂解系统和/或编码所述系统的多核苷酸和/或本发明的重组微生物、优选本发明的重组细菌、特别是本发明的重组棒状细菌、特别优选本发明的重组棒杆菌、尤其是腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌。在本发明的优选实施方案中，本发明的至少一种多核苷酸在这种情况中是以过表达形式使用的。
在这种情况中，本发明优选涉及一种过量产生L-氨基酸的方法，特征在于所述方法中使用包含酶GcvP、GcvT和GcvH的甘氨酸裂解系统，其中甘氨酸裂解系统包含本发明的酶GcvP、GcvT和GcvH中的至少一种，和/或编码甘氨酸裂解系统的酶GcvP、GcvT和GcvH的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含本发明多核苷酸gcvP、gcvT和gcvH中的至少一种，和/或使用重组棒杆菌，优选腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌种，其包含选自GcvP、GcvT和GcvH的至少一种本发明的酶、优选本发明的全部三种酶，和/或选自gcvP、gcvT和gcvH的本发明的至少一种多核苷酸、优选全部三种多核苷酸。
在这种情况中，本发明特别优选涉及一种过量产生L-氨基酸的方法，特征在于所述方法中使用甘氨酸裂解系统，其包含本发明的酶GcvP、GcvT和GcvH和/或编码所述酶的多核苷酸，和/或在所述方法中使用重组棒杆菌，优选腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌种，其包含这种甘氨酸裂解系统和/或编码所述系统的多核苷酸。
根据本发明，“L-氨基酸”应理解为特别是指蛋白原性L-氨基酸。
在这种情况中，L-氨基酸优选选自L-丙氨酸，L-缬氨酸、谷氨酸家族的L-氨基酸、特别是L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸和L-精氨酸及天冬氨酸家族的L-氨基酸、特别是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸和L-苏氨酸，特别优选选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸。特别优选L-甲硫氨酸。
根据本发明，L-氨基酸的过量产生优选是在腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌中实现的。
本发明的方法优选特征在于仅低量的甘氨酸作为副产物产生。在本发明的方法中，甘氨酸产生量优选为低于0.2g/l，特别是低于0.1g/l，特别优选低于0.05g/l。
关于L-氨基酸的“过量产生”，根据本发明应理解为是指微生物根据其自身需要产生L-氨基酸，富集在细胞中或者分泌进其聚集的周围营养培养基中。在这种情况中，微生物优选具有在细胞或营养培养基中在≤(至多)120小时、≤96小时、≤48小时、≤36小时、≤24小时或者≤12小时内富集或积聚≥(至少)0.25g/l、≥0.5g/l、≥1.0g/l、≥1.5g/l、≥2.0g/l、≥4g/l或者≥10g/l相关L-氨基酸的能力。
在一优选的实施方案中，其中已经掺入本发明的多核苷酸和/或本发明的载体的本发明重组微生物，在掺入本发明的多核苷酸和/或本发明的载体之前，已经具有过量产生L-氨基酸的能力。起始菌株优选是通过诱变和选择、通过重组DNA技术或者通过组合这两种方法产生的菌株。
显然且不需要更多的解释，也可以在野生型菌株中存在或者已经掺入本发明的多核苷酸和/或本发明的载体由此产生本发明的重组微生物，及通过随后合适的进一步遗传工程措施，导致L-氨基酸产生或者L-氨基酸的产量增加。
本发明进一步涉及腐殖质还原棒杆菌的其它多核苷酸及由所述多核苷酸编码的多肽。通过相关多核苷酸或多肽的过表达，可以正面影响某些L-氨基酸的氨基酸产生。
本发明因此还涉及：
a)与SEQ ID NO:106所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的苏氨酸脱水酶(IlvA，EC 4.3.1.19)及编码其的多核苷酸，
b)与SEQ ID NO:98所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的乙酰乳酸合酶(IIvB)的亚基及编码其的多核苷酸，
c)与SEQ ID NO:100所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的异构体还原酶(IlvC，EC 1.1.1.86)及编码其的多核苷酸，
d)与SEQ ID NO:102所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的二羟酸脱水酶(IlvD，EC 4.2.1.9)及编码其的多核苷酸，
e)与SEQ ID NO:104所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的转氨酶(IlvE，EC 2.6.1.42)及编码其的多核苷酸，
f)与SEQ ID NO:122所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的乙酰乳酸合酶(IlvH，EC 2.2.1.6)及编码其的多核苷酸，
g)与SEQ ID NO:118所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(PanB，EC 2.1.2.11)及编码其的多核苷酸，
h)与SEQ ID NO:120所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的泛酸合酶(PanC，EC 6.3.2.1)及编码其的多核苷酸，
i)与SEQ ID NO:124所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的谷氨酸脱氢酶(Gdh)及编码其的多核苷酸，
j)与SEQ ID NO:126所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的谷氨酰胺合成酶(谷氨酰胺合成酶1)及编码其的多核苷酸，
k)与SEQ ID NO:128所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的谷氨酰胺合成酶(谷氨酰胺合成酶2)及编码其的多核苷酸，
l)与SEQ ID NO:130所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的谷氨酸合酶及编码其的多核苷酸，
m)与SEQ ID NO:132所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的异柠檬酸脱氢酶及编码其的多核苷酸，
n)与SEQ ID NO:134所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的乌头酸水化酶及编码其的多核苷酸，
o)与SEQ ID NO:136所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的柠檬酸合酶及编码其的多核苷酸，
p)与SEQ ID NO:138所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的氨基肽酶C(PepC)及编码其的多核苷酸，
q)与SEQ ID NO:140所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸脱氢酶及编码其的多核苷酸，
r)与SEQ ID NO:142所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸激酶(丙酮酸激酶1)及编码其的多核苷酸，
s)与SEQ ID NO:144所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸激酶(丙酮酸激酶2)及编码其的多核苷酸，
t)与SEQ ID NO:146所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的烯醇化酶及编码其的多核苷酸，
u)与SEQ ID NO:148所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的2,3-二磷酸甘油酸-依赖性磷酸甘油酸变位酶(GpmA)及编码其的多核苷酸，
v)与SEQ ID NO:150所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸甘油酸激酶(Pgk)及编码其的多核苷酸，
w)与SEQ ID NO:152所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(甘油-3-磷酸脱氢酶1)及编码其的多核苷酸，
x)与SEQ ID NO:154所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(甘油-3-磷酸脱氢酶2)及编码其的多核苷酸，
y)与SEQ ID NO:156所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸丙糖异构酶(TpiA)及编码其的多核苷酸，
z)与SEQ ID NO:158所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的果糖二磷酸醛缩酶及编码其的多核苷酸，
aa)与SEQ ID NO:160所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的1-磷酸果糖激酶及编码其的多核苷酸，
bb)与SEQ ID NO:162所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的6-磷酸果糖激酶及编码其的多核苷酸，
cc)与SEQ ID NO:4所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸激酶(ThrB，EC 2.7.1.39)及编码其的多核苷酸，
dd)与SEQ ID NO:22所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的半胱氨酸合酶(CBS，CysK)及编码其的多核苷酸，
ee)与SEQ ID NO:26所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚β-裂解酶(AecD)及编码其的多核苷酸，
ff)与SEQ ID NO:28所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd，EC 1.2.1.11)及编码其的多核苷酸，
gg)与SEQ ID NO:30所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的支链氨基酸转运蛋白的较小亚基(BrnE)及编码其的多核苷酸，
hh)与SEQ ID NO:32所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的支链氨基酸转运蛋白的较大亚基(BrnF)及编码其的多核苷酸，
ii)与SEQ ID NO:34所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丝氨酸乙酰转移酶(CysE)及编码其的多核苷酸，
jj)与SEQ ID NO:36所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的半胱氨酸合酶(CysK)及编码其的多核苷酸，
kk)与SEQ ID NO:44所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)及编码其的多核苷酸，
ll)与SEQ ID NO:46所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的任选反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(Hom，EC 1.2.1.11)及编码其的多核苷酸，
mm)与SEQ ID NO:54所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的任选反馈抗性天冬氨酸激酶(LysC，EC 2.7.2.4)及编码其的多核苷酸，
nn)与SEQ ID NO:56所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚γ-合酶(MetB)及编码其的多核苷酸，
oo)与SEQ ID NO:58所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)及编码其的多核苷酸，
pp)与SEQ ID NO:60所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)及编码其的多核苷酸，
qq)与SEQ ID NO:62所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的O-乙酰高丝氨酸裂解酶(MetY)及编码其的多核苷酸，
rr)与SEQ ID NO:64所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的任选反馈抗性丙酮酸羧化酶(Pyc，EC 6.4.1.1)及编码其的多核苷酸，
ss)与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的任选反馈抗性D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)及编码其的多核苷酸，
tt)与SEQ ID NO:68所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)及编码其的多核苷酸，
uu)与SEQ ID NO:70所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)及编码其的多核苷酸，
vv)与SEQ ID NO:74所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的硫酸腺苷酰转移酶的亚基(CysD)及编码其的多核苷酸，
ww)与SEQ ID NO:76所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的腺苷磷硫酸还原酶(CysH)及编码其的多核苷酸，
xx)与SEQ ID NO:78所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的亚硫酸还原酶(CysI)及编码其的多核苷酸，
yy)与SEQ ID NO:80所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的NADPH依赖性谷氨酸合酶β链(CysJ)及编码其的多核苷酸，
zz)与SEQ ID NO:82所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的硫酸腺苷酰转移酶的大亚基(CysN)及编码其的多核苷酸，
aaa)与SEQ ID NO:84所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚β-合酶(CysY)及编码其的多核苷酸，
bbb)与SEQ ID NO:86所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的硫酸盐转运蛋白(CysZ)及编码其的多核苷酸，
ccc)与SEQ ID NO:88所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MetE)及编码其的多核苷酸，
ddd)与SEQ ID NO:90所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的肽基-tRNA水解酶1(PtH1)及编码其的多核苷酸，
eee)与SEQ ID NO:92所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的肽基-tRNA水解酶2(PtH2)及编码其的多核苷酸，
fff)与SEQ ID NO:202所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的二氨基庚二酸脱氢酶(Ddh，EC 1.4.1.16)及编码其的多核苷酸，
ggg)与SEQ ID NO:164所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的二氨基庚二酸脱羧酶(LysA，EC 4.1.1.20)及编码其的多核苷酸，
hhh)与SEQ ID NO:166所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸转氨酶(AaT，EC 2.6.1.1)及编码其的多核苷酸，
iii)与SEQ ID NO:168所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的L-赖氨酸输出蛋白(LysE，赖氨酸外溢通透酶)及编码其的多核苷酸，
jjj)与SEQ ID NO:170所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的二氢吡啶甲酸还原酶(DapB，EC 1.3.1.26)及编码其的多核苷酸，
kkk)与SEQ ID NO:172所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)及编码其的多核苷酸，
lll)与SEQ ID NO:186所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基(Zwf，EC 1.1.1.49)及编码其的多核苷酸，
mmm)与SEQ ID NO:188所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA亚基(OpcA，EC 1.1.1.49)及编码其的多核苷酸，
nnn)与SEQ ID NO:174所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd，EC 1.1.1.44)及编码其的多核苷酸。
本发明进一步涉及包含上述多核苷酸的载体及包含上述酶和/或多核苷酸和/或载体的重组微生物。在一优选的实施方案中，相关多肽和/或多核苷酸在这种情况中以过表达形式存在于所述微生物中。在这种情况中，重组微生物优选是棒状细菌，尤其是棒杆菌，特别是腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌。
本发明还进一步涉及过量生产L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸优选选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、谷氨酸家族的L-氨基酸、特别是L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸和L-精氨酸，及天冬氨酸家族的L-氨基酸、特别是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸和L-苏氨酸，特别优选选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸，尤其用于过量生产L-甲硫氨酸，其中至少一种、优选至少两、三、四种所述多核苷酸以过表达形式存在，其中所述方法优选在棒杆菌、特别是在腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌菌种中进行。
本发明进一步还涉及来自腐殖质还原棒杆菌的其它多核苷酸及所述多核苷酸编码的多肽。通过失活或弱化相关多核苷酸或多肽，可以正面影响某些L-氨基酸的氨基酸产量。
本发明因此还涉及选自如下的多肽：
a)与SEQ ID NO:108所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的苏氨酸合酶(ThrC，EC 4.2.3.1)及编码其的多核苷酸，
b)与SEQ ID NO:110所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的异丙基苹果酸合酶(LeuA，EC 2.3.3.13)及编码其的多核苷酸，
c)与SEQ ID NO:112所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB，EC 1.1.1.85)及编码其的多核苷酸，
d)与SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:116所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的异丙基苹果酸异构酶的亚基(LeuCD，EC 4.2.1.33)及编码其的多核苷酸，
e)与SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:200所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的琥珀酰-CoA连接酶的亚基(SucCD，EC 6.2.1.5)及编码其的多核苷酸，
f)与SEQ ID NO:2所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的HTH tetR类型DNA结合结构域(McbR)及编码其的多核苷酸，
g)与SEQ ID NO:4所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸激酶(ThrB，EC 2.7.1.39)及编码其的多核苷酸，
h)与SEQ ID NO:6所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi，EC 5.3.1.9)及编码其的多核苷酸，
i)与SEQ ID NO:8所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck，EC 4.1.1.32)及编码其的多核苷酸，
j)与SEQ ID NO:10所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的D-甲硫氨酸-结合脂蛋白(MetQ)及编码其的多核苷酸，
k)与SEQ ID NO:12所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的甲硫氨酸转运蛋白(MetP)及编码其的多核苷酸，
l)与SEQ ID NO:14所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的ATP-依赖性甲硫氨酸转运蛋白(MetN)及编码其的多核苷酸，
m)与SEQ ID NO:16所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK)及编码其的多核苷酸，
n)与SEQ ID NO:18所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的甲硫氨酸输入系统通透酶(MetI)及编码其的多核苷酸，
o)与SEQ ID NO:20所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶(DapA，EC 4.3.3.7)及编码其的多核苷酸，
p)与SEQ ID NO:24所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的羧酸盐-胺连接酶及编码其的多核苷酸，
q)与SEQ ID NO:176所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的苹果酸:醌氧化还原酶(Mqo，EC 1.1.99.16)及编码其的多核苷酸，
r)与SEQ ID NO:178所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸脱氢酶复合物的E1p亚基(AceE，EC 1.2.4.1)及编码其的多核苷酸，
s)与SEQ ID NO:180所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的柠檬酸合酶(GltA，EC 4.1.3.7)及编码其的多核苷酸，
t)与SEQ ID NO:182所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的苹果酸脱氢酶(Mdh，EC 1.1.1.37)及编码其的多核苷酸，
u)与SEQ ID NO:184所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶(MurE，EC 6.3.2.13)及编码其的多核苷酸。
本发明进一步涉及包含上述多核苷酸的载体及包含上述酶和/或多核苷酸和/或载体的重组微生物。在一优选的实施方案中，在这种情况中相关多肽和/或多核苷酸在微生物中以失活或弱化形式存在。在这种情况中重组微生物优选是棒状细菌，尤其是棒杆菌，特别是腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌种，尤其是腐殖质还原棒杆菌种。
本发明因此还涉及过量产生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸优选选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、谷氨酸家族的L-氨基酸、特别是L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸和L-精氨酸及天冬氨酸家族的L-氨基酸、特别是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸和L-苏氨酸，特别优选选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸，所述方法尤其用于过量产生L-甲硫氨酸，其中至少一种、优选两、三或四种上述多核苷酸是以失活或弱化形式存在，其中所述方法优选在棒杆菌中进行，特别是在腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌种中进行。在一优选的实施方案中，至少一种、优选至少两、三或四种上述多核苷酸在这种情况中同时以过表达形式存在。
在进一步优选的实施方案中，本发明的微生物或细菌、特别是本发明的棒杆菌、尤其是腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌、特别是L-甲硫氨酸过量产生菌株，除了本发明之外，优选过表达甘氨酸裂解系统或编码所述系统的多核苷酸，具有至少一个、优选至少两或三个、特别优选至少四个或五个如下特征：
a)弱化的多核苷酸(mcbR)，其编码HTH tetR型DNA结合结构域(McbR)，优选与SEQID NO:2所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的DNA结合结构域，
b)弱化的多核苷酸(thrB基因)，其编码高丝氨酸激酶(ThrB，EC2.7.1.39)，优选与SEQ ID NO:4所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸激酶，
c)弱化的多核苷酸(pgi)，其编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi，EC 5.3.1.9)，优选与SEQ ID NO:6所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸异构酶，
d)弱化的多核苷酸(pck)，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck，EC4.1.1.32)，优选与SEQ ID NO:8所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，
e)弱化的多核苷酸(metQ)，其编码D-甲硫氨酸-结合脂蛋白(MetQ)，优选与SEQ IDNO:10所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的D-甲硫氨酸-结合脂蛋白，
f)弱化的多核苷酸(metP)，其编码甲硫氨酸转运蛋白(MetP)，优选与SEQ ID NO:12所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的甲硫氨酸转运蛋白，
g)弱化的多核苷酸(metN)，其编码ATP-依赖性甲硫氨酸转运蛋白(MetN)，优选与SEQ ID NO:14所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的ATP-依赖性甲硫氨酸转运蛋白，
h)弱化的多核苷酸(metK)，其编码S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK)，优选与SEQ IDNO:16所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的S-腺苷甲硫氨酸合酶，
i)弱化的多核苷酸(metI)，其编码甲硫氨酸输入系统通透酶(MetI)，优选与SEQID NO:18所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的甲硫氨酸输入系统通透酶，
j)弱化的多核苷酸(dapA)，其编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶(DapA)，优选与SEQ ID NO:20所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶，
k)过表达的多核苷酸(CBS)，其编码半胱氨酸合酶(CBS)，优选与SEQ ID NO:22所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的半胱氨酸合酶，
l)弱化的多核苷酸，其编码cg3031同系物，优选与SEQ ID NO:24所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的cg3031同系物，
m)过表达的多核苷酸(aecD)，其编码胱硫醚β-裂解酶(AecD)，优选与SEQ ID NO:26所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚β-裂解酶，
n)过表达的多核苷酸(asd)，其编码天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd)，优选与SEQ IDNO:28所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸半醛脱氢酶，
o)过表达的多核苷酸(metH)，其编码5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶(MetH，EC 2.1.1.13)，
p)过表达的多核苷酸(brnE)，其编码支链氨基酸转运蛋白的较小亚基(BrnE)，优选与SEQ ID NO:30所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的亚基，
q)过表达的多核苷酸(brnF)，其编码支链氨基酸转运蛋白的较大亚基(BrnF)，优选与SEQ ID NO:32所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的亚基，
r)过表达的多核苷酸(cysE)，其编码丝氨酸乙酰转移酶(CysE)，优选与SEQ IDNO:34所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丝氨酸乙酰转移酶，
s)过表达的多核苷酸(cysK)，其编码半胱氨酸合酶(CysK)，优选与SEQ ID NO:36所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的半胱氨酸合酶，
t)过表达的多核苷酸(glyA)，其编码丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)，优选与SEQ IDNO:44所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丝氨酸羟甲基转移酶，
u)过表达的多核苷酸(hom)，其编码任选反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(Hom)，优选与SEQ ID NO:46所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸脱氢酶，
v)过表达的多核苷酸(lysC)，其编码优选反馈抗性天冬氨酸激酶(LysC)，优选与SEQ ID NO:54所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸激酶，
w)过表达的多核苷酸(metB)，其编码胱硫醚γ-合酶(MetB)，优选与SEQ ID NO:56所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚γ-合酶，
x)过表达的多核苷酸(metF)，其编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)，优选与SEQ ID NO:58所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，
y)过表达的多核苷酸(metX)，其编码高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)，优选与SEQID NO:60所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸O-乙酰转移酶，
z)过表达的多核苷酸(metY)，其编码O-乙酰高丝氨酸裂解酶(MetY)，优选与SEQID NO:62所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的O-乙酰高丝氨酸裂解酶，
aa)过表达的多核苷酸(pyc)，其编码丙酮酸羧化酶(Pyc)，优选与SEQ ID NO:64所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸羧化酶，
bb)过表达的多核苷酸(serA)，其编码任选反馈抗性D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)，优选与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，
cc)过表达的多核苷酸(serB)，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)，优选与SEQ IDNO:68所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸丝氨酸磷酸酶，
dd)过表达的多核苷酸(serC)，其编码磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)，优选与SEQ IDNO:70所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的磷酸丝氨酸转氨酶，
ee)过表达的多核苷酸(ald)，其编码丙氨酸脱氢酶(Ald)，优选与SEQ ID NO:72所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的丙氨酸脱氢酶，
ff)过表达的多核苷酸(cysD)，其编码硫酸腺苷酰转移酶的亚基(CysD)，优选与SEQ ID NO:74所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的亚基，
gg)过表达的多核苷酸(cysH)，其编码腺苷磷硫酸还原酶(CysH)，优选与SEQ IDNO:76所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的腺苷磷硫酸还原酶，
hh)过表达的多核苷酸(cysI)，其编码亚硫酸还原酶(CysI)，优选与SEQ ID NO:78所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的亚硫酸还原酶，
ii)过表达的多核苷酸(cysJ)，其编码(CysJ)，优选与SEQ ID NO:80所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的，
jj)过表达的多核苷酸(cysN)，其编码硫酸腺苷酰转移酶的亚基(CysD)，优选与SEQ ID NO:82所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的亚基，
kk)过表达的多核苷酸(cysY)，其编码胱硫醚β-合酶(CysY)，优选与SEQ ID NO:84所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚β-合酶，
ll)过表达的多核苷酸(cysZ)，其编码推定的硫酸盐转运蛋白(CysZ)，优选与SEQID NO:86所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的硫酸盐转运蛋白，
mm)过表达的多核苷酸(metE)，其编码5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MetE)，优选与SEQ ID NO:88所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的蛋白质，
nn)过表达的多核苷酸(ptH1)，其编码肽基-tRNA水解酶1(PtH1)，优选与SEQ IDNO:90所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的肽基-tRNA水解酶1，
oo)过表达的多核苷酸(ptH2)，其编码肽基-tRNA水解酶2(PtH2)，优选与SEQ IDNO:92所示序列具有至少90％、95％或98％、优选100％序列相同性的肽基-tRNA水解酶2。
本发明进一步还涉及过量生产L-氨基酸、特别是L-甲硫氨酸的一种相应方法，其中使用这种微生物或这种细菌。
在本发明进一步优选的实施方案中，本发明的微生物或细菌、特别是本发明的棒杆菌、尤其是本发明的腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌菌种、特别是本发明过量产生L-缬氨酸的菌株，除了本发明之外，优选过表达的甘氨酸裂解系统或编码所述系统的多核苷酸，具有至少一个、优选至少2或3个、特别优选至少4或5个如下特征：
a)过表达的多核苷酸(ilvA基因)，其编码苏氨酸脱水酶(IIvA EC 4.3.1.19)，优选与SEQ ID NO:106所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的苏氨酸脱水酶，
b)过表达的多核苷酸(ilvB基因)，其编码乙酸乳酸合酶的亚基(IlvB)，优选与SEQID NO:98所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的乙酸乳酸合酶亚基，
c)过表达的多核苷酸(ilvN基因)，其编码任选反馈抗性乙酸乳酸合酶的亚基(IlvN)，
d)过表达的多核苷酸(ilvC基因)，其编码异构体还原酶(IlvC，EC 1.1.1.86)，优选与SEQ ID NO:100所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的异构体还原酶，
e)过表达的多核苷酸(ilvD基因)，其编码二羟酸脱水酶(IIvD，EC 4.2.1.9)，优选与SEQ ID NO:102所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的二羟酸脱水酶，
f)过表达的多核苷酸(ilvE基因)，其编码转氨酶(IIvE，EC 2.6.1.42)，优选与SEQID NO:104所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的转氨酶，
g)过表达的多核苷酸(ilvH基因)，其编码乙酸乳酸合酶(IIvH，EC 2.2.1.6)，优选与SEQ ID NO:122所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的乙酸乳酸合酶，
h)弱化的多核苷酸(thrB基因)，其编码高丝氨酸激酶(ThrB，EC 2.7.1.39)，优选与SEQ ID NO:4所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸激酶，
i)弱化的多核苷酸(thrC基因)，其编码苏氨酸合酶(ThrC，EC 4.2.3.1)，优选与SEQ ID NO:108所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的苏氨酸合酶，
j)过表达的多核苷酸(hom基因)，其编码任选反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(Hom，EC1.2.1.11)，优选与SEQ ID NO:46所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸脱氢酶，
k)弱化的多核苷酸(leuA基因)，其编码任选反馈抗性异丙基苹果酸合酶(LeuA，EC2.3.3.13)，优选与SEQ ID NO:110所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的异丙基苹果酸合酶，
l)弱化的多核苷酸(leuB基因)，其编码异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB，EC1.1.1.85)，优选与SEQ ID NO:112所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的异丙基苹果酸脱氢酶，
m)弱化的多核苷酸(leuCD基因)，其编码异丙基苹果酸异构酶的亚基(LeuCD，EC4.2.1.33)，优选与SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:116所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的异丙基苹果酸异构酶，
n)过表达的多核苷酸(panB基因)，其编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(PanB，EC 2.1.2.11)，优选与SEQ ID NO:118所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶，
o)过表达的多核苷酸(panC基因)，其编码泛酸合酶(PanC，EC 6.3.2.1)，优选与SEQ ID NO:120所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的泛酸合酶。
本发明因此进一步涉及一种过量产生L-氨基酸、特别是L-缬氨酸的方法，其中使用这种微生物或这种细菌。
在本发明进一步的实施方案中，本发明的微生物或细菌、特别是本发明的棒杆菌、尤其是本发明的腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌、特别是本发明的L-谷氨酸过量产生菌株，除了发明之外，优选过表达的甘氨酸裂解系统或编码所述系统的多核苷酸，具有至少一个、优选至少两个或三个、特别优选至少四个或五个如下特征：
a)过表达的多核苷酸(gdh)，其编码谷氨酸脱氢酶(Gdh)，优选与SEQ ID NO:124所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的谷氨酸脱氢酶，
b)过表达的多核苷酸，其编码谷氨酰胺合成酶(谷氨酰胺合成酶1)，优选与SEQ IDNO:126所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的谷氨酰胺合成酶，
c)过表达的多核苷酸，其编码谷氨酰胺合成酶(谷氨酰胺合成酶2)，优选与SEQ IDNO:128所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的谷氨酰胺合成酶，
d)过表达的多核苷酸，其编码谷氨酸合酶，优选与SEQ ID NO:130所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的谷氨酸合酶，
e)过表达的多核苷酸，其编码异柠檬酸脱氢酶，优选与SEQ ID NO:132所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的异柠檬酸脱氢酶，
f)过表达的多核苷酸，其编码乌头酸水化酶，优选与SEQ ID NO:134所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的乌头酸水化酶，
g)过表达的多核苷酸，其编码柠檬酸合酶，优选与SEQ ID NO:136所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的柠檬酸合酶，
h)过表达的多核苷酸(pepC)，其编码氨基肽酶C(PepC)，优选与SEQ ID NO:138所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的氨基肽酶C，
i)过表达的多核苷酸，其编码丙酮酸脱氢酶，优选与SEQ ID NO:140所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸脱氢酶，
j)过表达的多核苷酸，其编码丙酮酸激酶(丙酮酸激酶1)，优选与SEQ ID NO:142所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸激酶，
k)过表达的多核苷酸，其编码丙酮酸激酶(丙酮酸激酶2)，优选与SEQ ID NO:144所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸激酶，
l)过表达的多核苷酸，其编码烯醇化酶，优选与SEQ ID NO:146所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的烯醇化酶，
m)过表达的多核苷酸(gpmA)，其编码2,3-二磷酸甘油酸-依赖性磷酸甘油酸变位酶(GpmA)，优选与SEQ ID NO:148所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸甘油酸变位酶，
n)过表达的多核苷酸(pgk)，其编码磷酸甘油酸激酶(Pgk)，优选与SEQ ID NO:150所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸甘油酸激酶，
o)过表达的多核苷酸，其编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(甘油-3-磷酸脱氢酶1)，优选与SEQ ID NO:152所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，
p)过表达的多核苷酸，其编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(甘油-3-磷酸脱氢酶2)，优选与SEQ ID NO:154所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，
q)过表达的多核苷酸(tpiA)，其编码磷酸丙糖异构酶(TpiA)，优选与SEQ ID NO:156所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸丙糖异构酶，
r)过表达的多核苷酸，其编码果糖二磷酸醛缩酶，优选与SEQ ID NO:158所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的果糖二磷酸醛缩酶，
s)过表达的多核苷酸，其编码1-磷酸果糖激酶，优选与SEQ ID NO:160所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的1-磷酸果糖激酶，
t)过表达的多核苷酸，其编码6-磷酸果糖激酶，优选与SEQ ID NO:162所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的6-磷酸果糖激酶，
u)过表达的多核苷酸(pgi)，其编码葡萄糖-6-磷酸异构酶，优选与SEQ ID NO:6所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸异构酶，
v)弱化的多核苷酸(sucCD)，其编码琥珀酰-CoA连接酶的亚基(SucCD，EC6.2.1.5)，优选与SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:200所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的琥珀酰-CoA连接酶的亚基。
本发明进一步涉及一种过量产生L-氨基酸、特别是L-谷氨酸的方法，其中使用这种微生物或这种细菌。
在本发明的进一步优选的实施方案中，本发明的微生物或细菌、特别是本发明的棒杆菌、尤其是本发明的腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌菌种、特别是过量产生L-丙氨酸的菌株，除了发明之外，优选过表达的甘氨酸裂解系统或者编码所述系统的多核苷酸，具有至少一个、优选至少两个或三个、特别优选至少四个或五个如下特征：
a)过表达的多核苷酸(alaD)，其编码丙氨酸脱氢酶(AlaD)，优选来自棒杆菌的丙氨酸脱氢酶，
b)过表达的多核苷酸(gapA)，其编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)，优选来自棒杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，
c)失活的或弱化的多核苷酸(IdhA)，其编码L-乳酸脱氢酶(LdhA)，优选来自棒杆菌的L-乳酸脱氢酶，
d)失活的或弱化的多核苷酸(ppc)，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)，优选来自棒杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，
e)失活的或弱化的多核苷酸(alr)，其编码丙氨酸消旋酶(Alr)，优选来自棒杆菌的丙氨酸消旋酶。
本发明进一步涉及一种过量产生L-氨基酸、特别是L-丙氨酸的方法，其中使用这种微生物或这种细菌。
在本发明进一步优选的实施方案中，本发明的微生物或细菌、特别是本发明的棒杆菌、尤其是本发明的腐殖质还原棒杆菌或谷氨酸棒杆菌菌种、特别是本发明的过量产生L-赖氨酸的菌株，除了发明之外，优选过表达的甘氨酸裂解系统或编码所述系统的多核苷酸，具有至少一个、优选至少2或3个、特别优选至少4或5个如下特征：
a)过表达的多核苷酸(dapA基因)，其编码二氢二吡啶甲酸合酶(DapA，EC4.2.1.52)，优选与SEQ ID NO:20所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的二氢二吡啶甲酸合酶，
b)过表达的多核苷酸(lysC)，其编码优选反馈抗性天冬氨酸激酶(LysC，EC2.7.2.4)，优选与SEQ ID NO:54所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸激酶，
c)过表达的多核苷酸(ddh)，其编码二氨基庚二酸脱氢酶(Ddh，EC 1.4.1.16)，优选与SEQ ID NO:202所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的二氨基庚二酸脱氢酶，
d)过表达的多核苷酸(asd基因)，其编码天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd，EC1.2.1.11)，优选与SEQ ID NO:28所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸半醛脱氢酶，
e)过表达的多核苷酸(lysA基因)，其编码二氨基庚二酸脱羧酶(LysA，EC4.1.1.20)，优选与SEQ ID NO:164所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的二氨基庚二酸脱羧酶，
f)过表达的多核苷酸(aat基因)，其编码天冬氨酸转氨酶(AaT，EC 2.6.1.1)，优选与SEQ ID NO:166所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸转氨酶，
g)过表达的多核苷酸(lysE基因)，其编码L-赖氨酸输出蛋白(LysE,赖氨酸外溢通透酶)，优选与SEQ ID NO:168所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的L-赖氨酸输出蛋白，
h)过表达的多核苷酸(pyc基因)，其编码丙酮酸羧化酶(Pyc，EC 6.4.1.1)，优选与SEQ ID NO:64所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸羧化酶，
i)过表达的多核苷酸(dapF基因)，其编码二氨基庚二酸差向异构酶(DapF，EC5.1.1.7)，
j)过表达的多核苷酸(dapB基因)，其编码二氢吡啶甲酸还原酶(DapB，EC1.3.1.26)，优选与SEQ ID NO:172所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的二氢吡啶甲酸还原酶，
k)过表达的多核苷酸，其编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)，优选与SEQID NO:174所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，
l)过表达的多核苷酸(zwf基因)，其编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基(Zwf，EC1.1.1.49)，优选与SEQ ID NO:188所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的Zwf亚基，
m)过表达的多核苷酸(opcA基因)，其编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA亚基(OpcA，EC 1.1.1.49)，优选与SEQ ID NO:190所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的OpcA亚基，
n)过表达的多核苷酸(gnd基因)，其编码磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd，EC 1.1.1.44)，优选与SEQ ID NO:176所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸葡糖酸脱氢酶，
o)失活的或弱化的多核苷酸(mqo)，其编码苹果酸:醌氧化还原酶(Mqo，EC1.1.99.16)，优选与SEQ ID NO:178所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的苹果酸:醌氧化还原酶，
p)失活的或弱化的多核苷酸(aceE)，其编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1p亚基(AceE，EC 1.2.4.1)，优选与SEQ ID NO:180所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的E1p亚基，
q)失活的或弱化的多核苷酸(gltA)，其编码柠檬酸合酶(GltA，EC 4.1.3.7)，优选与SEQ ID NO:182所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的柠檬酸合酶，
r)失活的或弱化的多核苷酸(mdh)，其编码苹果酸脱氢酶(Mdh，EC 1.1.1.37)，优选与SEQ ID NO:184所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的苹果酸脱氢酶，
s)失活的或弱化的多核苷酸(murE)，其编码UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶(MurE，EC 6.3.2.13)，优选与SEQ ID NO:186所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的酶。
本发明进一步涉及一种过量生产L-氨基酸、特别是L-赖氨酸的方法，其中使用这种微生物或这种细菌。
上述本发明方法中使用或待使用的多核苷酸或多肽优选源自棒杆菌，特别源自谷氨酸棒杆菌或腐殖质还原棒杆菌，特别优选源自腐殖质还原棒杆菌。
“过表达”通常被理解为是指微生物中由相应DNA编码的核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性与起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株比增加。起始菌株(亲本菌株)是指对其进行导致过表达措施的菌株。
浓度或活性的增加可以例如通过使相应编码多核苷酸的在染色体或染色体外的拷贝数增加至少一个拷贝而实现。
一种广泛使用的增加拷贝数的方法包括在载体、优选质粒中掺入相应的编码多核苷酸，其从微生物、特别是棒状细菌中复制。此外，转座子、插入元件(IS元件)或噬菌体可用作载体。大量合适的载体在现有技术领域中描述。
另一广泛使用的实现过表达的方法是染色体基因扩增方法。在这种方法中，将感兴趣的多核苷酸的至少一个另外的拷贝插入棒状细菌的染色体中。这种扩增方法在例如WO03/014330或WO 03/040373中描述。
另一种实现过表达的方法包括将相应基因或等位基因与启动子或表达盒以功能性方式连接(可操纵地连接)。谷氨酸棒杆菌的合适启动子在例如Patek et al.(Journalof Biotechnology 104(1-3),311-323(2003))的图1及在如Handbook ofCorynebacterium glutamicum(Eds.:Lothar Eggeling and Michael Bott,CRC Press,Boca Raton,US(2005))或者Corynebacteria,Genomics and Molecular Biology(Ed.:Andreas Burkovski,Caister Academic Press,Norfolk,UK(2008))等综述中描述。同样，可以使用dapA启动子的变体，启动子A25，其在例如Vasicova et al(Journal ofBacteriology 181,6188-6191(1999))中描述。此外，可以使用谷氨酸棒杆菌的gap启动子(EP 06007373)。最后，可以使用由Amann et al.(Gene 69(2),301-315(1988))和Amannand Brosius(Gene 40(2-3),183-190(1985))描述的熟知的启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc。这种启动子可以插入在例如相关基因的上游，典型距离起始密码子大约1-500个核酸碱基。
过表达措施使得相应多肽的活性或浓度基于在导致过表达的措施之前的菌株中所述多肽的活性或浓度增加优选至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，优选至多1000％或2000％。
蛋白质的浓度可以通过一维或二维蛋白质凝胶分级分离及随后通过合适的评估软件经光学鉴别凝胶中的蛋白质浓度而确定。制备棒状细菌的蛋白质凝胶及鉴别所述蛋白质的常用方法是由Hermann et al.(Electrophoresis,22:1712-23(2001))所述的方法。蛋白质浓度可同样通过Western印迹杂交确定，使用特异于被检测的蛋白质的抗体(Sambrooket al.,Molecular Cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)及随后使用相应软件进行光学评估以确定浓度(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,AngewandteChemie 38:2630-2647(1999))。活性通过合适的酶测定进行确定。
根据本发明，“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性与起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株相比降低。起始菌株(亲本菌株)是指对其进行弱化措施的菌株。
弱化可以通过降低多肽的表达而实现，例如使用弱启动子或者使用编码具有较低活性的多肽的等位基因及任选组合这些措施。弱化也可以通过例如失活编码基因而完全阻止多肽的表达而实现。
弱化措施使得相应多肽的活性或浓度基于所述多肽在弱化措施实施之前的菌株中的活性或浓度降低至少10％、25％、50％或75％，至多100％。在一优选的实施方案中，弱化包括完全失活相关多肽的表达。
与氨基酸生产相关的反馈抗性酶通常被理解为是指与野生形式相比，对于产生的L-氨基酸和/或其类似物的抑制作用具有较低敏感性。
特别地，反馈抗性天冬氨酸激酶(LysCFBR)是指这样的天冬氨酸激酶，其与野生形式相比，对于赖氨酸与苏氨酸的混合物或者AEC(氨基乙基半胱氨酸)与苏氨酸的混合物或者单独的赖氨酸或者单独的AEC的抑制作用示出较低敏感性。对于赖氨酸生产，优选使用包含这种反馈抗性或脱敏的天冬氨酸激酶的相应菌株。
例如，从文献中已知下述来自谷氨酸棒杆菌的反馈抗性天冬氨酸激酶：A279T、A279V、S301F、S301Y、T308I、T311I、R320G、G345D、S381F。对于来自谷氨酸棒杆菌的反馈抗性天冬氨酸激酶，还可以参考下述出版物：JP1993184366-A，JP1994062866-A，JP1994261766-A，JP1997070291-A，JP1997322774-A，JP1998165180-A，JP1998215883-A，US5688671-A，EP0387527，WO00/63388，US3732144，JP6261766，Jetten et al.(1995；Applied Microbiology Biotechnology 43:76-82)。来自谷氨酸棒杆菌的反馈抗性天冬氨酸激酶保藏在NCBI GenBank，登记号如下：E05108，E06825，E06826，E06827，E08177，E08178，E08179，E08180，E08181，E08182，E12770，E14514，E16352，E16745，E16746，I74588，I74589，I74590，I74591，I74592，I74593，I74594，I74595，I74596，I74597，X57226，L16848，L27125。
优选使用如下的来自本发明的腐殖质还原棒杆菌的反馈抗性天冬氨酸激酶：D274Y，A279E，S301Y，T308I，T311I，G359D。
对于苏氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(HomFBR)的菌株。
对于异亮氨酸生产和缬氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性乙酰乳酸合酶的菌株。
对于亮氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性异丙基苹果酸合酶(LeuAFBR)的菌株。
对于脯氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性谷氨酸-5-激酶(ProBFBR)的菌株。
对于精氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgFFBR)的菌株。
对于丝氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerAFBR)的菌株。
对于甲硫氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerAFBR)和/或反馈抗性丙酮酸羧化酶(PycFBR)的菌株。
对于色氨酸生产，同样优选使用包含相应反馈抗性磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(AroGFBR或AroHFBR)的菌株。
关于本发明中使用的过量产生L-氨基酸的腐殖质还原棒杆菌菌株的进一步更优选的性质，参见上述Wu et al.(2011)的出版物及上述其它出版物。
本发明的微生物、特别是棒杆菌属细菌，可以连续培养，如WO 05/021772所述，或者分批不连续培养(分批培养或分批方法)或者补料分批或重复补料分批培养，以产生L-赖氨酸。关于已知培养方法的综述可见于Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1.Introduction toBioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或者Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and PeripheralDevices](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))。
使用的培养培养基或发酵培养基应以合适方式满足特定菌株的需要。关于不同微生物的培养培养基的描述见于美国细菌学会的"Manual of Methods for GeneralBacteriology"(Washington D.C.,USA,1981)。术语培养培养基和发酵培养基或培养基可互换使用。
使用的碳源可以是糖和碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，来自甜菜或甘蔗生产的含有蔗糖的溶液，淀粉，淀粉水解物和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油、甲醇和乙醇，及有机酸如乙酸或乳酸。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母膏，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
使用的磷源可以是磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。
培养基另外还必须含有为生长所需的盐，例如金属如钠、钾、镁、钙和铁的盐酸盐或硫酸盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸，例如高丝氨酸，及维生素，例如硫胺素、生物素或泛酸。
上述进料原料可以单一混合物形式加入培养物中，或者在培养期间以合适方式进料。
可以以适当方式采用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸控制培养物的pH值。pH通常调节为6.0-9.0，优选6.5-8。为了控制泡沫产生，可以使用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以在培养基中加入适当的选择性物质例如抗生素。为了保持有氧条件，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中。也可以使用富集过氧化氢的液体。如果合适，发酵是在升高的压力下进行，例如在0.03-0.2MPa压力下。培养温度通常在20℃-45℃，优选25℃-40℃。在分批方法中，持续培养直至希望的L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10-160小时范围内达到。在连续方法中，可以进行更长时间培养。细菌的活性导致在发酵培养基和/或细菌细胞中L-氨基酸的浓缩(积聚)。
合适的发酵培养基的实例见于专利说明书5,770,409、US 5,840,551和US 5,990,350或US 5,275,940。
在发酵期间确定一或多次浓度的L-氨基酸分析可以通过离子交换层析、优选阳离子交换层析分离L-氨基酸及随后使用茚三酮柱后衍生化而进行，如Spackman et al.(Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))所述。也可以应用邻苯二醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换层析的综述文章可见Pickering(LC·GC(Magazine ofChromatographic Science)7(6),484-487(1989))。
同样可以进行柱前衍生化，例如使用邻苯二醛或异硫氰酸苯酯，及通过反相层析(RP)、优选以高效液相层析(HPLC)形式分级分离获得的氨基酸衍生物。这种类型的方法在例如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))中描述。
利用光度测定法(吸收、荧光)进行检测。
关于氨基酸分析的综述可见于"Bioanalytik"，Lottspeich and Zorbas(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)。
因此，本发明还涉及一种生产L-氨基酸的方法，特征在于进行如下步骤：
a)在合适的营养培养基中发酵本发明的微生物，特别是棒状细菌，优选棒杆菌属细菌，特别优选谷氨酸棒杆菌或腐殖质还原棒杆菌菌种，及
b)在上述营养培养基和/或细菌细胞中积聚L-氨基酸。
然后提供或生产或回收液体或固体形式的含有L-氨基酸的产物。
发酵措施获得含有相关L-氨基酸的发酵液。
发酵液是指其中微生物已经在一定温度培养一定时间的发酵培养基或营养培养基。发酵培养基或在发酵期间使用的培养基包含保证微生物增殖和希望的L-氨基酸形成的所有物质或成分。
当发酵完成时，获得的发酵液因此包含：
a)微生物的生物量(细胞团)，所述生物量是由于所述微生物细胞的增殖而产生的，
b)在发酵期间形成的L-氨基酸，
c)在发酵期间形成的有机副产物，及
d)在发酵中未被消耗的所采用的发酵培养基或者起始材料的组成成分，例如维生素如生物素或者盐如硫酸镁。
有机副产物包括由发酵中使用的微生物产生的除了希望的L-氨基酸之外的物质，任选是分泌的。这些也包括糖，例如海藻糖。
适当时，将发酵液从培养瓶或发酵罐中取出收集，并用于提供液体或固体形式的含有L-氨基酸的产物。文中表述用语“回收含有L-氨基酸的产物”也是同样含义。在最简单的情况中，含有L-氨基酸的发酵液自身组成了回收产物。
从发酵液进行一或多项选自如下的措施实现L-氨基酸的浓缩或纯化：
a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)除去水，
b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)除去生物量，生物量任选在除去前被失活，
c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)除去在发酵期间形成的有机副产物，及
d)部分(>0％)至完全(100％)或基本完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)除去在发酵中未被消耗的所采用的发酵培养基或起始材料的组成成分。
以此方式分离具有希望L-氨基酸含量的产物。
部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本完全(≥80％至<100％)除去水(措施a)也称作干燥。
完全或基本完全除去水、生物量、有机副产物及未消耗的所采用的发酵培养基组成成分获得纯的(≥80％重量、≥90％重量)或高纯度(≥95％重量、≥97％重量、≥99％重量)的L-氨基酸产物形式。现有技术领域可获得大量关于措施a)、b)、c)和d)的技术指导。
实施例
实施例1:腐殖质还原棒杆菌生产丙氨酸和缬氨酸
为评估丙氨酸和缬氨酸生产，将菌株腐殖质还原棒杆菌(DSM 45392)在摇瓶中培养。为此目的，将腐殖质还原棒杆菌菌株在10ml BHI液体培养基(Brain Heart Infusion；Merck)(37g/l H2O)中以200rpm在37℃培养24小时作为预培养物。然后将10ml摇瓶培养基接种至OD660为0.2，并以200rpm在37℃培养48小时。为制备所述培养基，将20g硫酸铵、0.4gMgSO4*7H2O、0.6g KH2PO4和10g酵母膏溶解在750ml水中。用20％NH4OH将所述溶液的pH调节至7.8，然后溶液高压灭菌。然后加入4ml维生素溶液(用NH4OH调节至pH7)，所述维生素溶液由0.25g/l硫胺素、50mg/l氰钴胺、25mg/l生物素和1.25g/l维生素B6组成。另外，加入140ml过滤灭菌的50％葡萄糖溶液和50g干燥高压灭菌的CaCO3，随后将培养基配制成1升。
培养后，经HPLC分析每种情况下的4个平行培养物的上清，以确定丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸含量，检测限度为≥0.01g/l。
腐殖质还原棒杆菌在摇瓶规模于摇瓶培养基中以200rpm在37℃培养48小时后产生大约0.81g/l丙氨酸(净产率：0.011g丙氨酸/g葡萄糖)和1.6g/l缬氨酸(净产率:0.022g缬氨酸/g葡萄糖)(表1)。甘氨酸仅作为副产物少量产生。
表1:来自使用腐殖质还原棒杆菌菌株的摇瓶实验的分析数据。示出用细胞培养和用空白培养基培养后测定的数值。
丙氨酸(g/l) 缬氨酸(g/l)
腐殖质还原棒杆菌 1.27 1.9
无细胞的空白培养基 0.46 0.3
实施例3:谷氨酸表现测定
为进行L-谷氨酸表现测定，在摇瓶中培养腐殖质还原棒杆菌菌株(DSM45392)。为此目的，将腐殖质还原棒杆菌菌株在10ml BHI液体培养基(Brain Heart Infusion；Merck)(37g/l H2O)中以200rpm在37℃培养24小时作为预培养物。然后将10ml摇瓶培养基接种至OD660为0.2，并以200rpm在37℃培养48小时。为制备所述培养基，将20g硫酸铵、0.4g MgSO4*7H2O、0.6g KH2PO4和10g酵母膏溶解在750ml水中。用20％NH4OH将所述溶液的pH调节至7.8，然后溶液高压灭菌。然后加入4ml维生素溶液(用NH4OH调节至pH7)，所述维生素溶液由0.25g/l硫胺素、50mg/l氰钴胺、25mg/l生物素和1.25g/l维生素B6组成。另外，加入140ml过滤灭菌的50％葡萄糖溶液和50g干燥高压灭菌的CaCO3。然后加入5ml 400mM过滤灭菌的苏氨酸原液，随后将培养基配制成1升。
培养后，经HPLC分析每种情况下的4个平行培养物的上清，以确定谷氨酸含量，检测限度为≥0.01g/l。
腐殖质还原棒杆菌菌株在摇瓶规模于摇瓶培养基中以200rpm在37℃培养48小时后产生大约1.8(+/-0.6)g/l的L-谷氨酸。培养基中的L-谷氨酸初始浓度是0.78(+/-0.1)g/l。甘氨酸仅作为副产物少量产生。

Claims (15)

1.包含酶GcvP、GcvT和GcvH的甘氨酸裂解系统，特征在于所述系统包含如下至少一种多肽：
a)酶GcvP，其与SEQ ID NO:40所示序列具有至少80％序列相同性，
b)酶GcvT，其与SEQ ID NO:42所示序列具有至少80％序列相同性，
c)酶GcvH，其与SEQ ID NO:38所示序列具有至少80％序列相同性。
2.权利要求1的甘氨酸裂解系统，特征在于所述系统包含上述两种、优选全部三种多肽。
3.权利要求2的甘氨酸裂解系统，特征在于所述系统包含如下多肽：
a)酶GcvP，其与SEQ ID NO:40所示序列具有至少95或98％序列相同性，
b)酶GcvT，其与SEQ ID NO:42所示序列具有至少95或98％序列相同性，
c)酶GcvH，其与SEQ ID NO:38所示序列具有至少95或98％序列相同性。
4.前述任何权利要求的甘氨酸裂解系统，特征在于所述系统包含选自如下的至少一种进一步的多肽：
a)酶LipA，其与SEQ ID NO:48所示序列具有至少80％序列相同性，
b)酶LipB，其与SEQ ID NO:50所示序列具有至少80％序列相同性，
c)酶Lpd，其与SEQ ID NO:52所示序列具有至少80％序列相同性，
d)酶LplA，其与SEQ ID NO:94所示序列具有至少80％序列相同性，
e)酶GcvL，其与SEQ ID NO:96所示序列具有至少80％序列相同性。
5.多肽，其组成甘氨酸裂解系统的酶，选自如下一组：
a)酶GcvP，其与SEQ ID NO:40所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
b)酶GcvT，其与SEQ ID NO:42所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
c)酶GcvH，其与SEQ ID NO:38所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性，
d)酶LipA，优选与SEQ ID NO:48所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LipA，
e)酶LipB，优选与SEQ ID NO:50所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LipB，
f)酶Lpd，优选与SEQ ID NO:52所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶Lpd，
g)酶LplA，优选与SEQ ID NO:94所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶LplA，
h)酶GcvL，优选与SEQ ID NO:96所示序列具有至少80％、优选至少85或90％、特别至少92、94、96或98％、尤其是100％序列相同性的酶GcvL。
6.编码甘氨酸裂解系统的酶的多核苷酸，其选自如下一组：
a)多核苷酸(gcvP)，其编码酶GcvP及与SEQ ID NO:39位置301-3162所示序列具有至少70或75％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:39位置301-3162所示序列互补的多核苷酸杂交；
b)多核苷酸(gcvT)，其编码酶GcvT及与SEQ ID NO:41位置301-1404所示序列具有至少70或75％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:41位置301-1404所示序列互补的多核苷酸杂交；
c)多核苷酸(gcvH)，其编码酶GcvH及与SEQ ID NO:37位置301-699所示序列具有至少70或75％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:37位置301-699所示序列互补的多核苷酸杂交；
d)多核苷酸(lipA)，其编码酶LipA及与SEQ ID NO:47位置301-1344所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:47位置301-1344所示序列互补的多核苷酸杂交；
e)多核苷酸(lipB)，其编码酶LipB及与SEQ ID NO:49位置301-1089所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:49位置301-1089所示序列互补的多核苷酸杂交；
f)多核苷酸(lpd)，其编码酶Lpd及与SEQ ID NO:51位置301-1710所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:51位置301-1710所示序列互补的多核苷酸杂交；
g)多核苷酸(lplA)，其编码酶LplA及与SEQ ID NO:93位置301-1089所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:93位置301-1089所示序列互补的多核苷酸杂交；
h)多核苷酸(gcvL)，其编码酶GcvL及与SEQ ID NO:95位置301-1710所示序列具有至少70％、优选至少80或85％、特别是至少90或95％、尤其是至少98或100％序列相同性和/或在严格条件下与序列与SEQ ID NO:95位置301-1710所示序列互补的多核苷酸杂交。
7.载体，特征在于所述载体包含权利要求6的至少一种多核苷酸，优选至少两种或三种多核苷酸。
8.重组微生物，特征在于所述微生物包含权利要求1-4任一项的至少一种甘氨酸裂解系统和/或编码这种甘氨酸裂解系统的多核苷酸和/或权利要求5的至少一种多肽和/或编码这种多肽的多核苷酸或编码多个这种多肽的多个多核苷酸和/或权利要求6的至少一种多核苷酸和/或权利要求7的载体。
9.权利要求8的重组微生物，特征在于甘氨酸裂解系统和/或编码这种系统的多核苷酸以过表达形式存在。
10.权利要求8或9的重组微生物，特征在于所述微生物是L-甲硫氨酸过量生产菌株，其具有至少一个、优选至少两个或三个、特别优选至少四个或五个如下特征：
a)弱化的多核苷酸(mcbR)，其编码HTH tetR型DNA结合结构域(McbR)，优选与SEQ IDNO:2所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的DNA结合结构域，
b)弱化的多核苷酸(thrB基因)，其编码高丝氨酸激酶(ThrB，EC 2.7.1.39)，优选与SEQID NO:4所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸激酶，
c)弱化的多核苷酸(pgi)，其编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi，EC 5.3.1.9)，优选与SEQID NO:6所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的葡萄糖-6-磷酸异构酶，
d)弱化的多核苷酸(pck)，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck，EC 4.1.1.32)，优选与SEQ ID NO:8所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，
e)弱化的多核苷酸(metQ)，其编码D-甲硫氨酸-结合脂蛋白(MetQ)，优选与SEQ ID NO:10所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的D-甲硫氨酸-结合脂蛋白，
f)弱化的多核苷酸(metP)，其编码甲硫氨酸转运蛋白(MetP)，优选与SEQ ID NO:12所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的甲硫氨酸转运蛋白，
g)弱化的多核苷酸(metN)，其编码ATP-依赖性甲硫氨酸转运蛋白(MetN)，优选与SEQID NO:14所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的ATP-依赖性甲硫氨酸转运蛋白，
h)弱化的多核苷酸(metK)，其编码S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK)，优选与SEQ ID NO:16所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的S-腺苷甲硫氨酸合酶，
i)弱化的多核苷酸(metI)，其编码甲硫氨酸输入系统通透酶(MetI)，优选与SEQ IDNO:18所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的甲硫氨酸输入系统通透酶，
j)弱化的多核苷酸(dapA)，其编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶(DapA)，优选与SEQ IDNO:20所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶，
k)过表达的多核苷酸(CBS)，其编码半胱氨酸合酶(CBS)，优选与SEQ ID NO:22所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的半胱氨酸合酶，
l)弱化的多核苷酸，其编码cg3031同系物，优选与SEQ ID NO:24所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的cg3031同系物，
m)过表达的多核苷酸(aecD)，其编码胱硫醚β-裂解酶(AecD)，优选与SEQ ID NO:26所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚β-裂解酶，
n)过表达的多核苷酸(asd)，其编码天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd)，优选与SEQ ID NO:28所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸半醛脱氢酶，
o)过表达的多核苷酸(metH)，其编码5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶(MetH，EC2.1.1.13),
p)过表达的多核苷酸(brnE)，其编码支链氨基酸转运蛋白的较小亚基(BrnE)，优选与SEQ ID NO:30所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的亚基，
q)过表达的多核苷酸(brnF)，其编码支链氨基酸转运蛋白的较大亚基(BrnF)，优选与SEQ ID NO:32所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的亚基，
r)过表达的多核苷酸(cysE)，其编码丝氨酸乙酰转移酶(CysE)，优选与SEQ ID NO:34所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丝氨酸乙酰转移酶，
s)过表达的多核苷酸(cysK)，其编码半胱氨酸合酶(CysK)，优选与SEQ ID NO:36所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的半胱氨酸合酶，
t)过表达的多核苷酸(glyA)，其编码丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)，优选与SEQ ID NO:44所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丝氨酸羟甲基转移酶，
u)过表达的多核苷酸(hom)，其编码任选反馈抗性高丝氨酸脱氢酶(Hom)，优选与SEQID NO:46所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸脱氢酶，
v)过表达的多核苷酸(lysC)，其编码任选反馈抗性天冬氨酸激酶(LysC)，优选与SEQID NO:54所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的天冬氨酸激酶，
w)过表达的多核苷酸(metB)，其编码胱硫醚γ-合酶(MetB)，优选与SEQ ID NO:56所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚γ-合酶，
x)过表达的多核苷酸(metF)，其编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)，优选与SEQID NO:58所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，
y)过表达的多核苷酸(metX)，其编码高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)，优选与SEQ IDNO:60所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的高丝氨酸O-乙酰转移酶，
z)过表达的多核苷酸(metY)，其编码O-乙酰高丝氨酸裂解酶(MetY)，优选与SEQ IDNO:62所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的O-乙酰高丝氨酸裂解酶，
aa)过表达的多核苷酸(pyc)，其编码丙酮酸羧化酶(Pyc)，优选与SEQ ID NO:64所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丙酮酸羧化酶，
bb)过表达的多核苷酸(serA)，其编码任选反馈抗性D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)，优选与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，
cc)过表达的多核苷酸(serB)，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)，优选与SEQ ID NO:68所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸丝氨酸磷酸酶，
dd)过表达的多核苷酸(serC)，其编码磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)，优选与SEQ ID NO:70所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的磷酸丝氨酸转氨酶，
ee)过表达的多核苷酸(ald)，其编码丙氨酸脱氢酶(Ald)，优选与SEQ ID NO:72所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的丙氨酸脱氢酶，
ff)过表达的多核苷酸(cysD)，其编码硫酸腺苷转移酶的亚基(CysD)，优选与SEQ IDNO:74所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的亚基，
gg)过表达的多核苷酸(cysH)，其编码腺苷磷硫酸还原酶(CysH)，优选与SEQ ID NO:76所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的腺苷磷硫酸还原酶，
hh)过表达的多核苷酸(cysI)，其编码亚硫酸还原酶(CysI)，优选与SEQ ID NO:78所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的亚硫酸还原酶，
ii)过表达的多核苷酸(cysJ)，其编码(CysJ)，优选与SEQ ID NO:80所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的，
jj)过表达的多核苷酸(cysN)，其编码硫酸腺苷转移酶的亚基(CysN)，优选与SEQ IDNO:82所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的亚基，
kk)过表达的多核苷酸(cysY)，其编码胱硫醚β-合酶(CysY)，优选与SEQ ID NO:84所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的胱硫醚β-合酶，
ll)过表达的多核苷酸(cysZ)，其编码推定的硫酸盐转运蛋白(CysZ)，优选与SEQ IDNO:86所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的硫酸盐转运蛋白，
mm)过表达的多核苷酸(metE)，其编码5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MetE)，优选与SEQ ID NO:88所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的蛋白质，
nn)过表达的多核苷酸(ptH1)，其编码肽基-tRNA水解酶1(PtH1)，优选与SEQ ID NO:90所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的肽基-tRNA水解酶1，
oo)过表达的多核苷酸(ptH2)，其编码肽基-tRNA水解酶2(PtH2)，优选与SEQ ID NO:92所示序列具有至少90、95或98％、优选100％序列相同性的肽基-tRNA水解酶2。
11.权利要求8-10任一项的重组微生物，特征在于所述微生物是棒状细菌，特别是棒杆菌(Corynebacterium)，优选谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)或腐殖质还原棒杆菌(C.humireducens)。
12.过量生产L-氨基酸的方法，特征在于所述方法中使用权利要求1-4任一项的甘氨酸裂解系统和/或权利要求5的至少一种多肽和/或权利要求6的至少一种多核苷酸和/或权利要求7的载体和/或权利要求8-11任一项的重组微生物。
13.前述权利要求的方法，特征在于过量生产的L-氨基酸选自L-丙氨酸，L-缬氨酸，谷氨酸家族的L-氨基酸，特别是L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸和L-精氨酸，及天冬氨酸家族的L-氨基酸，特别是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸和L-苏氨酸。
14.权利要求13的方法，特征在于过量生产的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
15.前述任何权利要求的方法，特征在于仅少量的甘氨酸作为副产物出现。
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